Mevcut protokol, yeni bir otonükleasyon bastırma mekanizmasına dayalı altın nanopartikül sentez tekniği kullanarak hücrelerdeki metallothionein etiketli proteinleri tespit etmek için klonlanabilir bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisini tanımlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İyi Korunmuş Ultrayapı ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerinin Doğrudan Sentezi
Bu makalede
Özet
Özet
Protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlüğe sahip hücrelerdeki hassas lokalizasyonunun analiz edilmesi, tüm canlı organizmalarda çeşitli fizyolojik veya patolojik süreçlerin incelenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, elektron mikroskobu probları olarak kullanılabilecek klonlanabilir etiketlerin geliştirilmesi, floresan proteinlerin optik görüntüleme alanında çok önemli bir rol oynadığı gibi, büyük bir değere sahiptir. Otonükleasyon bastırma mekanizması (ANSM) yakın zamanda ortaya çıkarıldı, bu da metallothionein (MT) ve antifriz proteini (AFP) gibi sistein bakımından zengin etiketler üzerinde altın nanopartiküllerinin (AuNP'ler) spesifik sentezine izin veriyor.
ANSM'ye dayanarak, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerdeki etiketlenmiş proteinlerin benzeri görülmemiş bir etiketleme verimliliği ile spesifik olarak algılanmasını sağlayan bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisi geliştirilmiştir. Bu çalışma, iyi korunmuş ultra yapıya sahip memeli hücrelerinde MTn (aldehit-reaktif kalıntıları olmayan mühendislik ürünü bir MT varyantı) füzyon proteinlerinin tespiti için bir protokol göstermektedir. Bu protokolde, yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame fiksasyonu, aldehit olmayan fiksatifler (tanik asit, uranil asetat gibi) kullanılarak, doğal ultrayapıyı korumak ve aldehit çapraz bağlanmasının neden olduğu etiket aktivitesinin zarar görmesini önlemek için gerçekleştirilmiştir.
ANSM tabanlı AuNP sentezinden önce basit bir tek adımlı rehidrasyon kullanılmıştır. Sonuçlar, etiketlenmiş proteinlerin endoplazmik retikulumun (ER) zarları ve lümeni de dahil olmak üzere çeşitli organelleri hedeflediğini ve mitokondriyal matrislerin yüksek verimlilik ve özgüllükle tespit edildiğini gösterdi. Bu araştırma, biyologlara hücresel ultrayapısal bağlamlarda tek molekül düzeyinde çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için sağlam bir protokol sunmaktadır.
Giriş
Postgenomik çağda, ışık mikroskobu için tek moleküllü bir muhabir olarak yeşil floresan proteinin (GFP) geliştirilmesi, modern yaşam bilimleri araştırma alanında devrim yaratmıştır 1,2. Onlarca yıldır, elektron mikroskobu (EM), nano ölçekli çözünürlük3 ile hücresel ultrayapıyı sezgisel olarak gözlemlemek için güçlü bir araç olmuştur; Bununla birlikte, protein moleküllerinin kesin olarak tanımlanması ve lokalizasyonu zor olmaya devam etmektedir.
En sık kullanılan EM etiketleme tekniği, antijen-antikor reaksiyonuna dayanan immünoelektron mikroskopi (IEM) etiket....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu deneyde kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Safir disklerde hücre kültürü
- 3 mm x 0.16 mm safir diskleri, 1 mL etanol içeren 2 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirin.
- Her safir diski, yüzeyde görünür birikintiler kalmayana kadar bir alkol lambası alevinde yakın.
NOT: Yukarıdaki yöntemle, safir diskler birçok kez geri dönüştürülebilir. - Solvente dayanıklı bir kalem kullanarak her safir diskin bir taraf....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ANSM tabanlı AuNP sentez tekniği, MT etiketli proteinleri TEM26 ile etiketlemek ve tespit etmek için son derece yararlı bir araçtır. Memeli hücrelerinde sağlamlığını doğrulamak için, Hela hücrelerinde EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn veya Mito-acGFP-MTn'yi ifade eden üç kararlı hücre hattı üretildi. KDEL, füzyon proteini EGFP-MTn-KDEL'i ER lümeni veya nükleer zarfın (NE) perinükleer boşluğu içinde tutan kanonik bir C-terminal endoplazmik retikulum (ER) retansiyon/geri alma sekansıdır. Ost4, oligosakka.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çalışma burada, hücresel ortamdaki protein moleküllerinin ultrayapısal çözünürlükle tek moleküllü görselleştirilmesi için sağlam bir klonlanabilir EM etiketleme teknolojisi sunmaktadır. Doğrudan genetik olarak kodlanmış sistein bakımından zengin etiketler üzerinde sentezlenen AuNP'ler, hedef proteinlerin açık ve kesin lokalizasyonunu sağlar. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurarak ikame tekniği, biyolojik numunelerin ultra yapısını mükemmel bir şekilde korur. Birlikte ele alındığında, burada sunulan klonlanabilir elektron.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Burada açıklanan protokol, Jiang et al. (2020) tarafından yayınlanan makaleden türetilmiştir. Bu çalışma, MOST'tan (973 Program no. 2011CB812502 ve 2014CB849902) gelen hibeler ve Pekin Belediye Hükümeti'nin finansman desteği ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0,025 mm / 0,275 mm Alüminyum taşıyıcı | Beijing Wulundes Biotech Ltd. veya M. Wohlwend | ||
| 0,2 M HEPES tamponu | HEPES'i (0,2 M) 980 mL ddH2O içinde çözün, ardından 10 mL 100 mL MgCl2 ve 10 mL 100 mM CaCl2 (nihai konsantrasyon 1 mM) ekleyin, sırasıyla, pH'ı 5,5 | ||
| 1,5 mL MaxyClear geçmeli mikrotüp | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polipropilen vidalı kapaklı mikrotüpler | Biologix | 81-0204 | |
| 200 gözenekli altıgen bakır ızgara | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-merkaptoetanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm hücre kültürü kapları | Corning | ||
| 50 mL polipropilen santrifüj tüpleri | Corning | 430928 | |
| Aseton | Beiijng Tong Guang İnce Kimyasallar Şirketi | 31025 | |
| Otomatik dondurma ikame makinesi | Leica | AFS2 | |
| Beijing Wulundes Biotech Ltd. | için özelleştirilmiş 3,05 mm x 0,66 mm numune tutucular | ||
| D-penisilamin | TCI | P0147 | |
| Dulbecco' s modifiye Eagle orta | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal sığır serumu | GBICO | 10099-141C | |
| Düz tabanlı gömme kapsül | Tedpella inc | ||
| Köpük cryobox | |||
| Formvar 15/95 reçine | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF makinesi | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Metan | Beiijng Tong Guang İnce Kimyasallar Şirketi | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 19110 | |
| PBS-A tamponu | NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) 1 L ddH2O, pH 7.4'e ayarlayın | ||
| Kalitatif filtre kağıdı (orta hız) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Safir diskler | Beijing Wulundes Biotech Ltd. veya M. Wohlwend | ||
| Solvente dayanıklı kalem | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 reçine | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmisyon elektronu mikroskopi | FEI | Tecnai G2 ruhu | |
| Tripsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Cımbız | Dumont | ||
| Ultramiktotom | Leica | FC7 | |
| Uranil asetat | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 22400 |
Kaynaklar
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
