Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farede Periprostetik Eklem Candida albicans Enfeksiyon Modeli

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65263

⸱

2 Şubat 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Bu makalede

Özet

Tehlikeli patojenlerin neden olduğu periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE) klinik ortopedide yaygındır. Mevcut hayvan modelleri, PJI'nin gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez. Burada, PJI için yeni terapötikler araştırmak ve geliştirmek için Candida albicans biyofilm ile ilişkili bir PJI fare modeli kurduk.

Özet

Periprostetik eklem enfeksiyonu (PEE), cerrahları ve bilim adamlarını giderek daha fazla ilgilendiren Candida albicans'ın (C. albicans) neden olduğu yaygın enfeksiyonlardan biridir. Genel olarak, enfeksiyon bölgesinde C. albicans'ı antibiyotiklerden ve immün klirenstan koruyabilen biyofilmler oluşur. Enfekte implantın çıkarılması, debridman, antimikrobiyal tedavi ve reimplantasyonu içeren cerrahi, PEE tedavisinde altın standarttır. Bu nedenle, hayvan PJI modellerinin oluşturulması, PJI için yeni ilaçların veya terapötiklerin araştırılması ve geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, ortopedi kliniklerinde yaygın olarak kullanılan bir implant olan pürüzsüz bir nikel-titanyum alaşımlı tel, C. albicans tel boyunca eklem boşluğuna aşılanmadan önce bir C57BL/6 faresinin femoral eklemine yerleştirildi. 14 gün sonra, taramalı elektronik mikroskop (SEM) altında implantların yüzeyinde olgun ve kalın biyofilmler gözlendi. Enfekte eklem örneklerinin H&E boyamasında önemli ölçüde azalmış bir kemik trabekülü bulundu. Özetlemek gerekirse, kolay kullanım, yüksek başarı oranı, yüksek tekrarlanabilirlik ve yüksek klinik korelasyon avantajlarına sahip bir fare PEE modeli oluşturulmuştur. Bunun, C. albicans biyofilm ile ilişkili PEE önlemenin klinik çalışmaları için önemli bir model olması beklenmektedir.

Giriş

Candida albicans (C. albicans) insan vücudunun birçok yerinde yaygın olarak bulunur1, bu aynı zamanda özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda hayatı tehdit eden invaziv mantar enfeksiyonlarına neden olan en yaygın fırsatçı patojendir 2,3. C. albicans, polimorfik bir mantar olarak maya ve miselyum durumları arasında dönüşebilir. Miselyum durumu daha yüksek virülans, daha güçlü yapışma ve hücre ve dokuların istilasısergiler 4,5. Ayrıca C. albicans, takma dişler, kateterler ve stentler gibi biyomedikal malzemelerin yüzeylerinde biyofilm oluşturabilir 1,6,7. Biyofilmlerin yoğun üç boyutlu yapısı, antifungal ilaçların infiltrasyonunu kısıtlar, ilaca dirençli genleri eksprese eder ve bağışıklık sistemi klerensine direnmek için mantar hücrelerinin metabolizmasını aşağı regüle eder 6,7. Bu nedenle biyofilmlere bağlı enfeksiyonlar kliniklerde oldukça zorlayıcıdır8.

Staphylococcus aureus, koagülaz negatif stafilokok ve enterobakter PEE9'a neden olan başlıca patojenlerdir. Fungal PEE insidansı nispeten düşük (yaklaşık% 1) olmasına rağmen10, fungal PEE'nin tedavi maliyeti daha yüksektir11, tedavi döngüsü daha uzundur11 ve tedavi başarı oranı bakteriyel PEE'den daha düşüktür10. Son yıllarda fungal PEE görülme sıklığı her geçen yıl artmaktadır10. Candida PJI, mantar PJI10,12'nin %77-84'ünü oluşturur ve C. albicans Candida'da en yaygın olanıdır (%54). Bu nedenle, mantar PJI'nin incelenmesi gerekir.

Şu anda PEE, (1) enfekte implantın çıkarılması, (2) debridman, (3) antimikrobiyal tedavi ve (4) reimplantasyon ile revizyon cerrahisi ile tedavi edilmektedir. Kapsamlı bir debridmandan sonra, kemik çimentosu içeren bir antibiyotik yerleştirilir ve yeni bir implant yerleştirilmeden önce enfeksiyonu etkili bir şekilde kontrol etmek için hasta 6 haftadan fazla bir süre boyunca sistemik olarak antibiyotiklerle tedavi edilir13. Bununla birlikte, bu yöntem dokulardaki patojenleri tamamen ortadan kaldıramaz ve ilaca dirençli suşlarda uzun süreli antimikrobiyal tedavi ile tedavi edilen tekrarlayan enfeksiyonların gelişme olasılığı yüksektir 14,15,16.

PJI'nin hayvan modellerinin oluşturulması, PJI için yeni ilaçların veya terapötiklerin araştırılması ve geliştirilmesi için önemlidir. PEE gelişiminde, protez çevresinde geniş ölü boşluklar oluşur, bu da çevre dokuların kanlanmasını daha da engelleyen ve antibiyotiklerin etkisini bozan hematomların oluşumuna yol açar11,15. Protezin çevresindeki ortamı taklit etmenin zorluğu nedeniyle, geleneksel hayvan modelleri PJI17,18'in gerçek durumunu doğru bir şekilde simüle edemez.

Bu yazıda, eklem implantlarını simüle etmek için klinik olarak yaygın olarak kullanılan bir titanyum-nikel tel kullanılarak farelerde bir C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modelioluşturulmuştur 19,20. Bu PJI modeli, kolay kullanım, yüksek başarı oranı, yüksek tekrarlanabilirlik ve yüksek klinik korelasyon avantajlarını sergiler. C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI'nin önlenmesi ve tedavisinin incelenmesi için önemli bir model olması beklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlar Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nden satın alındı. Tüm hayvan deneyi prosedürleri, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Fareler, kafes başına 5 fare ile bir hafta boyunca tutuldu. Yiyecek ve suya ücretsiz erişimlerine izin verildi. Hayvanlar, çalışma yapılmadan önce oda sıcaklığında (RT; 24 °C ± 1 °C) ve aydınlık/karanlık döngüsünde (12 saat/12 saat) tutuldu.

1. Tampon ve ekipman hazırlığı

  1. C. albicans hücre kültürü
    1. Bir monoklonal C . albicans kolonisini (SC5314) bir maya özütü pepton dekstroz (YPD) plaka ortamından bir aşılama halkası ile 5 mL YPD sıvı ortamına (YPD + 50 μg / mL karbenisilin) aşılayın.
    2. C. albicans hücrelerini daha sonra gece boyunca 30 ° C'de 220 rpm hızında çalkalayın.
    3. Süspansiyonu RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. C. albicans hücrelerini normal salin içinde yeniden süspanse edin ve bulanıklığı 0.5 McFarland ile aynı olacak şekilde görsel olarak ayarlayarak hücre konsantrasyonunu 1 x 106 hücre / mL'ye seyreltin.
  2. Normal salin hazırlanması
    1. 0.9 g sodyum klorürü tartın ve% 0.9 normal salin hazırlamak için 100 mL deiyonize suda çözün.
  3. Cerrahi aletlerin hazırlanması
    1. Kullanmadan önce cerrahi aletler (makas, forseps, hemostatik forseps, iğne tutucular, dikiş iğneleri) ve titanyum-nikel alaşımlı tel (yaklaşık 0,5 mm çapında) otoklavlayın (121 °C, 30 dk).

2. Fare PJI modelinin kurulması

  1. 30 C57BL / 6 fareyi (erkek, 15-20 g) rastgele 3 gruba (10 fare / grup), yani kontrol grubu, boş implant grubu ( C. albicans enfeksiyonu olmadan titanyum-nikel tel implantasyonu) ve PJI grubu ( C. albicans enfeksiyonu ile titanyum-nikel tel implantasyonu).
  2. Sol arka bacaktaki kılları çıkarmadan ve iyotla dezenfekte etmeden önce% 1-4 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Doğrultma refleksinin kaybı ve ayak parmağı uyarımına yanıt verilmemesi anestezinin derinliğini doğrular. Anestezi yaparken, kornea kuruluğunu önlemek ve ameliyat ve iyileşme sırasında ısıyı yenilemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
  3. Kontrol grubundaki fareler için herhangi bir tedavi sağlamayınız. Suya ve yiyeceğe ücretsiz erişim sağlayın.
  4. Boş implant grubundaki ve PJI grubundaki fareler için, eklemleri ortaya çıkarmak için #10 bıçak veya steril bir tıraş bıçağı ile her bir sol arka ayağın dizinde 5 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
  5. Steril bir şırınga (26 G) iğnesi sokarak femoral intramedüller kanalda 5 mm uzunluğunda bir delik açın.
  6. Makasla kesmeden önce deliğe pürüzsüz bir nikel-titanyum alaşımlı tel (0.5 mm çapında, 5 mm uzunluğunda) yerleştirin (Şekil 1).
  7. Boş implant grubundaki fareler için, naylon bir sütür (0,15 mm çapında) kullanarak yarayı katman katman kapatmadan önce nikel-titanyum alaşımlı tel boyunca damla damla 2 μL YPD ortamı ekleyin.
  8. PJI grubundaki fareler için, 2 μL C. albicans hücrelerini (1 × 106 hücre / mL) nikel-titanyum alaşımlı tel boyunca farelerin eklem boşluğuna damla damla aşılayın ve ardından yarayı bir naylon sütür kullanarak katman katman kapatın.
  9. Fareleri 14 gün boyunca suya ve yiyeceğe ücretsiz erişimi olan bir yerde barındırın. Meloksikamı 3 güne kadar her 24 saatte bir deri altı enjeksiyonla (4 mg / kg) uygulayın.
  10. 14 gün sonra, farelere servikal çıkık ile ötenazi yapmadan önce fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun.

3. PJI modeli değerlendirmesi

  1. Majör organlardaki enfeksiyonların değerlendirilmesi
    1. Ötenazi yaptıktan sonra farelerden böbrekleri, karaciğeri ve dalağı toplayın.
    2. Her organa 500 μL steril normal salin ekleyin ve dokuları 4 °C'de bir homojenizatörde öğütün.
    3. Adım 3.1.2'de hazırlanan homojenatı 100 μL'lik bir YPD plakasına ekleyin ve ardından bükülmüş bir çubukla eşit şekilde yayın.
    4. YPD plakalarını 48 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre ters çevirerek yerleştirin.
    5. Koloni sayısını görsel olarak gözlemleyin ve sayın.
  2. İmplantlarda C. albicans ve biyofilmlerin gözlenmesi
    1. İmplantı cımbızla toplamadan önce cildi farelerin eklemi üzerinde makasla dikkatlice kesin.
    2. İmplantları 48 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 2,5'lik bir glutaraldehit çözeltisine daldırın.
    3. İmplantları 3 saat boyunca% 1 osmiyum asit çözeltisine daldırmadan önce steril PBS ile üç kez durulayın.
    4. İmplantları dehidrasyon için 15 dakika boyunca %50, %70, %80, %90 ve %100 etanol solüsyonlarına daldırmadan önce steril PBS ile üç kez durulayın.
    5. İmplantları dondurarak kurutmadan önce implantları üç kez 30 dakika boyunca tert-bütanol içine daldırın.
    6. İmplant örneklerini numune aşamasına sabitleyin, implantı altınla (10 nm kaplama) püskürtün ve yüksek vakum ve 1,5 kV altında taramalı elektronik mikroskop (SEM) altında gözlemleyin.
  3. Femur dokularının patolojik analizi
    1. Farelere ötenazi yaptıktan sonra femur dokularını makasla toplayın.
    2. Femur dokularını 48 saat boyunca 4 ° C'de fiksasyon için% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
    3. Femur dokularını 1 hafta boyunca% 10 formalin içine yerleştirin.
    4. Femur dokularını sırasıyla %50, %70, %80, %90 ve %100 etanol solüsyonlarına 15 dakika daldırarak kurutun.
    5. Susuz kalmış femur dokularını, dokuları bir mikrotom kullanarak 4 μm numunelere ayırmadan önce parafine gömün.
    6. Patolojik analizden önce standart bir protokol izleyerek femur bölümlerini hematoksilen ve eozin ile boyayın21.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Örneklerin bir plaka ortamına aktarılması ve gece boyunca inkübasyondan sonra kolonilerin sayılması, lezyonun yakınındaki lokal patojen yükünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır 22,23. Çalışmamızda, karaciğer, böbrek ve dalak örneklerinin mikrobiyal kültürü negatifti, bu da bu çalışmadaki modelin farelerde sistemik enfeksiyon yerine sadece lokal enfeksiyona yol açtığını gösteriyor23.

İmplantların SEM g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ameliyat sırasında cerrahi aletlerin veya cerrahi ortamın kontaminasyonundan kaynaklanan enfeksiyon, çoğu implant enfeksiyonunun ana nedenidir 24,25,26,27. Bu nedenle, bu çalışmada bir fare C. albicans biyofilm ile ilişkili PJI modeli oluşturulmuştur. İmplant olarak salin içinde süspanse edilmiş steril paslanmaz çelik partiküllerin kullanıldığı geleneksel PEE modeliyle karşılaştırıldığ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu yazıda bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Shaanxi Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numarası 2021SF-118) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (hibe numaraları 81973409, 82204631) gelen mali destek için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 & derece; C buzdolabıElectrolux (Çin) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Analitik terazilerShimadzuATX124
Otoklav SterilizatörüSANYOMLS-3750
KarbenisilinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon dik optik mikroskop NikonEclipse Ts2-FL
GlikozMacklin 
Aşılama halkasıThermo Scientific251586
IsofluranRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe İlaç Co, Ltd20180108
ParaformaldehitBeyotime BiyoteknolojiP0099
PeptonePekin Aoboxing Biyo-teknoloji Co, Ltd01-001
RWD R550 çok kanallı küçük hayvan anestezi makinesi RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Sıcaklık inkübatörüShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Ultra saf su jeneratörüHeal ForceNW20VF
Ultrason makinesiDo-ChromDS10260D
Maya özüThermo Scientific  OksoitLP0021B
D823520

Kaynaklar

  1. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  2. Fan, F., et al. Candida albicans biofilms: antifungal resistance, immune evasion, and emerging therapeutic strategies. International Journal of Antimicrobial Agents. 60 (5-6), 106673(2022).
  3. Tong, Y., Tang, J. Candida albicans infection and intestinal immunity. Microbiological Research. 198, 27-35 (2017).
  4. Kanaguchi, N., et al. Effects of salivary protein flow and indigenous microorganisms on initial colonization of Candida albicans in an in vivo model. Bmc Oral Health. 12, 36(2012).
  5. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  6. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  7. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  8. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. The International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  9. Miller, R., et al. Periprosthetic joint infection: A review of antibiotic treatment. JBJS Reviews. 8 (7), e1900224(2020).
  10. Brown, T. S., et al. Periprosthetic joint infection with fungal pathogens. The Journal of Arthroplasty. 33 (8), 2605-2612 (2018).
  11. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  12. Schoof, B., et al. Fungal periprosthetic joint infection of the hip: a systematic review. Orthopedic Reviews (Pavia). 7 (1), 5748(2015).
  13. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  14. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  15. Stocks, G., Janssen, H. F. Infection in patients after implantation of an orthopedic device. ASAIO Journal. 46 (6), S41-S46 (2000).
  16. Shahi, A., Tan, T. L., Chen, A. F., Maltenfort, M. G., Parvizi, J. In-hospital mortality in patients with periprosthetic joint infection. The Journal of Arthroplasty. 32 (3), 948-952 (2017).
  17. Carli, A. V., Ross, F. P., Bhimani, S. J., Nodzo, S. R., Bostrom, M. P. Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 98 (19), 1666-1676 (2016).
  18. Stavrakis, A. I., Niska, J. A., Loftin, A. H., Billi, F., Bernthal, N. M. Understanding infection: A primer on animal models of periprosthetic joint infection. The Scientific World Journal. 2013, 925906(2013).
  19. Qiao, B., Lv, T. Electrochemical investigation of interaction of candida albicans with titanium-nickel implant in human saliva. International Journal of Electrochemical Science. 17 (2), 22028(2022).
  20. Oh, Y. R., Ku, H. M., Kim, D., Shin, S. J., Jung, I. Y. Efficacy of a Nickel-titanium ultrasonic instrument for biofilm removal in a simulated complex root canal. Materials. 13 (21), 4914(2020).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining. Histopathology: Methods and Protocols. Christina E, D. ay , Springer, New York. 31-43 (2014).
  22. Sinclair, K. D., et al. Model development for determining the efficacy of a combination coating for the prevention of perioperative device related infections: A pilot study. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (7), 1143-1153 (2013).
  23. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels, on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  24. Zahar, A., Sarungi, M. Diagnosis and management of the infected total knee replacement: a practical surgical guide. Journal of Experimental Orthopaedics. 8 (1), 14(2021).
  25. Parvizi, J., Jacovides, C., Zmistowski, B., Jung, K. A. Definition of periprosthetic joint infection: Is there a consensus. Clinical Orthopaedics and Related Research. 469 (11), 3022-3030 (2011).
  26. Karczewski, D., et al. Candida periprosthetic joint infections - risk factors and outcome between albicans and non-albicans strains. International Orthopaedics. 46 (3), 449-456 (2022).
  27. Cobo, F., Rodriguez-Granger, J., Sampedro, A., Aliaga-Martinez, L., Navarro-Mari, J. M. Candida prosthetic joint infection. A review of treatment methods. Journal of Bone and Joint Infection. 2 (2), 114-121 (2017).
  28. Cobrado, L., Silva-Dias, A., Azevedo, M. M., Pina-Vaz, C., Rodrigues, A. G. In vivo antibiofilm effect of cerium, chitosan and hamamelitannin against usual agents of catheter-related bloodstream infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68 (1), 126-130 (2013).
  29. Vila, T., et al. Therapeutic implications of C. albicans-S. aureus mixed biofilm in a murine subcutaneous catheter model of polymicrobial infection. Virulence. 12 (1), 835-851 (2021).
  30. Nishitani, K., et al. Quantifying the natural history of biofilm formation in vivo during the establishment of chronic implant-associated Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice to identify critical pathogen and host factors. Journal of Orthopaedic Research. 33 (9), 1311-1319 (2015).
  31. Ormsby, R. T., et al. Evidence for osteocyte-media ted bone-matrix degradation associated with periprosthetic joint infection (PJI). European Cells & Materials. 42, 264-280 (2021).
  32. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).
  33. Harro, J. M., et al. Development of a novel and rapid antibody-based diagnostic for chronic staphylococcus aureus infections based on biofilm antigens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), e01414-e01419 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Periprostetik Eklem EnfeksiyonuFare PJI ModeliBiyofilm OluşumuNikel Titanyum İmplantHayvan Enfeksiyon ModeliEklem İmplant EnfeksiyonuAntimikrobiyal TedaviTaramalı Elektron MikroskobuKemik Trabekula Kaybı
Farede Periprostetik Eklem Candida albicans Enfeksiyon Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.