Bu protokol, preadipositleri elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu sağlamak için stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan yarı otomatik izolasyonunu tanımlar. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanmak deneysel varyasyonu azaltır ve tekrarlanabilirliği arttırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Beyaz, kahverengi ve bej adiposit farklılaşmasının in vitro çalışması, adipositlerin hücre-otonom fonksiyonlarının ve mekanizmalarının araştırılmasını sağlar. Ölümsüzleştirilmiş beyaz preadiposit hücre hatları halka açıktır ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dış ipuçlarına yanıt olarak beyaz yağ dokusunda bej adipositlerin ortaya çıkmasının, halka açık beyaz adiposit hücre hatlarını kullanarak tam olarak özetlenmesi zordur. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) murin yağ dokusundan izolasyonu genellikle primer preadipositleri elde etmek ve adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için uygulanır. Bununla birlikte, yağ dokusunun elle kıyılması ve kollajenaz sindirimi deneysel varyasyonlara neden olabilir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, deneysel çeşitliliği azaltmak, kontaminasyonu azaltmak ve tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla SVF'nin daha kolay izolasyonunu sağlamak için kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısı kullanan modifiye yarı otomatik bir protokol sunuyoruz. Elde edilen preadipositler ve farklılaşmış adipositler fonksiyonel ve mekanik analizler için kullanılabilir.
Giriş
Yağ dokusu biyolojisi, obezite ve tip 2 diyabet prevalansının küresel olarak artması nedeniyle giderek artan bir ilgi çekmektedir1. Adipositler, fazla enerjiyi, açlıktan sonra salınan lipit damlacıkları şeklinde depolar. Ayrıca, yağ dokusu endokrin bir organ görevi görerek ve diğer dokularla iletişim kurarak sistemik enerji homeostazını korur 2,3. İlginçtir ki, hem aşırı yağ dokusu (obezite) hem de yağ kaybı (lipodistrofi) insülin direnci ve diyabet1 ile bağlantılıdır. Adipositler üç türe ayrılır: beyaz, kahverengi ve bej1. Beyaz adipositl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri, Tokyo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Tokyo Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir.
1. Enzim çözeltisinin ve ortamının hazırlanması
- Kasık beyaz yağ dokusunun her iki tarafını (sağ ve sol taraf, yaklaşık 150 mg) 7-8 haftalık bir fareden ve 2.5 mL enzim çözeltisini dissosiyatörün tüp C'sine koyun.
- Fetal sığır serumu (FBS) veya antibiyotik olmadan 3 mL Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM)/F12 ile D enzimini, FBS veya antibiyotik olmadan 2,7 mL DMEM/F12 ile Enzim R'yi ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, adiposit farklılaşmasını indükledikten 7 gün sonra tamamen farklılaşmış, lipid yüklü adipositler verir. Adiposit farklılaşma derecesi, trigliseritlerin ve lipitlerin yağ kırmızısı o boyaması (Şekil 1A) veya adipogenez Pparg'ın ana düzenleyicisi ve hedef Fabp4 gibi adiposit genlerinin qPCR-RT'si kullanılarak mRNA ekspresyon analizi ile değerlendirilebilir (Şekil 1B). İn vitro bej adiposit farklılaşmasını indüklemek için, ro.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, preadipositler elde etmek ve in vitro adiposit diferansiyasyonunu gerçekleştirmek için SVF'nin murin yağ dokusundan izole edilmesi için bir protokol tanımlandı. Kollajenaz sindirimi için bir doku ayrıştırıcısının kullanılması, deneysel çeşitliliği azalttı, kontaminasyon riskini azalttı ve tekrarlanabilirliği arttırdı. Bu prosedür sunulan protokol içinde kritik bir adım olsa da, süreç son derece otomatiktir ve optimizasyona gerek yoktur. Bununla birlikte, fare yaşına ve yağ dokusu deposuna bağlı olarak, k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların hiçbirinin bu eserle ilgili rakip bir finansal çıkarı yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, deneysel yardımları için Takahito Wada ve Saiko Yoshida'ya (Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya) teşekkür eder. Bu çalışma YH'ye aşağıdaki hibelerle finanse edilmiştir: Tokyo Üniversitesi Mükemmel Genç Araştırmacı Programı'ndan araştırma hibesi; Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) KAKENHI Erken Kariyer Bilim İnsanları için Yardım Hibesi, hibe numarası 19K17976; Japonya Uygulamalı Enzimoloji Vakfı'ndan Gelecekteki Diyabet Araştırmalarının Ön Koşucusu (FFDR) için hibe, hibe numarası 17F005; Farmakolojik Araştırma Vakfı'ndan hibe; Mochida Memorial Tıbbi ve Farmasötik Araştırma Vakfı'ndan hibe; MSD Yaşam Bilimleri Vakfı'ndan hibe; Daiwa Menkul Kıymetler Sağl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 100 mm çanak | Corning | 430167 | |
| 12 kuyulu plaka | Corning | 3513 | |
| 60 mm çanak | IWAKI | 3010-060 | |
| Yağ Dokusu Ayrışma Kiti, fare ve sıçan | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | içindekiler: Enzim D, Enzim R, Enzim A ve Tampon A |
| Hücre süzgeci 70 &mikro; m | BD falcon | #352350 | |
| Kollajen kaplı tabaklar, 100 mm | BD# | 356450 | |
| Kollajen kaplı tabaklar, 60 mm | BD# | 354401 | |
| Kollajen I Kaplama Mikroplaka 6 kuyulu | IWAKI | 4810-010 | |
| Deksametazon | Wako | 041-18861 | |
| Diseksiyon Forseps | N/A | N/A Kullanmadan | önce otoklav |
| Diseksiyon Makası, kullanmadan önce künt/keskin | N/A | N/A | otoklav |
| Diseksiyon Makası, kullanmadan önce keskin/keskin | N/A | N/A | otoklav |
| DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesi | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tüpleri | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Isıtıcılı Ayrıştırıcı | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Enjeksiyonu U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| İndometasin | Sigma | I7378-5G | |
| İzobutilksantin (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofektamin 2000 | Yaşam Teknolojileri | 11668-019 | |
| Neomisin Sülfat | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Canlandırıcı | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Gen | # 1780 | |
| PBS tabletleri | Takara | T900 | |
| Platin-E (Plat-E) Retroviral Paketleme Hücre Hattı | hücre biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Uygulamalı Biyosistemler | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Karışımı | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazon | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Tripsin-EDTA (%0.05) | Gibco | 25200-056 |
Kaynaklar
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
