Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

8.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65272

⸱

18 Ağustos 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

Özet

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.

Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.

Giriş

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) ilk olarak Brinkmann ve ark. 2004yılında apoptoz ve nekrozdan farklı bir hücresel ölüm yolu olarak 1. Bu yolda, nötrofiller, daha önce granüllerde veya sitozolde depolanan antimikrobiyal proteinlerle kaplı büyük ağ benzeri yapılar oluşturmak için yoğunlaştırılmış kromatinlerini hücre dışı boşluğa bırakırlar. Bu antimikrobiyal proteinler, NET'lerin dolaylı immünofloresan tespiti için yaygın olarak kullanılan nötrofil elastaz (NE), miyeloperoksidaz (MPO) ve sitrüline histon H3'ü (H3cit) içerir2. Bu yöntem sadece bu proteinlerin kantitatif varlığını tanımlamakla kalmaz; gerçekten de, NET benzeri yapıları özel olarak tespit etme avantajına sahiptir. NET'lerde, söz konusu proteinler, her bir boyanmış proteinin ve hücre dışı DNA'nın floresan sinyallerinin üst üste binmesiyle tespit edilebilen hücre dışı DNA ile birlikte lokalize olur. NET'lerde hücre dışı DNA ve protein kolokalizasyonuna bağlı örtüşen sinyallerin aksine, sağlam nötrofiller kolokalizasyon göstermez. Burada, NET bileşenleri genellikle granüllerde, çekirdeklerde ve sitozol3'te ayrı olarak depolanır.

İlk keşflerinden bu yana, NET'lerin başta inflamasyon olmak üzere birçok hastalıkta merkezi bir rol oynadığı gösterilmiştir. NET'ler, kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayıp öldürerek enfeksiyon sırasında antimikrobiyal işlevler gösterir 4,5. Bununla birlikte, NET'ler sistemik lupus eritematozus, romatizmal artrit ve alerjik astım gibi otoimmün hastalıklar ve hiperinflamatuar yanıtlarla da bağlantılıdır 6,7,8. NET'ler aterosklerozda, trombosit yapışmasında vazo-oklüzyon ve inflamasyonu teşvik eder ve metastatik kanserde rol oynadığı tahmin edilmektedir 9,10,11. Bununla birlikte, proinflamatuar sitokin düzeylerini azaltarak anti-inflamatuar özelliklere sahip oldukları düşünülmektedir12. NET'ler daha geniş bir araştırma alanına daha fazla ilgi gösterse de, gelecekteki araştırmalar için sağlam bir NET algılama yöntemi esastır.

İmmünofloresan görüntüleme kullanılarak farklı dokulardaki NET'lerin görüntülenmesi karmaşık ve özelleştirme gerektirse de, elektron mikroskobu dışında, şu anda NET'ler ve hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için en bilinen yöntemlerden biridir ve ağırlıklı olarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda (FFPE) kullanılmaktadır13,14. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar kendi özelleştirilmiş protokollerini kullandığından, NET görüntülemeyi karşılaştırmak zordur. Bu protokoller antikor, antijen alımı veya geçirgenlik yöntemi kullanımlarında farklılık gösterir ve genellikle belirli bir doku tipi için optimize edilmiştir 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Brinkmann ve ark. FFPE dokusunda NET'lerin immünofloresan görselleştirmesini kullanan ilk metodik çalışmayı yayınladıktan sonra, bu protokolü daha geniş bir doku ve tür çeşitliliği için optimize etmek istedik15. Ek olarak, geniş çapta uygulanabilir bir immünofloresan protokolü oluşturmak için, NET'leri tespit etmek için FFPE dokusunda immünofloresan yöntemlerini kullanan çalışmalardan farklı modifiye protokolleri test ettik 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Ayrıca, daha spesifik hücre dışı boyama için yeni bir H3cit antikoru denedik28. Mevcut boyama protokollerini farklı türlere ve dokulara sistematik olarak uyarlayarak, in vitro görüntülemenin geliştirilebileceğini ve bunun sonucunda nötrofiller ve NET'ler arasındaki etkileşimin hem lokal hem de sistemik olarak daha iyi temsil edilebileceğini varsayıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Hamburg Eyalet Hayvan Araştırmaları İdaresi, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Almanya (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16) tarafından onaylanan deneylerden elde edilen fare dokularını içermektedir. Kullanılan dokular septik bir modelden fare akciğeri ve kolon ve yanmış deriydi. 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullandık. Tüm deneyler için bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uyulmuştur. Anonimleştirilmiş insan örnekleri, yenidoğan enterokolit, yanmış cilt, biliyer atrezi, spondilodiskit ve miyokard dokularını içeriyordu. Hamburg Tıbbi Araştırma Etik Kurulu'na göre, numunelerin bilgilendirilmiş onam almasına gerek yoktu, ancak çalışma komite tarafından onaylandı (WF-026/21).

1. Örnek fiksasyon

  1. Numune fiksasyonu, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve montaj için Abu Abed ve Brinkmann'dan türetilen aşağıdaki protokolü kullanın 3,15.
    1. 40 g paraformaldehiti (PFA) 800 mL Tris tamponlu salin, pH 7.4 (TBS) içinde çözerek% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın.
    2. Karışımı 60 °C'de çeker ocak altında PFA eriyene kadar karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) getirin ve TBS ile ses seviyesini 1.000 mL'ye ayarlayın.
    3. PH'ı 7.4'e ayarlayın. 4 °C'de 2-3 hafta veya -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  2. Numune fiksasyonu için, taze dokuyu TBS tamponuna yerleştirin ve 20 mm x 30 mm x 3 mm'den daha küçük parçalara ayırın. Doku bölümlerini 12-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
    NOT: Orijinal protokol %2'lik bir PFA çözeltisi ve 8-20 saatlik bir sabitleme süresi kullandı. Bu yöntemle bazı doku kesitleri 20 saat sonra tam olarak fikse edilmediği için PFA konsantrasyonu %4 PFA'ya çıkarıldı.
  3. Numuneleri etiketli doku işleme kasetlerine aktarın. Etiketleme için solvente dayanıklı işaretleyiciler veya kurşun kalemler kullanın.
  4. Kasetleri 1 saat boyunca %70 etanole batırarak numune dehidrasyonunu başlatın. Ardından, her adım 1 saat sürecek şekilde %80 etanol, %90 etanol, %96 etanol ve iki kez %100 etanole daldırın.
  5. Her seferinde 1 saat boyunca iki kez %100 ksilene (dimetilbenzen) ve ardından iki kez 60 °C parafine daldırın.
  6. Montaj için gömme kalıpları kullanın ve kalıbı çıkarmadan önce parafinin katılaşmasına izin verin.
  7. 3 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın.
  8. Kesilen bölümleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirmek için cımbız kullanın ve doku kesiklerini germek için yüzeyde yüzmelerine izin verin.
  9. Bölümleri yapışkan cam slaytlara (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve gece boyunca 40 °C'lik bir ısı odasında kurumaya bırakın.

2. Örnek rehidrasyon

  1. Deparafinizasyon için, slaytları bir slayt rafına istifleyin ve her biri 5 dakika boyunca ksilen ikame ortamı limonene (Malzeme Tablosu) iki kez ve bir kez 5: 1 limonen / etanol karışımına 1 dakika daldırın.
    DİKKAT: Limonen 50 °C'de yanıcıdır ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Göz koruması ve eldivenli bir çeker ocak altında kullanın. Açık ateşten uzak tutun.
  2. Kayar rafı iki kez %100 etanole ve bir kez %96 etanole, %90 etanole, %80 etanole ve %70 etanole her biri 5 dakika daldırarak numuneleri azalan bir etanol serisinde yeniden sulandırın.
  3. Kalan etanolü temizlemek için sürgülü rafı 5 dakika boyunca deiyonize suya (DI su) daldırın.

3. Otofloresan bloke etme ve antijen alımı

  1. Veri sayfasına göre pH 6 sitrat hedef alma çözeltisini (TRS) (Malzeme Tablosu) hazırlayın. Bu TRS 10 kez konsantre edilmiştir. Bu nedenle 1:10 oranında DI su ile seyreltin. Plastik bir boyama kavanozunda 96 °C'ye ısıtın.
    NOT: TRS, antijen epitoplarını açığa çıkarmak için numune fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırar. Bu, birincil antikorların hedef antijenlerine bağlanmasına izin verir. Konsantre TRS'yi 2-8 °C'de 8 ay saklayın. Her zaman taze TRS hazırlayın.
  2. Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve ıslak bir odaya yerleştirin. Her numuneye bir ila iki damla otofloresan azaltıcı madde (Malzeme Tablosu) pipetleyin. 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Otofloresan azaltıcı ajan, endojen floroforlar ve fiksatiflerin neden olduğu doğal doku otofloresansını bloke eder. Otofloresan azaltıcı ajanı RT'de 1 yıla kadar saklayın.
    NOT: Numunelerin kurumasını veya inkübasyon süresini aşmasını önlemek için yalnızca küçük doku bölümleriyle çalışın.
  3. Slaytları tekrar sürgü rafına istifleyin ve kullanılmayan tüm otofloresan azaltıcı reaktif yıkanana kadar yukarı ve aşağı hareketlerle %60 etanol içinde 1 dakika durulayın.
  4. Sürgülü rafı 5 dakika boyunca DI suya daldırın.
  5. Antijen alımı için, slaytları önceden ısıtılmış TRS ile bir boyama kavanozuna aktarın. Bir su banyosunda 96 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: TRS 96 °C'ye önceden ısıtılırsa ve 96 °C'de 10 dakikalık inkübasyon süresi sağlanırsa, 96 °C'lik su banyosu bir mikrodalga fırın veya buharlı pişirici ile ikame edilebilir.
  6. Boyama kavanozunu çıkarın ve yaklaşık 60-90 dakika RT'ye kadar yavaşça soğumaya bırakın.
    NOT: Protokol burada 4 saate kadar duraklatılabilir ve slaytlar TRS'de bırakılabilir.
  7. TRS'yi çıkarın, ancak slaytları kavanozda saklayın. Kalan TRS kalıntılarını yıkamak için her biri 3 dakika boyunca %0.05 Tween (TBST, pH 7.4) içeren Tris tamponlu salin ile iki kez durulayın.
  8. Geçirgenlik için, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde% 0.2 Triton hazırlayın ve numuneleri 10 dakika geçirgenleştirmek için boyama kavanozuna doldurun.
    NOT: Permeabilizasyon, primer antikorların sabit numunelerdeki hücre içi hedef proteinlere bağlanmasını arttırır.
  9. Slaytları her seferinde 3 dakika boyunca TBST'de iki kez tekrar durulayın.
  10. Islak hazneyi hazırlayın ve slaytları yerleştirin. Slaytlardaki fazla suyu kağıt mendillerle silin. Antikor çözeltisinin akmasını önlemek için her numuneyi hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın.
    NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. Küçük bölümlerle çalışmak en iyisidir.

4. Spesifik olmayan antikor bağlanmasının engellenmesi

  1. Eşek serumu (Malzeme Tablosu) ile kullanıma hazır engelleme solüsyonu alın ve her numuneye bir damla pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu bloke edici adım, ikincil antikorun numune üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerine bağlanmasını en aza indirir. Bu spesifik olmayan epitopları bloke ettikten ve birincil antikoru uyguladıktan sonra, ikincil antikor birincil antikora bağlanacak ve dokunun yüzeyi ile etkileşime girmeyecektir. Bu kullanıma hazır bloke edici reaktif, 6 ay boyunca 2-8 °C'de saklanır.
  2. Kızakların kenarını sert bir yüzeye vurarak fazla engelleme solüsyonunu slaytlardan çıkarın. Onları durulamayın.

5. Birincil antikor

  1. Antikor seyreltme tamponundaki primer antikorları seyreltin (Malzeme Tablosu). Her numune için yaklaşık 100 μL nihai çözelti kullanın. NE ve H3cit (R8) antikoru ve izokontrolü için 5 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. MPO ve karşılık gelen izokontrol için 10 μg/mL kullanın. Her primer antikor için bir tüp ve her izokontrol antikoru için bir tüp hazırlayın.
    NOT: H3cit (R8)/MPO veya NE/MPO ve bunların izokontrolleri NET'lerin boyanması için birleştirilebilir. H3cit (R8)/MPO kombinasyonu için, H3cit (R8) için 5 μg/mL ve MPO için 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. NE / MPO için, NE için 5 μg / mL ve MPO için 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona, numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. İzokontrol için, karşılık gelen her bir antikor ile aynı konsantrasyonu kullanın. Kullanılan her antikor için her zaman yeni bir pipet ucu kullanın. Primer antikorlar 4 °C'de 1-2 hafta ve −20 °C veya −80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  2. Bir slaytta iki numune ile, izokontrol antikorları için bir tane ve MPO / H3cit veya MPO / NE antikor seyreltmesi için bir tane kullanın. Her numune için yaklaşık 100 μL kullanın ve antikor solüsyonunu eşit şekilde yayın.
    NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. İzokontrol ve primer antikorları karıştırmaktan kaçınmaya dikkat edin.
  3. Islak bir odada gece boyunca 4 °C'de saklayın.
  4. Ertesi gün, slaytlardaki fazla primer antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları bir küvette istifleyin. Kalan primer antikor solüsyonunu yıkamak için her seferinde TBST ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.

6. İkincil antikor

  1. İkincil antikor çözeltisini hazırlayın. İki farklı floresan sekonder antikor kullanın: MPO için eşek anti-keçi ve H3cit boyama için eşek anti-tavşan. Her birini antikor seyreltme tamponu ile 7.5 μg/mL konsantrasyona seyreltin (Malzeme Tablosu).
    NOT: Çift boyama için, farklı uyarma alanlarına ve minimum spektral örtüşmeye sahip iki floresan antikor kullanın. Her iki ikincil antikoru birleştirin ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacim için her bir antikor için 7.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Antikorları ışıktan koruyun. İkincil antikorlar 2-8 °C'de 6-8 hafta veya -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  2. Slaytları ıslak odada tutun ve her numuneye 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe etmelerine izin verin ve ışıktan koruyun.
  3. Fazla ikincil antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları sürgülü rafa istifleyin. Kalan bağlanmamış antikorları yıkamak için PBS ile dolu bir boyama kavanozuna her biri 5 dakika boyunca üç kez daldırın.
  4. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve DI su ile 1 μg/mL konsantrasyona seyreltin. Sürgülü rafı DAPI solüsyonu ile bir boyama kavanozuna daldırın ve karanlıkta RT'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: DAPI, çift sarmallı DNA için floresan lekesi olarak kullanılır. Hazırlanan DAPI çözeltisi birden çok kez kullanılabilir. Hazırlanan DAPI çözeltisini RT'de saklayın. DAPI konsantresi −20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  5. Fazla DAPI solüsyonunu yıkamak için sürgülü rafı 5 dakika boyunca PBS'li bir boyama kavanozuna daldırın.

7. Numunelerin montajı ve saklanması, mikroskobik analiz

  1. Numuneleri lameller ve montaj ortamı ile monte edin (Malzeme Tablosu).
    NOT: Yalnızca az miktarda montaj ortamı kullanın ve fazla ortamı ıslak mendillerle silin. Eldiven giyin ve lameller veya slaytlardan herhangi bir ortamı yanlışlıkla silmekten kaçının. Kabarcık oluşumundan kaçının ve slaytlardaki kabarcıkları gidermek için lamellere hafifçe bastırmak için pamuklu çubuklar kullanın.
  2. Görüntüleme için geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın.
    NOT: Önce izokontrolün bir görüntüsünü alın. Floresan filtrelerin (DAPI için mavi filtre hariç) maruz kalma süresini neredeyse hiç sinyal algılanmayana kadar azaltın. Ardından, ilgili örnekleri incelemek için bu ayarı kullanın. Floresan kanalını kullanarak her bir numunede bir floresan sinyalinin tespit edilebileceği alanları arayın. Alanın bir görüntüsünü aldıktan sonra, program tüm kanalların bileşik bir görüntüsünü oluşturur ve farklı floresan sinyallerini farklı renklerin üst üste binmesi olarak gösterir. Görüntü daha sonra ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla birlikte yerelleştirme için daha fazla analiz edilebilir.
  3. Slaytları 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol optimizasyonumuza başlamadan önce, NET'lerin immün boyanması için FFPE dokusu kullanan çalışmalar için PubMed'de arama yaparak başarılı boyama için temel adımları belirledik ve protokollerini karşılaştırdık. En umut verici protokol farklılıkları, protokol optimizasyonu için anahtar adımlar olarak belirlenirken, çoğunlukla birbirine karşılık gelen adımlar değiştirilmemiştir (Tablo 1).

Tablo 1: NET'lerin FFPE immün boyaması için PubMed Araştırması. Bu t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, gerçek boyama işleminden başlayarak, NET'lerin görüntülenmesi için mevcut protokolleri daha fazla doku tipine uyarlamayı ve optimize etmeyi amaçladık. Bu yöntem için ilk kritik adım, en uygun antikorların seçilmesidir. NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE'ye kıyasla güvenilir bir lekelenme göstermedi. Ayrıca, Thålin ve ark. hücre dışı boyama için daha spesifik bir antikor olarak H3cit (R8) önerdi. Bu antikoru yaygın olarak ku...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Alman Araştırma Derneği (BO5534) tarafından kurulmuştur. Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer ve PD Dr. Ingo Königs'e bize örnekler sağladıkları için teşekkür ederiz. Ek olarak, yazarlar immünofloresan mikroskobu ile ilgili destek için UKE Mikroskopi Görüntüleme Tesisi (Çekirdek tesis, UKE Tıp Fakültesi) ekibine teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
          Seyreltme< / güçlü>
Anti-Nötrofil Elastaz antikoru 100 & gabcamAb 68672 1:100
Anti-Histon H3 (sitrülin R2 + R8 + R17) antikoru  100&mikro; gabcamAb 51031:50
Anti-Miyeloperoksidaz antikoru [2C7] anti-insan 100 ve mikro; gabcamAb 259891:50
Anti-Miyeloperoksidaz antikoru [2D4] anti-fare 50 & mikro; gabcamAb 908101:50
Axiovision Mikroskopi Yazılımı Zeiss4.8.2.
Eşek serumu ile bloke edici solüsyon (KULLANIMA HAZIR) 50mlGeneTex 
LamellerMarienfeld0101202
Dako Hedef Alma Çözeltisi Sitrat pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antikor seyreltme 500 mLDCS teşhisiDCS AL120R500
Eşek karınca keçi Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Eşek anti tavşan AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Eşek anti tavşan Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Montaj OrtamıInvitrogen00-4958-02
Cam sürgülü rafRothH552.1
İnsan/Fare MPO AntikoruR& D SistemleriAF 3667 1:20
Hidrofobik KalemKISKERMKP-1
İzokontrolle Tavşan IgG Poliklonal 5mgabcamAb 374151:2000 ve 1:250
MaxBlock Otofloresan Azaltıcı Reaktif Kiti (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Mikroskopi kamerasıZeissAxioCamHR3
MikrodalgaBoschHMT84M421
Fare IgG1 negatif kontrolDakoX0931 Aglient1:50 ve 1:5
Normal Keçi IgG KontrolüR& D SistemleriAB-108-C 1:100
PBS Fosfat tamponlu salin (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP boyama kavanozuRoth2292.2
Rekombinant Anti-Histon H3 (sitrülin R8) antikoru 100 ve mikro; gabcamAb 2194061:100
Rekombinant Tavşan IgG, monoklonal [EPR25A] - İzotip Kontrolü 200 & mikro; gabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth  6640
SuperFrost Plus slaytlarıR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris tamponlu tuzlu su (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Su banyosuMemmert 830476
Su banyosu pirinç pişiricireishungerRCP-30
Islak odaWeckert Labortechnik600016
Zeiss Geniş Alan mikroskobuZeissAxiovert 200M
GTX30972

Kaynaklar

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115(2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159(2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824(2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7(2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834(2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Etiketler

Antijen Geri Kazan mDoku BoyamaOtofloresans AzaltmaSitr linlenmi Histon H3Miyeloperoksidaz AntikoruN trofil ElastazGeni Alan Floresan MikroskobuParafin G m l Doku
İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.