Fare Beynini In Vivo'da Transkraniyal Olarak Uyarmak için Milimetre Boyutlu Bir Bobin ile Birleştirilmiş Düşük Maliyetli Elektroensefalografik Kayıt Sistemi

Özet

Fare beyninin in vivo transkraniyal manyetik uyarımını sağlamak için milimetre büyüklüğünde bir bobin ile birleştirilmiş düşük maliyetli bir elektroensefalografik kayıt sistemi önerilmektedir. Özel yapım, esnek, çoklu elektrot dizisi substratına sahip geleneksel vidalı elektrotlar kullanılarak, transkraniyal manyetik stimülasyona yanıt olarak fare beyninden çok bölgeli kayıt gerçekleştirilebilir.

Özet

Burada, milimetre boyutunda bir bobin kullanarak, fare beyninin transkraniyal manyetik stimülasyonunu (TMS) in vivo olarak yürütmek için düşük maliyetli bir elektroensefalografik (EEG) kayıt sistemi önerilmektedir. Özel yapım, esnek, çok elektrot dizilimli bir alt tabaka ile birleştirilmiş geleneksel vidalı elektrotlar kullanılarak, fare beyninden çok bölgeli kayıt gerçekleştirilebilir. Ek olarak, milimetre boyutunda bir bobinin genellikle laboratuvarlarda bulunan düşük maliyetli ekipmanlar kullanılarak nasıl üretildiğini açıklıyoruz. Düşük gürültülü EEG sinyalleri üretmek için gerekli olan esnek çoklu elektrot dizisi substratının üretimi için pratik prosedürler ve vidalı elektrotlar için cerrahi implantasyon tekniği de sunulmaktadır. Metodoloji, herhangi bir küçük hayvanın beyninden kayıt yapmak için yararlı olsa da, bu rapor anestezi uygulanmış bir fare kafatasında elektrot uygulamasına odaklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem, ortak bir adaptör aracılığıyla bağlı kablolarla bağlanan ve kayıt sırasında kafasına bir TMS cihazı ile sabitlenen uyanık küçük bir hayvana kolayca genişletilebilir. EEG-TMS sisteminin en fazla 32 EEG kanalı (16 kanallı bir cihaz daha az kanallı bir örnek olarak sunulmuştur) ve bir TMS kanal cihazı içerebilen mevcut versiyonu açıklanmıştır. Ek olarak, EEG-TMS sisteminin anestezi uygulanan farelere uygulanmasıyla elde edilen tipik sonuçlar kısaca bildirilmiştir.

Giriş

Transkraniyal manyetik stimülasyon (TMS), düşük invaziv olmayan / düşük invaziv olması nedeniyle insan beyni bilimi, klinik uygulama ve hayvan modeli araştırmaları için umut verici bir araçtır. TMS uygulamalarının erken aşamasında, insanlarda ve hayvanlarda tek ve çift darbeli TMS'ye yanıt olarak kortikal etkinin ölçülmesi motor korteksle sınırlandırılmıştır; Kolayca ölçülebilir çıktı, motor uyarılmış potansiyeller ve motor korteks^1,2'yi içeren indüklenmiş miyoelektrik potansiyellerle sınırlıydı. TMS modülasyonu ile ölçülebilen beyin bölgelerini genişletmek için, elektroensefalografik (EEG) kayıt, tüm beyindeki alanların uyarılabilirliğini, bağlantısını ve mekansal zamansal dinamiklerini doğrudan incelemek için yararlı bir yöntem olarak tek ve çift darbeli TMS ile entegre edilmiştir ^3,4,5. Bu nedenle, TMS ve EEG kaydının (TMS-EEG) beyne eşzamanlı uygulanması, intrakortikal sinir devrelerini araştırmak için insan ve hayvanların çeşitli yüzeysel kortikal beyin bölgelerini araştırmak için kullanılmıştır (bkz. Tremblay ve ^ark.6). Ayrıca, TMS-EEG sistemleri, sinyallerin diğer kortikal bölgelere yayılması ve salınımlı aktivitenin üretilmesi de dahil olmak üzere ek kortikal uzaysal zamansal özellikleri incelemek için kullanılabilir ^7,8.

Bununla birlikte, TMS'nin beyindeki etki mekanizması, TMS'nin invaziv olmaması nedeniyle spekülatif kalmaktadır ve bu da TMS uygulamaları sırasında beynin nasıl çalıştığına dair bilgimizi sınırlamaktadır. Bu nedenle, kemirgenlerden insanlara kadar değişen hayvanlarda yapılan invaziv translasyonel çalışmalar, TMS'nin nöral devreler üzerindeki etkilerinin mekanizmasını ve aktivitelerini anlamak için çok önemlidir. Özellikle, hayvanlarda kombine TMS-EEG deneyleri için, küçük hayvanlar için eşzamanlı bir stimülasyon ve ölçüm sistemi yoğun bir şekilde geliştirilmemiştir. Bu nedenle, deneycilerin böyle bir sistemi kendi özel deneysel gereksinimlerine göre deneme yanılma yoluyla inşa etmeleri gerekmektedir. Ek olarak, fare modelleri diğer in vivo hayvan türü modelleri arasında yararlıdır, çünkü birçok transgenik ve suş yalıtımlı fare suşu biyolojik kaynaklar olarak mevcuttur. Bu nedenle, fareler için TMS-EEG kombine ölçüm sistemi oluşturmak için uygun bir yöntem, birçok sinirbilim araştırmacısı için arzu edilir.

Bu çalışma, araştırmalarda kullanılan ana transgenik hayvan türü olan fare beyninin eş zamanlı uyarılması ve kaydedilmesi için uygulanabilecek ve tipik sinirbilim laboratuvarlarında kolaylıkla oluşturulabilen TMS-EEG kombine bir yöntem önermektedir. İlk olarak, düşük maliyetli bir EEG kayıt sistemi, geleneksel vidalı elektrotlar ve her deneyde bir elektrot dizisi pozisyonunu tekrar tekrar atamak için esnek bir substrat kullanılarak tanımlanmıştır. İkincisi, tipik laboratuvarlarda kolayca ısmarlanabilen milimetre büyüklüğünde bir bobin kullanılarak manyetik bir stimülasyon sistemi inşa edilir. Üçüncüsü, TMS-EEG kombine sistemi, ses ve manyetik stimülasyona yanıt olarak nöral aktiviteyi kaydeder. Bu çalışmada sunulan yöntem, küçük hayvanlarda spesifik bozukluklar oluşturan mekanizmaları ortaya çıkarabilir ve hayvan modellerinde elde edilen sonuçlar, karşılık gelen insan bozukluklarını anlamak için çevrilebilir.

Protokol

Bu çalışmada, tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi izlenerek ve Hokkaido Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için iki erkek ve üç dişi, 8 ila 10 haftalık C57BL / 6J fareler kullanıldı. Bu bir terminal prosedürüdür. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Esnek iki boyutlu dizi tasarımı ve yapımı

1. EEG kaydı ve referans elektrotları olarak kullanılmak üzere gerekli sayıda minyatür vidalı elektrodu (paslanmaz, SUS XM7; bakınız Malzeme Tablosu) aşağıdaki yapısal özelliklerle hazırlayın: nominal çap, boyun uzunluğu ve kafa çapı sırasıyla 0,6 mm, 1,5 mm ve 1,1 mm (Şekil 1A).
   NOT: Bu çalışmada 16 adet minyatür vida elektrodu kullanılmıştır.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek esnek bir alt tabaka üzerinde baskılı devre şemasının bir planını hazırlayın.
   1. Vida elektrotlarının okunması için esnek bir alt tabaka (tam boyut, 41,2 mm × 19,9 mm; bkz. malzemeler) üzerinde iki boyutlu (2B) bir elektrot pedi deseni oluşturun. 2B elektrot düzenlemesini tasarlayın. Şekil 1B , bu çalışmada kullanılan spesifik düzenlemeleri ve bir taban çizgisi noktasından göreceli koordinatları göstermektedir (orijinde çapraz işaretlenmiş [0, 0]).
      NOT: Bu çalışmada, temporal loblar içindeki işitsel korteksteki nöral aktiviteyi kaydetmek için, lateral-medial (yatay) yönde elektrot yerleşimi, rostral-kaudal (dikey) yöndekinden daha uzundu (Şekil 1B).
   2. EEG kayıt elektrotları için, esnek alt tabaka üzerindeki her bakır pedin (bkz. Malzeme Tablosu) dış çapı 1,3 mm ve iç çapı 0,8 mm olan bir halka şekline sahip olduğundan emin olun (Şekil 1C, solda). Her vidalı elektrotun alt tabakadan geçmesi için merkezde küçük bir delik (0,8 mm çapında) açın. Referans elektrotları için, her bakır ped, kenar uzunluğu 1,4 mm olan kare bir şekle sahip olmalıdır; Benzer şekilde, her vidanın alt tabaka üzerindeki kare pedden geçmesi için merkezde küçük bir delik (0,8 mm çapında) açın (Şekil 1C, sağda).
   3. Ardından, yüzeye monte edilmiş bir konektörü lehimlemek için (Şekil 1D, solda), konektöre giden okuma pedleri (2B dizi) tasarlayın (Şekil 1D, sağ). Örneğin, 2 × 10 pimli bir konektör ve bitişik pimler arasında 1,27 mm'lik bir aralık kullanın (Şekil 1D, sağda).
   4. Vidalı elektrot pedlerini ve konektör pedlerini, çizgi genişliği 0,03 mm ve çizgi aralığı 0,03 mm olan ( Şekil 1E'deki ince çizgiler) hem yüzey hem de arka katmanı kullanarak bağlayın.
   5. Ayrıca, referans ve toprak kanallarını amplifikatöre bağlamak için, referans ve toprak elektrotları için elektrot pedlerini esnek 2D dizinin dışındaki izole parçaya bağlayın ( Şekil 1E'nin altındaki "G" ve "HR" ile gösterilen iki dikey dikdörtgen). Referans ve topraklama kanallarını belirledikten sonra, elektrot pedlerini ilgili konektörlere lehimlemeyi unutmayın (bkz. adım 2.1).
   6. Bir koruma tabakası (poliimid tabakası) ile kaplanmamış açık bir alanı uygun şekilde tasarlayın. Vidalı elektrot pedlerini hem yüzey hem de arka katmanlarda açığa çıkarırken konektör pedlerini yüzey katmanında açığa çıkarın. Tüm elektrot tasarımı, boyutları ve imal edilmiş esnek 2D dizisi Şekil 1E'de gösterilmiştir ve fabrikasyon bir substratın görüntüsü Şekil 1F'de gösterilmiştir.
   7. Esnek 2B dizinin üst elektrot kısmında (kafa kısmı), yukarıdan aşağıya doğru üç katmanlı yapının aşağıdakilerden oluştuğundan emin olun (toplam kalınlık 49,0 μm): bir üst bakır tabaka (12,0 μm kalınlık), bir orta çekirdek poliimid tabakası (25,0 μm) ve bir alt bakır tabaka (12,0 μm) (Şekil 1G, üst).
   8. Bakır tabakaları substratın üst ve alt yüzeyine, örneğin ıslak aşındırma ve standart imalat tekniği⁹ kullanarak kazıyın.
   9. Esnek 2B dizinin alt kare ped kısmında (konektör parçası), altı katmanlı yapının, üst ve alt (her ikisi de 12,5 μm) katmanlar dahil olmak üzere koruyucu poliimid tabakalarla sıkıştırılmış bir üst bakır tabaka (12,0 μm kalınlık), bir orta çekirdek poliimid tabakası (25,0 μm) ve bir alt bakır tabaka (12,0 μm) dahil olmak üzere üç katmandan oluştuğundan emin olun. Takviye malzemesi olarak alttan 2 mm'lik bir poliimid levha takın (Şekil 1G, alt).
      NOT: Esnekliği korumak için, takviye poliimid levhası, kafa ve konektör parçası arasındaki esnek 2D dizisinin boyun kısmına monte edilmez.
   10. Benzer şekilde, konektör kısmında, ıslak aşındırma ve standart imalat tekniğini kullanarak bakır ve koruyucu poliimid tabakalarını üstte aşındırın.
       NOT: Konektör dahil olmak üzere fabrikasyon, esnek, 2D dizi cihazının toplam ağırlığı 0,84 g'dır. Esnek bir 2B dizi için bir düzen tasarladıktan sonra, ticari bir üreticinin alt tabakaları (bkz. Malzeme Tablosu) bazen kolaylık sağlamak için önerilir.

Şekil 1: Elektroensefalografik (EEG) kayıt için esnek iki boyutlu (2D) dizinin bileşen parçaları ve dizi dahil olmak üzere fabrikasyon cihaz. (A) Fare kafatasına gömülü minyatür vidalı elektrot. (B) Beyin aktivitesini ölçmek için tasarlanmış elektrot pedleri (yeşil daireler) ve referans kanalı (sağ alttaki kare). Elektrot pedlerinin orijindeki (0, 0) bir referans noktasından (çapraz işaret) göreceli koordinatları gösterilir; milimetre cinsinden boyut parantez içinde gösterilmiştir. Elektrot pedlerinin merkez koordinatları, çapraz işaretten geçen dikey eksene göre simetriktir. (C) Bir kayıt elektrodu (solda) ve bir referans elektrodu (sağda) için elektrot pedleri ve matkap delikleri gösterilmiştir. (D) Esnek 2D dizisi (solda) ve alt tabaka üzerinde tasarlanan pedlerin deseni ve boyutu (sağda) için kullanılan yüzeye monte edilmiş bir konektör (2 × 10 pim). (E) Her bir parçanın milimetre cinsinden boyutuyla tasarlanmış plan. (F) E'deki plan ile gösterilen fabrikasyon bir substratın görüntüsü. (G) Esnek 2B dizinin katman yapısı (kafa ve konektör parçaları). Vidalı elektrot pedlerinin (üstte) ve okuma pedlerinin (altta) üst ve yan görünümleri gösterilmiştir. Kafa ve konektör parçaları sırasıyla üç katmanlı bir yapıdan (üstte) ve altı katmanlı bir yapıdan (altta) oluşur. Ek olarak, boyun kısmı beş katmanlı bir yapıdan oluşur; Üst ve arka yüzeye koruyucu bir poliimid tabakası monte edilir ve takviye poliimid levhası boyun kısmına monte edilmez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Adaptör yapımı ve kanal haritalama

1. Aşağıdaki adımları izleyerek adaptör yapımını gerçekleştirin.
   1. Lehimleme akısını 2 × 10 pim, yüzeye monte konektör (Şekil 1D, solda) ve esnek alt tabaka üzerindeki 2B dizinin konektör pedleri (Şekil 1D, sağ) üzerinde yayın.
   2. 2 × 10 pimli, yüzeye monte konektörü konektör pedlerine lehimleyin. Özellikle, 2B dizinin alt kısmındaki iki ped ile referans ve topraklama kanalları olarak kullanılan iki konektör pimi arasındaki bağlantıyı onaylayın (Şekil 2A).
   3. Taban çizgisi sinyallerini harici bir noktaya (örneğin, ölçüm sisteminin toprak kanalına bağlı bir toprak noktası; Şekil 2A).
      NOT: Ancak bu çalışmada konnektör kısmında kare elektrot yerine referans elektrot olarak vidalı elektrotlu dairesel elektrot pedlerinden biri kullanılmıştır.
   4. Lehimlemeden sonra, açığa çıkan noktaları korumak ve kısa devreleri önlemek için lehimleme noktalarını epoksi reçine kullanarak örtün ( bkz.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek konektör kablosunu ve kafa amplifikatörünü sabitleyin.
   1. 2 × 10 pimli ve 1,27 mm aralıklı (Şekil 2B, sol üstte) ve 0,635 mm aralıklı düz bir 20 pimli şerit kablo (Şekil 2B, sol altta) içeren bir yalıtım-yer değiştirme konektörü (IDC) hazırlayın. Düz şerit kabloyu istenen uzunluğa (ör. 40 cm) kesin.
   2. IDC'yi ve düz şerit kablonun bir ucunu bir IDC sıkma aleti kullanarak kıvırın (Şekil 2B, sağ üstte) ( bkz.
   3. Kablonun diğer ucunun her bir hattını, bir kesici kullanarak uç ucundan yaklaşık 15 mm'ye kadar ayırın. İzolasyonu uç ucundan 3 mm sıyırın.
   4. Kıvrımlı IDC'yi düz şerit kabloya ve esnek alt tabakaya lehimlenmiş 2 × 10 pimli konektöre bağlayın (Şekil 2C).
   5. Kayıt elektrodu ile kablonun ayrılmış hattı arasındaki yazışmaları onaylayın. Kullanılan her hattın yanlış bir bağlantı hatası üretmediğinden emin olun.
   6. Her elektrotun çıkışına karşılık gelen bireysel hatların açıkta kalan bakır tellerini, ana amplifikatör de dahil olmak üzere ölçüm sisteminin 20 pimli konektörüne (1,25 mm aralık) lehimleyin (Şekil 2B, sağ altta).
   7. Lehimlemeden sonra, bir test ekipmanı kullanarak vidalı elektrot pedleri ve konektör pimleri arasındaki iletimi onaylayın (örneğin, bir LCR ölçüm cihazı; bkz.
   8. Lehimleme noktalarını hasardan korumak ve diğer sinyal hatlarıyla teması önlemek için epoksi reçine ve koruyucu bant kullanarak örtün.
   9. Epoksi reçine kullanarak, esnek alt tabaka üzerindeki 2D dizinin konektör kısmının arka tarafına ince bir paslanmaz çelik çubuk (çap: 1,1-1,2 mm; uzunluk: 100 mm) yapıştırın.
      NOT: Bu paslanmaz çelik çubuk, deneyler sırasında bir mikromanipülatör tutucu tarafından kavranabilir (Şekil 2C).
   10. Son olarak, vidalı elektrotlar ve sinyal çıkış kanalları arasındaki eşlemeyi onaylayın (Şekil 2D).

Şekil 2: Esnek alt tabaka üzerinde iki boyutlu (2B) bir elektrot dizisi için adaptörün oluşturulması ve kanal eşlemesinin kaydedilmesi. (A) Konektör kısmında, referans ve toprak kanalları alt elektrot pedlerine kurşun tellerle bağlanır. Referans ve toprak kanalları önceden belirlenmişse, kanallar tasarım aşamasında ilgili alt elektrot pedlerine bağlanmalıdır. Bu gibi durumlarda, kurşun tellerin kanallara ve elektrot pedlerine lehimlenmesi gereksizdir. (B) İzolasyon-yer değiştirme konektörleri (sol üstte), ölçüm amplifikatörü konektörünü (sağ üstte) bağlamak için düz kablonun bir ucuna (sol altta) kıvrılır. Kullanılacak kanallara karşılık gelen tüm hatlar yeşil konektörlere lehimlenir (sağ altta). Bu durumda, kafa amplifikatörüne bağlı her yeşil konektör sekiz kanallı bir ölçüm için atandığından, 16 kanallı beyin aktivitesi sinyallerini kaydetmek için en az iki konektöre ihtiyaç vardır. Lehimli noktalar, diğer sinyal hatlarıyla teması önlemek için epoksi reçine ve koruyucu bant ile kaplanmıştır. (C) Konektör ve fabrikasyon kablo, esnek 2D dizi alt tabakasının yüzeyine yerleştirilir. İnce paslanmaz çelik çubuk, esnek alt tabakanın arka tarafına tutturulmuştur. (D) Fare beyni yüzeyindeki kayıt kanallarının uzamsal konumları ve ölçüm sistemi için her bir nokta için kanal haritaları gösterilir. Bu durumda, vidalı elektrotlu (kırmızı daireler) 16 kayıt kanalı vardır, ancak olası kayıt alanlarının toplam sayısı 32'dir. Kayıt yapmayan diğer 16 kanal da beyin yüzeyinde yeşil daireler olarak gösterilir. Haritalama grafiğinde, "G" ve "R" sırasıyla zemin ve referans elektrotları için tasarlanmış kanalları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Hayvan cerrahisi

1. Steril cerrahi ortamı hazırlayın.
   1. Hayvanları içeren tüm deneysel prosedür sırasında lateks eldiven gibi koruyucu ekipmanlar giyin.
   2. Stereotaksik aparatı ve cerrahi aletleri sterilize edin (bakınız Malzeme Tablosu).
   3. Cerrahi aletleri sterilize ettikten sonra, steril salin kullanarak yıkayın.
2. Hayvanları uyuşturun.
   1. Ameliyattan önce farenin ağırlığını ölçün. Atropin sülfat (0.04 mg/kg; bakınız Malzeme Tablosu) intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulanır.
   2. Medetomidin (0.3 mg / kg), midazolam (4.0 mg / kg) ve butorphanol (5.0 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla fareyi uyuşturun.
   3. Ayak parmağını sıkıştırarak anestezik derinliği yanıt seviyesine göre onaylayın.
      NOT: Anestezi yaklaşık 40 dakika sonra yıpranacaktır. Fare bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt verirse, anestezik karışımın aynı dozunu intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulayın.
3. Elektrot implantasyon ameliyatı için önceden hazırlanın.
   1. Dokunsal hissi önlemek için fare bıyıklarını kesin.
   2. Kurumayı önlemek için her iki gözü de oftalmik bir merhemle yağlayın. Görme duyusunu engellemek için göz kapaklarını kapatın ve üst ve alt göz kapaklarını tamir bandı ile yapıştırarak kapanmayı sürdürün.
   3. Farenin başındaki saçları elektrikli makaslarla tıraş edin. Rektuma bir termometre yerleştirin ve bir ısıtma yastığı kullanarak vücut sıcaklığını 37 ° C'de tutun.
   4. Lidokain hidroklorürü, fare kafa derisinin kesilecek kısmına topikal bir lokal anestezik olarak uygulayın.
   5. Fare kafa derisini bir neşter veya cerrahi makas kullanarak rostral-kaudal yönde kesin (alan boyutu: 7 × 10 mm²).
   6. Kafa derisini kesilmiş kısmın yakınında cımbızla sıkıştırın ve kaldırın. Bir neşter veya cerrahi makas kullanarak kafatasındaki görünür zarı çıkarın. Operasyon sırasında göz çevresindeki kan damarlarını kırmayın.
   7. Kafa derisinin kesi çizgisinin her iki merkezinin yakınındaki cildi forseps ile kavrayın ve kafatasının üst kısmını geniş bir şekilde açığa çıkarmak için kesilmiş kısmı genişletin.
   8. Kafatasının yüzeyindeki tüm zarların ve lambda çevresindeki dokunun cerrahi makasla tamamen çıkarıldığını onaylayın.
   9. Kafatasının altındaki beyin yüzeyinin görünürlüğünü arttırmak ve enine sinüsü bulmak için kafatası yüzeyini fizyolojik salinle ıslatın.
      NOT: Vida elektrotlarını kafatasına implante ederken, bunları enine sinüsün üstüne ve içine gömmemeyi unutmayın.

4. Elektrot implantasyonu

1. Esnek substratın arka tarafındaki 2D elektrot dizisine monte edilmiş paslanmaz çelik çubuğu bir mikromanipülatöre takın. Esnek substratı kafatasına yerleştirin.
2. Kanalların (Chs) 3 ve 14'ün (Şekil 2D) dizideki konumunu, inferior kollikulusa sığacak şekilde ayarlayın.
   NOT: İnferior kollikulus transvers sinüs boyunca yer alır. Önceden bir fare beyin atlası kullanarak inferior kollikulusun yerini doğrulamanızı öneririz.
3. Kafatası üzerindeki Chs 3, 8, 9 ve 14'ün (Şekil 2D) konumlarına, hedefleme yer işaretleri olarak kullanmak üzere kalıcı bir işaretleyici ile küçük daireler çizin.
4. Diş çimentosuna yapışmayı arttırmak ve esnek substrat üzerindeki 2D elektrot dizisini fare kafatasından elektriksel olarak izole etmek için kafatası yüzeyini kurutun.
5. Kafatası yüzeyine diş çimentosu (yaklaşık 1 mm kalınlığında; bakınız Malzeme Tablosu) uygulayın. Diş çimentosunu uyguladıktan sonra, iyileşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin.
6. Esnek substratı kafatasının yüzeyindeki küçük dairesel işaretlere göre hizalayın.
7. Bir diş matkabının ucunu esnek alt tabaka üzerindeki her elektrot pedi deliğine hizalayın. Elektrot pedi deliklerinin her birinden kafatasına dikkatlice delin.
8. Minyatür vida elektrotlarının her birini, minyatür vidalar için özel bir tornavida kullanarak kafatasındaki delinmiş deliklerden vidalayın.
9. Vida elektrodunun kafasını ve elektrot pedini sıkıca sıkın. Son olarak, elektriksel iletkenliği doğrulamak için her bir vidalı elektrot ile konektör arasındaki iletkenliği test ekipmanıyla (örneğin bir LCR ölçüm cihazı) ölçün.

5. Küçük bobin tasarımı ve yapımı

1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak merkezinde bir delik bulunan (iç çap: 2 mm; dış çap: 7 mm; kalınlık: 1 mm) çörek şeklinde bir disk tasarlayın (bkz. Ek Kodlama Dosyası 1).
2. Bir 3D yazıcı kullanarak, ısıya dayanıklı olmayan malzemeden (örneğin, poli-laktik asit filament) yapılmış iki disk (Şekil 3A, solda) yazdırın; ısıya dayanıklı olmayan malzeme her zaman gerekli değildir (aşağıya bakınız).
3. Kısa bir şaft (uzunluk: 60 mm) oluşturmak için bir permalloy-45 çubuğunu (çap: 2 mm; bkz. Malzeme Tablosu) kesin.
4. Şaftı iki 3D baskılı diskin her bir deliğine yerleştirin (Şekil 3A, sağda). Bir diski şaftın ucuna, diğerini ise uçtan 11 mm uzağa yerleştirin, böylece iki disk arasında 10 mm'lik bir mesafe elde edilir. Diskleri anında yapıştırıcı ile yapıştırın (bkz.
5. Şaftın ucunu disksiz olarak bir darbe sürücüsüne takın (Şekil 3B). Permalloy-45 miline küçük bir mıknatıs takın. Mıknatısın yanına şafttan 5 mm uzakta bir hall etkisi sensörü yerleştirin. Hall etkisi sensörünü bir veri toplama (DAQ; bkz. Malzeme Tablosu) sistemine bağlayın.
6. Dönüş sayısını saymak için, DAQ sistemi aracılığıyla hall etkisi sensöründen gelen çıkış sinyallerini analiz eden bir bilgisayar programı hazırlayın (bkz.
7. Şafta ince bir bakır tel (çap: 0,16 mm) bağlayın ve telin üst ucuna anında yapıştırıcı ile yapıştırın.
8. Darbe sürücüsünü kullanarak, bakır teli iki disk arasında 1.000 tur boyunca sarın. Dönme hızı isteğe bağlı olmasına rağmen, tipik olarak saniyede yaklaşık 5 dönüş kullanılır. Ardından, yara teline anında yapıştırıcı ile yapıştırın.
9. İki diski şafttan ayırın. Diskler şafta kuvvetli bir şekilde yapışmışsa, diskleri bir ısı tabancası kullanarak eritin.
10. Yüzeyi yalıtmak ve sabitlemek için bobini epoksi reçine ile örtün. Ardından, sargısız şaft kısmını fazlalık olarak kesin.
11. Elde edilen bobinin yüksekliğinin 10 mm ve çapının 6 mm olduğundan emin olun (Şekil 3B, solda). Bobin manipülasyonu için, ya bir bobin tutucu oluşturun (Şekil 3C, sağda) ya da bobine paslanmaz çelik bir çubuk yapıştırın (burada gösterilmemiştir).
12. Bir LCR metre kullanarak bobinin direncini ve endüktansını ölçün (bkz. Örneğin, burada kullanılan bobin, 18.3 Ω'lik bir doğru akım (DC) direncine ve 1 kHz alternatif akım (AC) girişinde 7.9 mH'lik bir endüktansa sahipti. AC özellikleri (direnç ve endüktans) Şekil 3D'de gösterilmiştir.
13. Bobine bipolar kare dalga uygulamak için bir fonksiyon üreteci kullanın. Giriş voltajının tipik genliği, 2 V'luk bir jeneratör çıkışını takiben, 10x kazançlı bir bipolar güç kaynağı aracılığıyla 20 V'tur. Ortaya çıkan dalga formu, yaklaşık genliği 20 V olan bipolar kare dalgadır (yani, 40 V'luk bir tepeden tepeye voltaj) (Şekil 3E).
14. Hall etkisi sensörünü ve DAQ sistemini kullanarak manyetik akı yoğunluğunu ölçün. Bu durumda, örneğin, bobinin manyetik akı yoğunluğu (B), bobin tabanı hall etkisi sensörü ile temas ettiğinde 113.6 ±2.5 mT (ortalama ± SEM) idi (Şekil 3F).

Şekil 3: Manyetik stimülasyon için küçük bobin. (A) Üç boyutlu (3D) baskılı disk (solda). Permalloy-45 miline iki özdeş disk yapıştırılır; biri şaftın sonunda, diğeri ise 10 mm uzaklıktadır (sağda). (B) Bobinin sarılması için kurulum. İki diskli 60 mm'lik şaft, bir darbe sürücüsüne bağlanır. Şafta bağlı küçük mıknatısın yanına bir hall etkisi sensörü yerleştirilir. Bakır tel iki disk arasına sarılır. (C) İnşa edilmiş bobin. Bobin 10 mm yüksekliğinde, 6 mm çapındadır ve 1.000 tur bakır tel vardır. Şeklin sağ tarafı, 3D baskılı bir bobin tutucu tarafından manipüle edilen bobini göstermektedir. (D) Bir LCR metre tarafından kaydedilen bobinin AC özellikleri: (üst) sinüzoidal giriş frekansına karşı direnç; (alt) endüktansa karşı giriş frekansı. Tipik bir bobin, 1 kHz AC girişinde sırasıyla 21.6 ve 7.9 mH'lik bir direnç ve endüktansa sahiptir. (E) Bir osiloskop tarafından kaydedilen bobin girişi olarak kullanılan bifazik dikdörtgen dalga formu. (F) Manyetik akı yoğunluğu ile inşa edilmiş bir bobin ile hall-effect sensörü arasındaki mesafe arasındaki ilişki. Manyetik akı yoğunluğu, her sensör için bir kez olmak üzere beş farklı salon etkisi sensörü tarafından kaydedildi. Beş ölçümün ortalaması çizilir ve hata çubukları ortalamanın standart hatalarını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Sinyal kayıt sistemi ve prosedürü

1. Esnek 2B diziyi düz şerit kabloyla kayıt sistemine bağlayın (bkz.
2. Bobin üzerine monte edilmiş paslanmaz çelik çubuğu bir mikromanipülatöre takın (bkz.
3. Bobini bregma'nın üzerine yerleştirin ve odak noktasını inferior kollikulusun üzerine yerleştirmek için kaudal yönde konumu ayarlayın. Yayan elektrik alanın odak noktası, bobinin alt yüzeyindeki yara alanının orta çizgisidir (yani, kenardan merkeze 1 mm).
4. İki kutuplu bir güç kaynağı ve bir fonksiyon üretecinden oluşan bir stimülasyon sistemi hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve bobini sisteme bağlayın.
5. DAQ sisteminden fonksiyon üretecine tetikleme sinyalleri uygulamak için fonksiyon üretecinin giriş terminali ile DAQ sisteminin çıkış terminali arasına bir kablo bağlayın. Uyaranları başlatmak için tetikleyici sinyaller için uygun bir bilgisayar programı hazırlayın. Ek olarak, stimülasyon sürelerini zaman damgası olarak kaydetmek için DAQ sistemini kayıt sistemine bağlayın.
6. Kayıt sistemi için satın alma işlemini başlatın.
   NOT: Kayıt sistemi gürültüyü topluyorsa, gürültünün kaynağını bulun ve azaltın.
7. Stimülasyon sistemini tetikleyerek manyetik stimülasyonu test edin.
   NOT: Manyetik stimülasyon tarafından üretilen gürültü ölçüm aralığını doyuruyorsa, aralığı uygun şekilde ayarlayın. Ek olarak, kayıt sisteminin stimülasyon zaman damgalarını düzgün bir şekilde kaydettiğini onaylayın.
8. Yanıt verilerini kaydetmeye başlayın ve stimülasyon oturumlarına başlayın. Her stimülasyon oturumu tamamlandığında kaydı durdurun. Kaydedilen tüm verileri sonraki analizler için kaydedin.
   NOT: Tüm deneysel koşulları beş farklı manyetik yoğunlukla gerçekleştirmek için, örneğin, tüm seanslar için gereken toplam süre yaklaşık 75 dakika idi. Son nokta genellikle tüm kayıt oturumları bittikten sonra belirlenirdi. Bununla birlikte, hayvanlar öksürük, nefes darlığı ve nefes alma gibi klinik belirtiler gösterdiğinde, deneysel oturum derhal sonlandırıldı. Ötanazi için, hayvanlar anestezi altındayken keskin, temiz makas kullanılarak kafa kesme işlemi yapıldı.

7. Veri analizi

1. Geniş bant (ham) sinyali, kesme frekansı 200 Hz olan alçak geçirgen bir filtre kullanarak filtreleyin.
2. Her stimülasyon zaman damgasının etrafındaki bir zaman penceresi boyunca filtrelenmiş dalga formlarını toplayın. Olayla ilişkili potansiyel (ERP) dalga formlarını elde etmek için dalga formlarının ortalaması alınmaktadır (Şekil 4 ve Şekil 5).

Sonuçlar

Anestezi uygulanmış C57BL/6J farelerde kaydedilen örnek EEG verileri, vidalı elektrotlarla birleştirilmiş esnek substrat ile aşağıda sunulmuştur.

Tipik bir örnek olarak, ses stimülasyonuna yanıt olarak üretilen ortalama EEG dalga formları (8 kHz ton patlaması, 80 dB ses basıncı seviyesi [SPL]), aynı uyaranlara sahip 60 çalışma için gösterilmiştir (Şekil 4A). Kayıt kanalı haritalamasının bir şeması da Şekil 4A'nın ortasında sunulmuştur...

Tartışma

Bu çalışma, fareler de dahil olmak üzere küçük hayvanlar için tasarlanmış manyetik bir stimülasyon sistemi ile birleştirilmiş çok bölgeli bir EEG kayıt sistemini ele almaktadır. İnşa edilen sistem düşük maliyetlidir ve fizyolojik laboratuvarlarda kolayca inşa edilir ve mevcut ölçüm kurulumlarını genişletebilir. Fare kayıt sisteminden veri elde etmek için gerekli cerrahi prosedür, bu tür laboratuvarların standart elektrofizyolojik deneylerle daha önce deneyime sahip olmaları durumunda son derece basittir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D yazıcı	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	FFD-101	Çörek şeklindeki disklerin 3D baskısı için kullanılan yazıcı
ATROPINE SÜLFAT ve 0.5 mg	NIPRO ES PHARMA CO., LTD.	-	Atropin sülfat
Bipolar amplifikatör	NF Corp.	KIT61380	Bobin girişi için dalga formlarını yükseltmek için
Butorphanol	Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo,	Japonya-Hayvanların	anatezi için
Esnek 2D dizi ticari üreticisi	p-ban.com Corp.	-	URL:
https://www.p-ban.com/ Çıkış sinyallerini analiz etmek için bilgisayar programı	Natinal Instruments	NI-DAQ ve  NI-DAQmx Python	Hall etkisi sensöründen gelen çıkış sinyallerini analiz etmek için
Connector	Harwin, Inc.	G125-FV12005L0P	Konektörün ölçüm sistemine bağlanması için
Copper pad	p-ban.com Corp.	bakır	Her alt tabakada bakır ped
Bakır tel	Kyowa Harmonet Ltd.	P644432	Bobin
DAQ kartının	National Instruments Corp.	USB-6343	Bobinin manyetik akı yoğunluğunu ölçmek için
Diş çimentosu	SHOFU INC.	Hızlı Reçine	Kendiliğinden Kürlenen Ortodontik Reçine
ECoG elektrot	NeuroNexus Inc.	HC32	Esnek 2D dizi
Epoksi reçine	Konishi Co., Ltd.	# 16123	Bobin yapımı için
Etil Karbamat	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal A.Ş.	050-05821	Üretan anestezisi için
Düz şerit kablo	Oki Electric Cable Co., Ltd.	FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m	Yüzeye monte konektör ile ölçüm sistemi esnek alt tabaka arasına kablo bağlanması için
	p-ban.com Corp.	poliimid	Esnek substratın taban plakası
Fonksiyon üreteci	NF Corp.	WF1947	Bobin girişi için dalga biçimleri oluşturmak için
Hall etkisi sensörü	Honeywell International Inc.	SS94A2D	aletinin manyetik akı yoğunluğunu ölçmek için
	Pro'sKit Industries Co.	6PK-214	IDC'yi ve düz şerit kablonun bir ucunu kıvırmak için; Düz kablo konektörü sıkma aleti
Anında tutkal	Konishi Co., Ltd.	#04612	Bobin yapısı için
Yalıtım-deplasman konektörü (IDC )	Uxcell Japan	B07GDDG3XG	2 & kez; 10 pin ve 1,27 mm aralık
LCR metre	NF Corp.	ZM2376	Bobin
Manipülatörü	NARISHIGE Group'un	SM-15L	Bobini manipüle etmek için
Medetomidin	Kobayashi Kako, Fukui,	Japonya-Hayvanların	anatezi için
Midazolam	Astellas Pharma, Tokyo,	Japonya-Hayvanların	anatezi için
Minyatür vida	KOFUSEIBYO Co., Ltd.	S0.6*1.5	EEG algılama ve referans elektrot için
Fare	Japonya SLC, Inc.	C57BL / 6J & nbsp; (C57BL/6JJmsSlc)	Deney hayvanı
Permalloy-45 çubuk	Nilaco Corp.	780544
Bobin Kayıt sisteminin	Plexon Inc.	EEG veri alımı için	OmniPlex
Paslanmaz tel	Wakisangyo Co., Ltd.	HW-136	Manipülatör
Stereotaksik cihaz	NARISHIGE Grubu	SR-5M-HT	Bir fare kafasını düzeltmek için
Yüzeye monte konektör	Useconn Electronics Ltd.	PH127-2x10MG	Konektörün esnek 2D diziye monte edilmesi için
Test ekipmanı (LCR metre)	NF Corp.	ZM2372	Kontak kontrolü ve empedans ölçümleri
Beyaz PLA filament	Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd	PLA-F13	Çörek şeklindeki disklerin 3D baskısı için kullanılan malzeme
Ksilokain Jöle %2	Sandoz Pharma Co., Ltd.	-	lidokain hidroklorür