HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Summary

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

Abstract

Mitokondri, ATP sentezi yoluyla enerji üretimini kontrol ederek metabolik homeostaz için kritik öneme sahip dinamik organellerdir. Hücresel metabolizmayı desteklemek için, çeşitli mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları sağlıklı bir mitokondriyal ağı korumak için işbirliği yapar. Böyle bir yolak, PTEN'e bağlı kinaz 1 (PINK1) ve hasarlı mitokondrinin Parkin fosfo-ubikitinasyonunun otofagozom sekestrasyonunu ve daha sonra lizozom füzyonu yoluyla hücreden çıkarılmasını kolaylaştırdığı mitopajidir. Mitopaji, hücresel homeostaz için önemlidir ve Parkin'deki mutasyonlar Parkinson hastalığı (PD) ile bağlantılıdır. Bu bulgular nedeniyle, mitokondriyal kalite kontrolün moleküler mekanizmalarını ve dinamiklerini anlamak için mitokondriyal hasar ve cironun araştırılmasına önemli bir vurgu yapılmıştır. Burada, HeLa hücrelerinin mitokondriyal ağını görselleştirmek, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için canlı hücre görüntüleme, bir mitokondriyal ayrıştırıcı ajan olan karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedaviyi takiben kullanıldı. Ek olarak, Parkin'e bağımlı mitopajiyi inhibe eden PD'ye bağlı bir Parkin mutasyonu (Parkin^T240R), mutant ekspresyonun, vahşi tip Parkin'i eksprese eden hücrelere kıyasla mitokondriyal ağı nasıl etkilediğini belirlemek için ifade edildi. Burada özetlenen protokol, mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için floresan tabanlı yaklaşımlar kullanan basit bir iş akışını açıklamaktadır.

Introduction

Mitokondriyal ağ, enerji üretimi 1, doğuştan gelen bağışıklık^2,3 ve hücre sinyalizasyonu ^4,5'te çok önemli bir rol oynayan birbirine bağlı bir dizi organeldir. Mitokondriyal disregülasyon, Parkinson hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ^{ilişkilendirilmiştir6,7}. PH, dünya çapında yaklaşık 10 milyon insanı etkileyen, substantia nigra'nın dopaminerjik nöronlarını etkileyen ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır⁸. PD, genetik ....

Protocol

1. Biyolojik numunelerin hazırlanması

NOT: Bir biyogüvenlik kabininde steril teknik kullanarak aşağıdaki adımları uygulayın. Kabinin yüzeyine ve tüm malzemelere% 70 etanol püskürtün.

1. HeLa hücre kültürü ve transfeksiyonu
   1. Dulbecco'nun modifiye kartal besiyerinde (DMEM) %10 fetal sığır serumu ve %1 L-glutamin çözeltisi (HeLa media; bakınız Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş 4.5 g/L glikoz içeren 30.000 HeLa hücresi kültürü. Hücreleri, 2 mL önceden ısıtılmış HeLa ortamı içeren 35 mm cam tabanlı görüntüleme kaplarına (bkz. HeLa kültürlerini %5 CO₂ ve 37 °C

Results

Bu protokolde, CCCP tedavisini takiben mitokondriyal ağın membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini ölçmek için floresan bazlı niceleme kullanılmıştır (Şekil 1). Bu iş akışı, rahim ağzı kanserinden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı olan HeLa hücrelerini kullandı. HeLa hücreleri mitokondriyal biyolojiyi incelemek için rutin olarak kullanılır ve nispeten düzdür, bu da mikroskopi kullanarak mitokondriyal ağı görselleştirmeyi kolaylaştırır. Parkin'in mitokondriyal ağ sağlığını .......

Discussion

Burada özetlenen iş akışı, floresan bazlı görüntüleme³⁰ kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu deneyleri tasarlarken göz önünde bulundurulması gereken önemli teknik sınırlamalar vardır. HeLa hücreleri boş bir YFP vektörü, YFP-Parkin^WT veya YFP-Parkin^T240R ile transfekte edildi. Boş YFP vektörü, deneysel bulguların Parkin'e özgü olduğunu doğrulamak için bir kontrol olarak .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimyasallar, Peptitler ve Rekombinant Proteinler
CCCP (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x), 4.5 g/L glikoz	ile Gibco	11-965-084
DMSO, Susuz	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Sığır Serumu	Hiklonu	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfeksiyon Reaktifi)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamin Çözeltisi)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Kırmızı	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Koyu Kırmızı	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Azaltılmış Serum ortamı)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetrametillolamin, Etil Ester, Perklorat (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
deneysel modeller: Organizmalar/Suşlar
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Tıbbi Araştırma Enstitüsü)	N/A
Rekombinant DNA
EYFP Boş Vektör	Yok	/A
YFP-Parkin T240R	Bu Makale,		Addgene'den bölgeye yönelik mutajenez ile oluşturulmuştur
	; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Yazılım ve Algoritmalar
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Elektronik Tablo Yazılımı)	Microsoft Office
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Uygulama Paketi (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (İstatistiksel Analiz Yazılımı)	GraphPad Yazılımı	https://www.graphpad.com
Diğer
35 mm Çanak, No. 1.5 Lamel, 20 mm Cam Çapı, Kaplamasız	MatTek	P35G-1.5-20-C
Kafes İnkübatörü (Çevre Odası)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Ters Mikroskop	Leica	N/A
LIGHTNING Dekonvolüsyon Yazılımı	Leica	N/A
STELLARIS 8 konfokal mikroskop	Leica	N/A