Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Dokuya özgü nöral kök hücreler (NSC'ler) memeli doğum sonrası beyninde aktif kalır. Yeni nöronlar ve glia ürettikleri özel nişlerde bulunurlar. Böyle bir niş, lateral ventriküllerin lateral duvarları boyunca, ependimal hücre tabakasına bitişik olan subependimal bölgedir (SEZ; ventriküler-subventriküler bölge olarak da adlandırılır). Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), oligodendrositler üretebilen bir proliferatif progenitör hücre havuzu oluşturarak, merkezi sinir sistemi boyunca bol miktarda dağılmıştır.
Hem NSC'ler hem de OPC'ler kendi kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik/aktivasyon döngüleri sergiler. Konumları nedeniyle, bu hücrelerin izolasyonu ve deneysel incelemesi postmortem olarak gerçekleştirilir. Burada, diğer hücrelerin yanı sıra NSC'lerin ve OPC'lerin canlı hayvanlardan izolasyonu için bir yöntem olan "beyin sağımını" ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, kemirgenlerde kullanılmak üzere tasarlanmış ve sıçanlarda test edilmiş iki aşamalı bir protokoldür. İlk olarak, hücreler stereotaksik intraserebroventriküler (i.c.v.) bir "serbest bırakma kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "salınır". Ana bileşenler, ependimal hücreleri hedef alan ve ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen nöraminidaz, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü-2'dir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanlarda bir insizyona gerek kalmadan cisterna magna'dan gerçekleştirilir.
Burada sunulan sonuçlar, izole hücrelerin endojen profillerini koruduğunu ve SEZ'in NSC'lerinin sessizliklerini koruduğunu göstermektedir. Ependimal tabakanın denüdasyonu, enjeksiyonun anatomik seviyesi ile sınırlıdır ve protokol (serbest bırakma ve toplama) hayvanlar tarafından iyi tolere edilir. Bu yeni yaklaşım, deney hayvanlarında endojen nörojenez ve gliogenez ile ilgili uzunlamasına çalışmaların yapılmasının yolunu açmaktadır.
Giriş
Dokuya özgü kök hücreler, ilgili dokuları oluşturan tüm hücre popülasyonlarına yol açabilen kısmen bağlı hücrelerdir. Multipotent olmalarının yanı sıra, kendi kendini yenileyen hücrelerdir ve homeostazı ve dokuların rejeneratif kapasitesini korumak için çok önemlidir1. Bazı dokuya özgü kök hücreler, bağırsak veya hematopoetik kök hücreler gibi aktif, güçlü bir şekilde proliferatif bir durumda kalır. Beyin kök hücreleri gibi diğerleri büyük ölçüde hareketsiz veya uykuda kalır2. Yetişkin beyninde, nöral kök hücreler (NSC'ler), genellikle niş adı verilen özel alanlarda bulunabilir. Lateral ventriküllerin subependimal bölgesinde (SEZ) ve hipokampusun dentat girusunda bu kadar iyi tanımlanmış iki alan bulunur. SEZ nişi, başta koku soğancıklarına doğru göç eden ve yerel internöron popülasyonuna katkıda bulunan nöroblastlar olmak üzere en yüksek sayıda hücre üretir; Buna karşılık, üretilen oligodendroblastlar bitişik korpus kallozuma (CC) göç eder3. Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), merkezi sinir sistemi boyunca yaygın olarak dağılmış mitotik olarak aktif hücrelerdir: i) oligodendroglial soya bağlıdır, ii) demiyelinizasyon bölgelerine göç edebilir ve iii) miyelinizan oligodendrositlere farklılaşabilir. OPC'ler ayrıca kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik sergiler4.
Şimdiye kadar, NSC'lerin ve OPC'lerin izolasyonu ve çalışması, diseke beyin ve omurilik dokusunun postmortem ayrışmasını gerektiriyordu. Bu deneysel sınırlamayı aşmak için, ilk kez beyin NSC'lerinin ve OPC'lerinin canlı hayvanlardan izole edilmesine izin veren bir yöntem oluşturduk. Bu yönteme "sağım" diyoruz, çünkü havuzları tükenmediği için birden fazla hücre toplanmasına olanak tanır. Protokol, büyük beyin boyutlarından dolayı, esas olarak SEZ veya CC'yi hedef alan sıçanlarda geliştirilmiştir ve iki ana adım içermektedir. İlk olarak, NSC'ler veya OPC'ler, nöraminidaz içeren bir "salım kokteyli", ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen bir toksin, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) içeren bir "salım kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "çıkarılır". Kokteyl, lateral ventriküller içinde bilateral olarak stereotaksik olarak enjekte edilir. Kullanım amacı NSC'lerin izolasyonu ise, lateral ventriküllerin rostral alanları hedeflenir. Amaç OPC'leri daha saf bir şekilde izole etmekse, kokteyl hipokampal fimbria bölgesine kaudal olarak enjekte edilir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının (BOS) sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanların sarnıç magnasından bir insizyona gerek kalmadan gerçekleştirilir. Likit biyopsi NSC kültür besiyeri ile karıştırılır ve kaplamaya kadar 4 °C'de tutulabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan ıslahı, bakımı ve deneysel prosedürler, İçişleri Bakanlığı tarafından yetkilendirilen 1986 tarihli Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve Yunanistan Cumhuriyeti'nin 56/2013 sayılı Başkanlık Kararnamesi uyarınca yürütülmüş, Cambridge ve Patras Üniversitelerinin Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Organları tarafından incelenmiş ve yerel Valilik Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve incelenmiştir (Protokol numarası: 5675/39/18-01-2021). Yaşları 2 ile 4 ay arasında değişen ve vücut ağırlıkları 150 g ile 250 g arasında olan erkek ve dişi Sprague-Dawley, Wistar ve Long-Evans sıçanları kullanıldı. Protokol, Şekil 1'de grafiksel olarak özetlenmiştir.
1. Kokteyl hazırlığını serbest bırakın
NOT: İşlem günü taze olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Miktarlar, her bir lateral ventriküle enjekte edilecek 2 μL başına i.c.v. başına verilir. Amaçlanan enjeksiyon başına ek 1 μL hazırlayın.
- Clostridium perfringens'ten (Clostridium welchii) 0.5 μL 500 mU nöraminidaz hazırlayın.
NOT: Bunu -1 °C'de steril suda seyreltilmiş 20 U/μL stok olarak saklayın. Diğer nöraminidaz türleri test edilmemiştir. - 1 μg integrin-β1-bloke edici antikor içeren 1 μL hazırlayın.
NOT: 4 °C'de saklayın. - 0.5 μg bazik fibroblast büyüme faktörü (rekombinant insan FGF-bazik) içeren 0.5 μL hazırlayın.
NOT: -20 °C'de steril suda seyreltilmiş 1 μg/μL stok olarak saklayın.
2. Serbest bırakma kokteyli enjeksiyonu
NOT: Tüm işlem 20 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik ile temizleyin (örneğin, %3 veya %6 hidrojen peroksit). Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.
- Deney hayvanını izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve% 2 idame). Kornea refleksini, uyaranlara tepkiyi (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum modunu kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın.
NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Derin anestezi, kornea refleksi, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli kontrol edilerek doğrulandı. - Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
- Fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin.
- Başın kürkünü bir ustura ile tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın. Kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
- Steril bir neşter kullanarak orta çizgi boyunca başın derisinde 2 cm'lik bir kesi yapın.
- Steril bezler ve steril salin kullanarak kafatasını titizlikle temizleyin.
- Stereotaksik cihaza monte edilmiş 10 μL'lik bir Hamilton şırıngasının iğnesinin kenarını kullanarak bregmayı tanımlayın. Bregma'yı "nokta 0,0" olarak ayarlayın.
NOT: Bregma, sagital ve koronal sütürler arasındaki kesişme noktası olarak tanımlanır. Daha fazla ayrıntı Paxinos ve Watson5'in sıçan beyni atlasında bulunabilir. - Cihazı ön arka (AP) = 0.3 mm, yanal (L) = +1.2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarına taşıyın.
- Bir diş matkabı kullanarak 1 mm'lik bir çapak deliği açın.
NOT: Elle delerken, kortikal yüzeye zarar vermemeye dikkat edin. Kanamanın önemli olması beklenmez. Kanı tuzlu suyla temizleyin ve daha kalıcı kanamayı durdurmak için basınç uygulayın. - 10 μL'lik Hamilton şırıngasına 4 μL serbest bırakma kokteyli yükleyin.
- Dura ile temas etmek için Hamilton şırıngasının iğnesini (tercihen künt veya konik kenar) indirin.
- İğneyi istenen derinlikte (D = 3,5 mm) yerleştirin.
NOT: Dokuyu nemli tutmak için dura yüzeyine salin dökün. - 2 μL salım kokteylini 1 μL/dk oranında infüze edin.
- Serbest bırakma kokteylinin yüzeye çıkmasını önlemek için yavaş alımdan önce iğneyi 2 dakika daha yerinde bırakın.
- AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarındaki diğer yarım küre için 2.8-2.14 adımlarını tekrarlayın.
- Kesiyi 5-0 naylon (çap 0,1 mm) ile dikin ve dikişli bölgeyi antiseptik ile temizleyin.
- Anestezik sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.- İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) ancak tam iyileşmeyi onayladıktan sonra iade edin.
- Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Analjezi (örneğin, 0.3 mg / mL buprenorfin, deri altı) uygulayarak ağrı belirtilerini (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) ele alın. Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.
3. Beyin omurilik sıvısı (BOS) sıvı biyopsisi
NOT: Tüm işlem 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen sıvı biyopsi, salım kokteylinin enjeksiyonundan 3 gün sonra gerçekleştirilir, ancak gerektiğinde tam olarak aynı şekilde yapılabilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik (örn. %3 veya %6 hidrojen peroksit) ile temizleyin. Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.
- Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve bakım için% 2). Korneayı kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın
refleks, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli.
NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Bununla birlikte, prosedür kısa olduğu için, özellikle biyopsiler ardışık günlerde birden çok kez yapılacaksa, bu tavsiye edilmez. - Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
- Deney hayvanını stereotaksik çerçeveye monte edin. Öne ve arkaya doğru dönme hareketini engellemeden kafayı sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın.
- Boynun arkasının iyi bir şekilde uzaması sağlanabilmesi için kafayı aşağı doğru 40° açıyla sabitleyin.
NOT: Bunu yapmanın bir yolu, cihazınağız çubuğunu kullanmaktır 6. - Bir jilet kullanarak boyun bölgesindeki kürkü tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın.
- Parmak ucuyla, oksipital çıkıntı ile atlas6'nın omurgası arasında yer alan eşkenar dörtgen şeklindeki bastırılabilir alanı bulun.
- Bir nokta işareti çizin (örneğin, bir işaretleyici kullanarak).
- Stereotaksik çerçeveye 1 mL veya 0.5 mL'lik bir şırınga sabitleyin.
NOT: Daha iyi emiş sağladıkları ve daha az ölü hacme sahip oldukları için çıkarılamayan iğneli şırıngaların kullanılması tavsiye edilir. - İğneyi nokta işaretindeki cilt ile temas noktasına getirin.
- Bir çift forseps ile, şırıngayı cilt katmanlarından indirirken cildi kaldırın.
- Şırıngada negatif basınç oluşturmak için pistonu hafifçe geri çekin.
- Şırıngada sıvı (BOS) görünene kadar iğneyi çok yavaş daldırmak için yeniden başlatın.
- İğneyi bu pozisyona yerleştirin ve BOS'un yavaş akışına izin verin.
NOT: BOS akışı çok yavaşsa iğne hafifçe alçaltılabilir veya yükseltilebilir. - BOS'u 120 μL'ye kadar yavaşça (40 μL/dk'lık adımlarla) çıkarmaya başlayın.
- Şırıngayı yavaşça alın.
- Deney hayvanının sıvı yenilenmesini desteklemek için intraperitoneal olarak 1 mL normal serum uygulayın.
- Sıvı biyopsiyi (BOS) 400 μL NSC ortamı ile karıştırın ve mikrosantrifüj tüpünü daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de tutun.
NOT: Likit biyopsiler dondurulmamışsa 3 saat içinde işlenmelidir. - Anesteziyi sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.- İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı, ancak tam iyileşme onaylandıktan sonra kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) iade edin.
- Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Ağrı belirtileri (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) gözlenirse, analjezi uygulayın (ör., deri altından 0.3 mg / mL buprenorfin). Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.
4. İmmünofloresan için dokunun işlenmesi
- Hayvanı 20 mL buz gibi soğuk salinin intrakardiyal infüzyonu ve ardından 50 mL buz soğuk% 4 paraformaldehit (PFA; pH = 7.4 fosfat tamponlu salin [PBS] içinde) ile ötenazi yapın.
- Beyin dokusunu inceleyin.
- Servikal bölgede bir kesim yapmak için makas kullanarak kafayı vücuttan ayırın. Cildi çıkarmak için makası kullanın ve ardından beyin dokusuna zarar vermemek için makasın uçları yukarı bakacak şekilde kafatasının kemiğini sagital orta hat boyunca kesin. Koronal orta çizgiyi geçerek mümkün olduğunca kesmeye devam etmeyi hedefleyin.
- Supraoksipital ve parietal kemiklerden ve son olarak frontal kemiklerden başlayarak kemikleri çıkarmak için forseps kullanın.
- Beyin dokusu ortaya çıktığında, kafatasından çıkarmak için forseps veya bir spatula kullanın. Bunu kolaylaştırmak için, istenmiyorsa beynin tabanındaki sinirleri ve koku soğancıklarını kesin.
- Dokuyu gece boyunca 4 ° C'de% 2 PFA'da sabitleyin.
- Dokuyu %30 sükroz (PBS'de) içinde 4 ° C'de en az 48 saat boyunca doku dibe çökene kadar kriyo ile koruyun.
- Dokuyu -80 °C'de dondurun.
- Beyin dokusunu bir kriyostat ile 14 μm kalınlığında koronal bölümlere kesin.
- Standart protokolleri kullanarak immünofloresan boyama gerçekleştirin 3,7
- Bölümleri bloke edici tampon (% 3 sığır serum albümini [BSA,,% 0.1 Triton X-100, PBS'de) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Antijen alımını gerçekleştirin (10 mM sitrat tamponunda 15 dakika kaynatma, pH = 6.0, cam kavanozlar kullanarak).
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır, ancak nükleer antijenler için gereklidir. - Oda sıcaklığına getirin ve 4 ° C'de gece boyunca bloke edici tamponda glial fibriler asidik protein (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β ve β-katenine ( Malzeme Tablosuna bakınız) karşı birincil antikorlarla inkübe edin.
- Oda sıcaklığında nükleer karşı boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile PBS'de ikincil antikorlarla 2 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Lamelleri monte edin.
5. İmmünofloresan için izole edilmiş hücrelerin işlenmesi
- Hücreleri, poli-D-lizin (100 μg / mL) ile kaplanmış, mikroskopi için uyumlu 96 oyuklu plakalara yerleştirin.
- Hücreleri buz gibi soğuk% 2 PFA'da 10 dakika sabitleyin ve 3x'i PBS ile yıkayın.
- PDGFRa, GFAP, Dcx,SOX2 ve ID3 için standart prosedürleri 3,7 kullanarak immünofloresan uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de PBS + NaN3'te (% 0.1) tutun.
6. Mikroskopi ve görüntü analizi
- Epifloresan veya konfokal mikroskopi kullanarak görüntü alın ve hücre sayaçları gibi standart görüntü analizi yazılım araçlarını kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
NSC'lerin serbest bırakılması ve toplanması
SEZ'in NSC'leri, BOS'tan sadece ependimal hücrelerin tek tabakası ile ayrılır, ancak enterkalasyon mono-siliyer süreçler yoluyla ventriküler içerikle doğrudan temas halinde kalırlar 8,9. Nöraminidaz, sialik asit kalıntılarının bölünmesi yoluyla spesifik olarak ependimal hücrelere etki eder ve ventriküler duvarın denudasyonunu indükleyebilir. Bu, ventrikül yüzeyinde nöroblast kümelen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kök ve progenitör hücreler, memeli beyin dokusunda nispeten seyrektir. Ek olarak, NSC'ler kolay ve güvenli biyopsiler için erişilemeyen alanlarda (ventriküler duvarlar, hipokampus) bulunur. Bu nedenle, şimdiye kadar bu tür hücrelerle deneysel olarak çalışmanın tek yolu, ölüm sonrası izolasyonları olmuştur. Sağım adı verilen, canlı sıçanlardan NSC'lerin ve OPC'lerin tek veya tekrarlanan toplanmasına izin veren bir yöntem burada adım adım açıklanmaktadır. Yöntem iki temel özelliğe dayanmaktadır: i) NSC'ler veya OPC'ler, be...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan etmek için rekabet eden mali çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, R.J.M.F. ve I.K.'ye Action Medical Research (UK) hibesi (GN2291) ile desteklenmiştir. Araştırma çalışması, Yunanistan Araştırma ve Yenilik Vakfı (H.F.R.I.) tarafından "Öğretim Üyelerini ve Araştırmacıları desteklemek için H.F.R.I. Araştırma Projeleri ve Yüksek Maliyetli Araştırma Ekipmanı Hibesi Alımı için Birinci Çağrı" (Proje No: 3395) kapsamında kısmen desteklenmiştir (hayvan maliyetleri ve D.D.'ye destek).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Serbest kokteyl | |||
| beta; 1-integrin bloke edici antikor | BD Biosciences | # 555002 | saflaştırılmış NA / LE Hamster Anti-Rat CD29 Klonu Ha2 / 5, 1 mg / mL. Bloke edici aktiviteye sahip herhangi bir abntibody uygun olmalıdır. |
| Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich'ten | nöraminidaz#N2876 Diğer kaynaklardan (örneğin, Vibrio cholerae'den) nöraminidalar test edilmemiştir. | |
| Rekombinant İnsan FGF-temel (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B, | 1 &mu olarak tutulur; g/μ L stoğu, steril suda -20 ° C'de seyreltilmiş; C |
| Cerrahi işlemler | |||
| 10 ve mikro; L Şırınga | Hamilton | # 80330 | Model 701 RN, Küçük Çıkarılabilir İğne, 26s gauge, 2 inç, nokta stili 2 |
| BD Mikro ince 1 mL insülin şırıngaları | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE KESİMİ. SOL %10 FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | STOK KODU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofin 0.3 mg/mL) |
| Dijital Yeni Standart Stereotaksik, Sıçan ve Fare | Çalma | 51500D | |
| Homeotermik İzleme Sistemi | Harvard Aparatı | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1.000 mg/g inhalasyon buharı, sıvı | Vetpharma Hayvan Sağlığı | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Ketamin 100 mg/mL |
| Naylon sütür, Ethilon | Ethicon | D9635 | Şeffaf, boyut 5-0 |
| Şarj Edilebilir Akülü Cerrahi Düzelticiler | Çalıntı | Ürün:51472 | |
| Neşter bıçakları, steril | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8 inç Swablar | Birchwood Laboratuvarları | 34-7021-12P | |
| Stereotaksik Yüksek Hızlı Matkap | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Çalma ' s Stereotaksik Alet | Kiti Çalmak | Ürün: 52189 | |
| Xylan% 2 | Chanelle İlaç | 13764 / 03 / 19-5-2004 | Ksilazin, 25 mL |
| < güçlü > doku ve hücre işleme ve immün boyamalar< / mikroskopi | |||
| 96 oyuklu plakalar | Greiner | # 655866 | Ekran yıldızı |
| mikroplaka B27 takviyesi | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraksiyon V, ısı şoku |
| Sitrat | Merck | 71497 | Sodyum sitrat monobazik |
| Kriyostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nükleer boyama, Seyreltme: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Bilimsel | 11995065 | Yüksek glikoz, piruvat |
| eşek anti-keçi | Biotium | 20016 veya 20106 veya 20048 | Seyreltme: 1/1.000 |
| eşek anti-fare | Biotium | 20014 veya 20105 veya 20046 | Seyreltme: 1/1.000 |
| eşek anti-tavşan | Biotium | 20015 veya 20098 veya 20047 | Seyreltme: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (veya bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| keçi anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Seyreltme: 1/500 |
| keçi anti-SOX2 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-17320 | Seyreltme: 1/200 |
| fare anti-ID3 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-56712 | Seyreltme: 1/200 |
| fare anti-S100 ve beta; | Sigma | S2532 | Seyreltme: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Montaj ortamı |
| N2 takviyesi | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poli-D-Lizin | Merck, Millipore | A-003-E | Çözeltisi, 1.0 mg / mL |
| tavşan anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Seyreltme: 1/500 |
| tavşan anti-PDGFR ve alfa; | Abcam | ab51875 | Seyreltme: 1/200 |
| tavşan anti-β- katenin | Abcam | ab16051 | Seyreltme: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Mikroskopi ve görüntü analizi | |||
| Konfokal mikroskop | Leica | SP6 ve SP8 | |
| Görüntü analizi | NIH, ABD | ImageJ | |
| Görüntü analizi | Leica | LasX |
Kaynaklar
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
