Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Özet

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Özet

Dokuya özgü nöral kök hücreler (NSC'ler) memeli doğum sonrası beyninde aktif kalır. Yeni nöronlar ve glia ürettikleri özel nişlerde bulunurlar. Böyle bir niş, lateral ventriküllerin lateral duvarları boyunca, ependimal hücre tabakasına bitişik olan subependimal bölgedir (SEZ; ventriküler-subventriküler bölge olarak da adlandırılır). Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), oligodendrositler üretebilen bir proliferatif progenitör hücre havuzu oluşturarak, merkezi sinir sistemi boyunca bol miktarda dağılmıştır.

Hem NSC'ler hem de OPC'ler kendi kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik/aktivasyon döngüleri sergiler. Konumları nedeniyle, bu hücrelerin izolasyonu ve deneysel incelemesi postmortem olarak gerçekleştirilir. Burada, diğer hücrelerin yanı sıra NSC'lerin ve OPC'lerin canlı hayvanlardan izolasyonu için bir yöntem olan "beyin sağımını" ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, kemirgenlerde kullanılmak üzere tasarlanmış ve sıçanlarda test edilmiş iki aşamalı bir protokoldür. İlk olarak, hücreler stereotaksik intraserebroventriküler (i.c.v.) bir "serbest bırakma kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "salınır". Ana bileşenler, ependimal hücreleri hedef alan ve ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen nöraminidaz, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü-2'dir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanlarda bir insizyona gerek kalmadan cisterna magna'dan gerçekleştirilir.

Burada sunulan sonuçlar, izole hücrelerin endojen profillerini koruduğunu ve SEZ'in NSC'lerinin sessizliklerini koruduğunu göstermektedir. Ependimal tabakanın denüdasyonu, enjeksiyonun anatomik seviyesi ile sınırlıdır ve protokol (serbest bırakma ve toplama) hayvanlar tarafından iyi tolere edilir. Bu yeni yaklaşım, deney hayvanlarında endojen nörojenez ve gliogenez ile ilgili uzunlamasına çalışmaların yapılmasının yolunu açmaktadır.

Giriş

Dokuya özgü kök hücreler, ilgili dokuları oluşturan tüm hücre popülasyonlarına yol açabilen kısmen bağlı hücrelerdir. Multipotent olmalarının yanı sıra, kendi kendini yenileyen hücrelerdir ve homeostazı ve dokuların rejeneratif kapasitesini korumak için çok önemlidir¹. Bazı dokuya özgü kök hücreler, bağırsak veya hematopoetik kök hücreler gibi aktif, güçlü bir şekilde proliferatif bir durumda kalır. Beyin kök hücreleri gibi diğerleri büyük ölçüde hareketsiz veya uykuda kalır². Yetişkin beyninde, nöral kök hücreler (NSC'ler), genellikle niş adı verilen özel alanlarda bulunabilir. Lateral ventriküllerin subependimal bölgesinde (SEZ) ve hipokampusun dentat girusunda bu kadar iyi tanımlanmış iki alan bulunur. SEZ nişi, başta koku soğancıklarına doğru göç eden ve yerel internöron popülasyonuna katkıda bulunan nöroblastlar olmak üzere en yüksek sayıda hücre üretir; Buna karşılık, üretilen oligodendroblastlar bitişik korpus kallozuma (CC) göç ^eder3. Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler), merkezi sinir sistemi boyunca yaygın olarak dağılmış mitotik olarak aktif hücrelerdir: i) oligodendroglial soya bağlıdır, ii) demiyelinizasyon bölgelerine göç edebilir ve iii) miyelinizan oligodendrositlere farklılaşabilir. OPC'ler ayrıca kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik sergiler⁴.

Şimdiye kadar, NSC'lerin ve OPC'lerin izolasyonu ve çalışması, diseke beyin ve omurilik dokusunun postmortem ayrışmasını gerektiriyordu. Bu deneysel sınırlamayı aşmak için, ilk kez beyin NSC'lerinin ve OPC'lerinin canlı hayvanlardan izole edilmesine izin veren bir yöntem oluşturduk. Bu yönteme "sağım" diyoruz, çünkü havuzları tükenmediği için birden fazla hücre toplanmasına olanak tanır. Protokol, büyük beyin boyutlarından dolayı, esas olarak SEZ veya CC'yi hedef alan sıçanlarda geliştirilmiştir ve iki ana adım içermektedir. İlk olarak, NSC'ler veya OPC'ler, nöraminidaz içeren bir "salım kokteyli", ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen bir toksin, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) içeren bir "salım kokteyli" enjeksiyonu yoluyla dokudan "çıkarılır". Kokteyl, lateral ventriküller içinde bilateral olarak stereotaksik olarak enjekte edilir. Kullanım amacı NSC'lerin izolasyonu ise, lateral ventriküllerin rostral alanları hedeflenir. Amaç OPC'leri daha saf bir şekilde izole etmekse, kokteyl hipokampal fimbria bölgesine kaudal olarak enjekte edilir. İkinci bir "toplama" adımında, beyin omurilik sıvısının (BOS) sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanların sarnıç magnasından bir insizyona gerek kalmadan gerçekleştirilir. Likit biyopsi NSC kültür besiyeri ile karıştırılır ve kaplamaya kadar 4 °C'de tutulabilir.

Protokol

Hayvan ıslahı, bakımı ve deneysel prosedürler, İçişleri Bakanlığı tarafından yetkilendirilen 1986 tarihli Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası ve Yunanistan Cumhuriyeti'nin 56/2013 sayılı Başkanlık Kararnamesi uyarınca yürütülmüş, Cambridge ve Patras Üniversitelerinin Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Organları tarafından incelenmiş ve yerel Valilik Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve incelenmiştir (Protokol numarası: 5675/39/18-01-2021). Yaşları 2 ile 4 ay arasında değişen ve vücut ağırlıkları 150 g ile 250 g arasında olan erkek ve dişi Sprague-Dawley, Wistar ve Long-Evans sıçanları kullanıldı. Protokol, Şekil 1'de grafiksel olarak özetlenmiştir.

1. Kokteyl hazırlığını serbest bırakın

NOT: İşlem günü taze olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Miktarlar, her bir lateral ventriküle enjekte edilecek 2 μL başına i.c.v. başına verilir. Amaçlanan enjeksiyon başına ek 1 μL hazırlayın.

1. Clostridium perfringens'ten (Clostridium welchii) 0.5 μL 500 mU nöraminidaz hazırlayın.
   NOT: Bunu -1 °C'de steril suda seyreltilmiş 20 U/μL stok olarak saklayın. Diğer nöraminidaz türleri test edilmemiştir.
2. 1 μg integrin-β1-bloke edici antikor içeren 1 μL hazırlayın.
   NOT: 4 °C'de saklayın.
3. 0.5 μg bazik fibroblast büyüme faktörü (rekombinant insan FGF-bazik) içeren 0.5 μL hazırlayın.
   NOT: -20 °C'de steril suda seyreltilmiş 1 μg/μL stok olarak saklayın.

2. Serbest bırakma kokteyli enjeksiyonu

NOT: Tüm işlem 20 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik ile temizleyin (örneğin, %3 veya %6 hidrojen peroksit). Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.

1. Deney hayvanını izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve% 2 idame). Kornea refleksini, uyaranlara tepkiyi (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum modunu kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın.
   NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Derin anestezi, kornea refleksi, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli kontrol edilerek doğrulandı.
2. Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
3. Fareyi stereotaksik çerçeveye monte edin.
4. Başın kürkünü bir ustura ile tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın. Kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
5. Steril bir neşter kullanarak orta çizgi boyunca başın derisinde 2 cm'lik bir kesi yapın.
6. Steril bezler ve steril salin kullanarak kafatasını titizlikle temizleyin.
7. Stereotaksik cihaza monte edilmiş 10 μL'lik bir Hamilton şırıngasının iğnesinin kenarını kullanarak bregmayı tanımlayın. Bregma'yı "nokta 0,0" olarak ayarlayın.
   NOT: Bregma, sagital ve koronal sütürler arasındaki kesişme noktası olarak tanımlanır. Daha fazla ayrıntı Paxinos ve Watson^5'in sıçan beyni atlasında bulunabilir.
8. Cihazı ön arka (AP) = 0.3 mm, yanal (L) = +1.2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarına taşıyın.
9. Bir diş matkabı kullanarak 1 mm'lik bir çapak deliği açın.
   NOT: Elle delerken, kortikal yüzeye zarar vermemeye dikkat edin. Kanamanın önemli olması beklenmez. Kanı tuzlu suyla temizleyin ve daha kalıcı kanamayı durdurmak için basınç uygulayın.
10. 10 μL'lik Hamilton şırıngasına 4 μL serbest bırakma kokteyli yükleyin.
11. Dura ile temas etmek için Hamilton şırıngasının iğnesini (tercihen künt veya konik kenar) indirin.
12. İğneyi istenen derinlikte (D = 3,5 mm) yerleştirin.
    NOT: Dokuyu nemli tutmak için dura yüzeyine salin dökün.
13. 2 μL salım kokteylini 1 μL/dk oranında infüze edin.
14. Serbest bırakma kokteylinin yüzeye çıkmasını önlemek için yavaş alımdan önce iğneyi 2 dakika daha yerinde bırakın.
15. AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (SEZ'yi hedeflemek için) veya AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (CC'yi hedeflemek için) koordinatlarındaki diğer yarım küre için 2.8-2.14 adımlarını tekrarlayın.
16. Kesiyi 5-0 naylon (çap 0,1 mm) ile dikin ve dikişli bölgeyi antiseptik ile temizleyin.
17. Anestezik sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
    NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.
    1. İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) ancak tam iyileşmeyi onayladıktan sonra iade edin.
    2. Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Analjezi (örneğin, 0.3 mg / mL buprenorfin, deri altı) uygulayarak ağrı belirtilerini (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) ele alın. Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.

3. Beyin omurilik sıvısı (BOS) sıvı biyopsisi

NOT: Tüm işlem 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen sıvı biyopsi, salım kokteylinin enjeksiyonundan 3 gün sonra gerçekleştirilir, ancak gerektiğinde tam olarak aynı şekilde yapılabilir. Ameliyatı aseptik koşullarda yapmaya özen gösterin. Tüm yüzeyleri antiseptik (örn. %3 veya %6 hidrojen peroksit) ile temizleyin. Otoklavlanmış veya kolayca steril aletler, eldivenler, önlükler ve örtüler kullanın.

1. Hayvanı izofluran inhalasyonu ile uyuşturun (indüksiyon için% 2.5 ve bakım için% 2). Korneayı kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın
   refleks, uyaranlara tepki (arka bacak ve kuyruk sıkışma testi) ve solunum şekli.
   NOT: Cerrahi prosedürler, intraperitoneal olarak enjekte edilebilir anestezi ile indüklenen genel anestezi altında yapılabilir (ör., ketamin [40 mg / kg] ve ksilazin [10 mg / kg]). Bununla birlikte, prosedür kısa olduğu için, özellikle biyopsiler ardışık günlerde birden çok kez yapılacaksa, bu tavsiye edilmez.
2. Anestezi indüksiyonu üzerine subkutan analjezi uygulayın (ör., 0.3 mg / mL buprenorfin).
3. Deney hayvanını stereotaksik çerçeveye monte edin. Öne ve arkaya doğru dönme hareketini engellemeden kafayı sabitlemek için kulak çubuklarını kullanın.
4. Boynun arkasının iyi bir şekilde uzaması sağlanabilmesi için kafayı aşağı doğru 40° açıyla sabitleyin.
   NOT: Bunu yapmanın bir yolu, cihazın^{ağız çubuğunu kullanmaktır 6}.
5. Bir jilet kullanarak boyun bölgesindeki kürkü tıraş edin ve cildi% 10 povidon-iyot çözeltisi ve ardından alkol gibi antiseptiklerle temizleyin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak antiseptiği üç kez uygulayın. Her seferinde 3-5 saniye dairesel hareketlerle ovalayın.
6. Parmak ucuyla, oksipital çıkıntı ile atlas^6'nın omurgası arasında yer alan eşkenar dörtgen şeklindeki bastırılabilir alanı bulun.
7. Bir nokta işareti çizin (örneğin, bir işaretleyici kullanarak).
8. Stereotaksik çerçeveye 1 mL veya 0.5 mL'lik bir şırınga sabitleyin.
   NOT: Daha iyi emiş sağladıkları ve daha az ölü hacme sahip oldukları için çıkarılamayan iğneli şırıngaların kullanılması tavsiye edilir.
9. İğneyi nokta işaretindeki cilt ile temas noktasına getirin.
10. Bir çift forseps ile, şırıngayı cilt katmanlarından indirirken cildi kaldırın.
11. Şırıngada negatif basınç oluşturmak için pistonu hafifçe geri çekin.
12. Şırıngada sıvı (BOS) görünene kadar iğneyi çok yavaş daldırmak için yeniden başlatın.
13. İğneyi bu pozisyona yerleştirin ve BOS'un yavaş akışına izin verin.
    NOT: BOS akışı çok yavaşsa iğne hafifçe alçaltılabilir veya yükseltilebilir.
14. BOS'u 120 μL'ye kadar yavaşça (40 μL/dk'lık adımlarla) çıkarmaya başlayın.
15. Şırıngayı yavaşça alın.
16. Deney hayvanının sıvı yenilenmesini desteklemek için intraperitoneal olarak 1 mL normal serum uygulayın.
17. Sıvı biyopsiyi (BOS) 400 μL NSC ortamı ile karıştırın ve mikrosantrifüj tüpünü daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de tutun.
    NOT: Likit biyopsiler dondurulmamışsa 3 saat içinde işlenmelidir.
18. Anesteziyi sağlayan maskeyi çıkarın ve hayvanı operasyon sonrası izleme alanına aktarın.
    NOT: Anesteziden iyileşme ve yaslanmanın sürdürülmesi 5-10 dakika içinde ve tam iyileşme (normal davranış) 25 dakika içinde gerçekleşmelidir.
    1. İyi ısıtılmış (24-25 °C), hava yollarını tıkayabilecek küçük parçacıklı yatakların olmadığı sessiz bir alanda iyileşmeyi (canlı ve kesintisiz hareket, suya sık erişim) yakından izleyin. Hayvanı, ancak tam iyileşme onaylandıktan sonra kafes arkadaşlarının şirketine (yeni hayvanlara değil) iade edin.
    2. Ameliyattan sonra hayvanı bakım tesisinde en az 48 saat izleyin. Ağrı belirtileri (başın gizlenmesi, anormal baş veya vücut duruşu, aşırı duyarlılık ve aşırı uyarılabilirlik) gözlenirse, analjezi uygulayın (ör., deri altından 0.3 mg / mL buprenorfin). Rengi solmuş veya kürkü dikilmiş hayvanları sorumlu veterinere yönlendirin.

4. İmmünofloresan için dokunun işlenmesi

1. Hayvanı 20 mL buz gibi soğuk salinin intrakardiyal infüzyonu ve ardından 50 mL buz soğuk% 4 paraformaldehit (PFA; pH = 7.4 fosfat tamponlu salin [PBS] içinde) ile ötenazi yapın.
2. Beyin dokusunu inceleyin.
   1. Servikal bölgede bir kesim yapmak için makas kullanarak kafayı vücuttan ayırın. Cildi çıkarmak için makası kullanın ve ardından beyin dokusuna zarar vermemek için makasın uçları yukarı bakacak şekilde kafatasının kemiğini sagital orta hat boyunca kesin. Koronal orta çizgiyi geçerek mümkün olduğunca kesmeye devam etmeyi hedefleyin.
   2. Supraoksipital ve parietal kemiklerden ve son olarak frontal kemiklerden başlayarak kemikleri çıkarmak için forseps kullanın.
   3. Beyin dokusu ortaya çıktığında, kafatasından çıkarmak için forseps veya bir spatula kullanın. Bunu kolaylaştırmak için, istenmiyorsa beynin tabanındaki sinirleri ve koku soğancıklarını kesin.
3. Dokuyu gece boyunca 4 ° C'de% 2 PFA'da sabitleyin.
4. Dokuyu %30 sükroz (PBS'de) içinde 4 ° C'de en az 48 saat boyunca doku dibe çökene kadar kriyo ile koruyun.
5. Dokuyu -80 °C'de dondurun.
6. Beyin dokusunu bir kriyostat ile 14 μm kalınlığında koronal bölümlere kesin.
7. Standart protokolleri kullanarak immünofloresan boyama gerçekleştirin ^3,7
   1. Bölümleri bloke edici tampon (% 3 sığır serum albümini [BSA,,% 0.1 Triton X-100, PBS'de) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   2. Antijen alımını gerçekleştirin (10 mM sitrat tamponunda 15 dakika kaynatma, pH = 6.0, cam kavanozlar kullanarak).
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır, ancak nükleer antijenler için gereklidir.
   3. Oda sıcaklığına getirin ve 4 ° C'de gece boyunca bloke edici tamponda glial fibriler asidik protein (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β ve β-katenine ( Malzeme Tablosuna bakınız) karşı birincil antikorlarla inkübe edin.
   4. Oda sıcaklığında nükleer karşı boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile PBS'de ikincil antikorlarla 2 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Lamelleri monte edin.

5. İmmünofloresan için izole edilmiş hücrelerin işlenmesi

1. Hücreleri, poli-D-lizin (100 μg / mL) ile kaplanmış, mikroskopi için uyumlu 96 oyuklu plakalara yerleştirin.
2. Hücreleri buz gibi soğuk% 2 PFA'da 10 dakika sabitleyin ve 3x'i PBS ile yıkayın.
3. PDGFRa, GFAP, Dcx,^{SOX2 ve ID3} için standart prosedürleri ^3,7 kullanarak immünofloresan uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de PBS + NaN_3'te (% 0.1) tutun.

6. Mikroskopi ve görüntü analizi

1. Epifloresan veya konfokal mikroskopi kullanarak görüntü alın ve hücre sayaçları gibi standart görüntü analizi yazılım araçlarını kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin.

Sonuçlar

NSC'lerin serbest bırakılması ve toplanması
SEZ'in NSC'leri, BOS'tan sadece ependimal hücrelerin tek tabakası ile ayrılır, ancak enterkalasyon mono-siliyer süreçler yoluyla ventriküler içerikle doğrudan temas halinde kalırlar ^8,9. Nöraminidaz, sialik asit kalıntılarının bölünmesi yoluyla spesifik olarak ependimal hücrelere etki eder ve ventriküler duvarın denudasyonunu indükleyebilir. Bu, ventrikül yüzeyinde nöroblast kümelenmesine yol açar^10,11. Ayrıca, i.c.v. bir integrin-β1-bloke edici antikorun enjeksiyonundan sonra, muhtemelen inter-ependimal hücre bağlantılarının^{gevşemesi nedeniyle BOS'ta bir} nöroblast akışı gözlenmiştir 12. Bu gözlemler, lateral ventrikül duvarlarının bütünlüğünün kontrollü bir şekilde tehlikeye atılması yoluyla beynin kök ve progenitör hücrelerinin izolasyonunu sağlayan bir protokolün geliştirilmesine yol açmıştır. İlk adımda, parankimden salım ve ardından BOS içindeki NSC'lerin veya OPC'lerin akışı, salım kokteylinin i.c.v. enjeksiyonu yoluyla indüklenir. Kokteyl, lateral ventriküllere bilateral olarak (enjeksiyon başına 2 μL) 1 μL/dk hızında stereotaksik olarak enjekte edilir (SEZ NSC'leri hedefleyen koordinatlar: AP = 0.3 mm, L = ± 1.2 mm, D = 3.5 mm; CC OPC'leri hedefleyen koordinatlar: AP = 1.5 mm, L = ± 2 mm, D = 3.5 mm). İkinci ("toplama") adım, cisterna magna'dan BOS sıvı biyopsilerinin performansını içerir. Sıçanların uyuşturulması gerekir ve biyopsi 1 mL şırıngalarla yapılabilir. Stereotaksik cihazın kullanımı, insizyonlara gerek kalmadan yaklaşık 100 μL BOS elde etmede neredeyse tam başarı sağlar. Sıvı biyopsi buzlu kültür ortamına eklenir ve <3 saat boyunca kaplamaya kadar 4 ° C'de tutulur (NSC kültür ortamı, Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı [DMEM], B27 takviyesi [% 2], N2 takviyesi [% 1], FGF2 [20 ng / mL] ve epidermal büyüme faktörü [EGF; 20 ng / mL]).

Serbest bırakma kokteylinin enjeksiyonundan sonra periventriküler alanın histolojik değerlendirmesi
İlk deney grubu, 3 μL'den fazla sıvı enjekte edildiğinde, ventriküllerin spesifik olmayan, mekanik yaralanma nedeniyle hasar görebileceğini ortaya koydu (Şekil 2B, C). 2 μL salım kokteylinin yavaş enjeksiyonu, ventriküler yüzeyde Dcx-immünopozitif nöroblast kümelerinin ortaya çıkmasına neden oldu. Bu kümeler enjeksiyondan 8 ay sonra bile görünür kalmıştır (Şekil 2D). Yöntem, hayvanların uzun süreli takibini amaçlayan uzunlamasına çalışmalara yönelik olduğundan, salım kokteylinin neden olduğu doku hasarı değerlendirildi. S100β ve β-katenin 13 gibi ependimal hücre belirteçleri için¹⁴ μm kalınlığındaki kriyostat beyin kesitlerinde immün boyama yapıldı ve ependimal tabakanın genel bütünlüğü değerlendirildi. Ependimal tabakanın denudasyon bölgeleri, enjeksiyonların sadece rostrokaudal seviyesine yakındı, SEZ'nin daha arka ve daha ön bölgelerinde tespit edilen ependimal tabaka bozulmalarında kademeli bir düşüş vardı (Şekil 2E, F) ve enjeksiyon bölgesinden ±2 mm'lik bir mesafeden sonra yok oldu. Yukarıda belirtilen sonuçlar, salım kokteylinin i.c.v. enjeksiyonunun neden olduğu ependimal tabakanın kısmi denudasyonunun fokal olduğunu, enjeksiyon bölgesinin yakınında kısıtlandığını ve periventriküler ependimal tabakanın geri kalanını sağlam bıraktığını göstermektedir.

Toplanan hücrelerin marker profili ve in vitro davranışı
Daha sonra, sağım protokolü ile izole edilen hücrelerin in vitro davranışları ve belirteç profilleri değerlendirildi. Her sıvı biyopsinin ortalama hücre verimi yaklaşık 300 ± 45 hücredir (100 μL biyopsi başına)⁷. Sağım biyopsileri, ortalama 3.17 ± 0.45 geçiş potansiyeline sahip NSC kültürleri ile sonuçlandı. Salin enjekte edilen sıçanlardan izole edilen hücreler ortalama 1.92 ± 0.76 kez geçilebilir; Buna karşılık, sağım yoluyla izole edilenler dokuz pasaja bile ulaştı (p = 0.038, t testi) (Şekil 3A)⁷. Standart postmortem, SEZ kaynaklı nörosfer kültürlerinin ortalama geçiş kapasitesi elimizdeki 12 pasajdan daha yüksektir. SEZ NSC'lerin in vivo genişleme potansiyelinin, in vivo hücre-kader haritalama deneyleri¹⁴ tarafından ortaya konduğu gibi, sınırlı olduğu gösterildiğinden, sağım, endojen NSC'lerin davranışına çok daha yakın olsa da, standart kültürlerdeki hücrelerden önemli ölçüde farklı in vitro davranışa sahip hücreler üretir. Toplanan hücreler poli-D-lizin kaplı kuyucuklara kaplandı, burada hem yapışık tek tabakalar olarak hem de daha nadiren nörosferler olarak büyüdüler (Şekil 3B). Astroglial belirteç GFAP için immünopozitif olan yeni izole edilmiş hücreler (enjeksiyondan 3 gün sonra toplanır ve kaplamadan 24 saat sonra sabitlenir), bir sessizlik belirteci olan ID3 için de immünpozitifti ve NSC bipolar morfolojisi için karakteristiktir (Şekil 3C). Ayrıca, daha önce bildirildiği gibi⁷, biyopsiden türetilen hücrelerin ve aynı hayvanlardan postmortem kaynaklı hücrelerin enjeksiyondan 3 gün sonra daha ayrıntılı bir immünositokimyasal karşılaştırması (GFAP+ astrositleri, Dcx+ nöroblastları, PDGFRa+ oligodendrosit progenitörleri ve nöral soyun SOX2+ hücreleri), toplanan hücrelerin profilinin endojen SEZ hücrelerininkine benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 3D). Özellikle, biyopsi ve doku kaynaklı hücreler farklı koşullarda karşılaştırıldığında (örneğin, FGF2 ile ve FGF2 olmadan bir salım kokteylinin enjeksiyonu), büyüme faktörünün SOX2+ hücrelerinin varlığında eşzamanlı ve önemli bir artışa ve her iki örnekte de Dcx+ nöroblastlarının varlığında önemli bir azalmaya neden olduğu bulunmuştur (Şekil 3D). Bu veriler, NSC'lerin endojen popülasyonlarının profilinde ortaya çıkan herhangi bir değişikliğin, sağım tarafından oluşturulan hücre örneklerinde yansıtıldığını doğruladı.

Şekil 1: Sağımın grafiksel özeti. Bir beyin yarımküresinin ana anatomik işaretlerine sahip bir koronal bölümü (lateral ventrikül, üstteki korpus kallozum ve aşağıdaki ön komissür [gri beyaz madde yolları] ve yan duvarlardaki subependimal bölge [mavi]). Serbest bırakma kokteyli lateral ventriküle enjekte edilir, bu da dokunun bütünlüğünün tehlikeye girmesine ve beyin omurilik sıvısında doğum sonrası beyin nöral kök hücrelerinin salınmasına yol açar ve buradan sıvı biyopsiler yoluyla toplanabilir. Kısaltmalar: SEZ = subependimal bölge; LV = lateral ventrikül; BOS = beyin omurilik sıvısı; pbNSC'ler = doğum sonrası beyin nöral kök hücreleri; β1-int = beta1 integrini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ICV enjeksiyonlarının etkilerinin histolojik değerlendirmesi. (AD) Dcx için immün boyama sonrası lateral ventrikülün dorsal yarısının düşük büyütmeli görüntüleri (nöroblastları işaretlemek için kırmızı renkte). (A) Bir Hamilton şırıngasının basit i.c.v. yerleştirilmesi, SEZ'in sito-mimarisini bozmazken, 10 mL'lik i.c.v. enjeksiyonu (1 mL/dk infüzyon hızı), içeriğinden bağımsız olarak ventriküler duvarda ciddi hasara yol açar. (B) Tuzlu su ve (C) serbest bırakma kokteyli. (D) 2 μL salım kokteyli enjeksiyonu, ameliyattan 8 ay sonra bile gözlenen ventriküler duvarın kontrollü bir şekilde tehlikeye atılmasına yol açar. Enjeksiyondan 7 ve 14 gün sonra SEZ duvarının daha yüksek büyütme detayı sırasıyla (E) ve (F) ile gösterilmiştir. Duvarın yüzeyinde duran Dcx+ nöroblastları (yeşil renkte) ve nişin diğer hücreleri (Sox2+, beyaz) daha derinde duran düzensiz bir yapı vardır. Periventriküler doku, 2 aylık zaman noktasında (G'de) enjeksiyonun rostrokaudal seviyesinde hasar görürken, doku aynı hayvanda daha kaudal seviyede (H'de) sağlamdır. Ventriküler duvar, ependimal belirteçler S100β ve β-katenin için immün boyama ile değerlendirilir. Duvarın tipik mimarisinin detayı (I)'de gösterilmiştir. Nükleer boyama DAPI (mavi ile gösterilmiştir) kullanılarak gerçekleştirilir. Ölçek çubukları = 300 μm (A-C,G,H, ekler), 150 μm (D), 30 μm (E,F) ve 50 μm (I). Bu rakam McClenahan ve ^ark.13'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: SEZ = subependimal bölge; i.c.v = intraserebroventriküler; Dcx = çift kortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sağım yoluyla izole edilen hücrelerin değerlendirilmesi . (A) Salin enjekte edilen hayvanlardan (gri çubuklar, toplam 12 örnek) veya sağımdan sonra (siyah çubuklar, toplam 29 örnek, nöraminidaz ve integrin-β1 bloke edici antikor içeren serbest bırakma kokteyli) sıvı biyopsi örneği başına elde edilen maksimum geçiş sayısını gösteren grafik. (B) Sağım yoluyla elde edilen primer hücrelerin temsili konfokal mikroskopi görüntüsü, enjeksiyondan 3 gün sonra, GFAP ve ID3'e karşı immün boyalı. (C,D) Enjeksiyondan 3 gün sonra izole edilen hücrelerin parlak alan görüntüleri, poli-D-lizin kaplı oyuklara kaplandı ve 7 gün boyunca NSC proliferasyon ortamında büyümesine izin verildi. (E) SEZ'in sağılması yoluyla izole edilen hücrelerin ve aynı deney hayvanlarından SEZ NSC'lerinin endojen popülasyonunun hücre tipi profilini gösteren grafik. SOX2+ ve Dcx+ fraksiyonları, FGF2'nin birlikte enjeksiyonundan sonra sırasıyla önemli ölçüde arttı ve azaldı. (Belirteç başına tek yönlü ANOVA analizi, ardından post hoc analiz; n = deney grubu başına 4-6 hayvan.) Ölçek çubukları = 100 μm (C,D) ve 10 μm (B). Bu rakam McClenahan ve ^ark.13'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: SEZ = subependimal bölge; DPI = enjeksiyondan sonraki gün sayısı; NSC = nöral kök hücreler; Dcx = çift kortin; GFAP = glial fibriler asidik protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kök ve progenitör hücreler, memeli beyin dokusunda nispeten seyrektir. Ek olarak, NSC'ler kolay ve güvenli biyopsiler için erişilemeyen alanlarda (ventriküler duvarlar, hipokampus) bulunur. Bu nedenle, şimdiye kadar bu tür hücrelerle deneysel olarak çalışmanın tek yolu, ölüm sonrası izolasyonları olmuştur. Sağım adı verilen, canlı sıçanlardan NSC'lerin ve OPC'lerin tek veya tekrarlanan toplanmasına izin veren bir yöntem burada adım adım açıklanmaktadır. Yöntem iki temel özelliğe dayanmaktadır: i) NSC'ler veya OPC'ler, beynin ventriküler sistemi içinde akan BOS'tan ependimal hücre tek tabakası ile ayrılır; ii) ependimal hücreler ve nöral progenitörler, integrinler aracılığıyla aralarında ve diğer komşu hücre tipleriyle teması sürdürürler. Bu nedenle, NSC'lerin veya OPC'lerin beyin parankiminden ayrılmasını sağlamak için ventriküllerin belirli bölgelerine enjekte edilen salım kokteyli, nöraminidaz, spesifik olarak ependimal hücreleri^10,11 hedefleyen ve öldüren bir toksin ve bir integrin-β1 bloke edici antikor içerir. Aynı zamanda FGF2 içerir, çünkü bu büyüme faktörü niş ve kültürde NSC'lerin hayatta kalması ve sürdürülmesi için gereklidir^15,16. Bu protokolün hayvanlar tarafından iyi tolere edildiği^{daha önce 7} gösterilmiştir; Bu raporda, BOS'ta NSC'lerin/OPC'lerin salınması için bir ön koşul olarak salım kokteyli tarafından indüklenen ependimal hücrelere verilen hasarın, enjeksiyonun rostrokaudal seviyesi civarında sınırlı olduğu da doğrulanmıştır. Protokol, kök hücre nişinin kendisi de dahil olmak üzere beynin homeostatik işlevini korumalı ve hayvanların uzun vadeli refahını tehlikeye atmamalıdır. Serbest bırakma kokteylinin stereotaksik enjeksiyonu hafif şiddettedir ve hiçbir zaman ölümle sonuçlanmamıştır. Ayrıca, cisterna magna'dan sıvı biyopsilerin performansı, art arda birkaç kez tekrarlanabilen hızlı ve minimal invaziv bir prosedürdür.

Daha da önemlisi, sağım yoluyla izole edilen NSC örnekleri, NSC'lerin endojen havuzunu yakından yansıtmaktadır. SEZ progenitörlerinin profili, FGF2'nin i.c.v. enjeksiyonundan etkilenebilir. Bu olduğunda, sağımdan elde edilen hücrelerin profili de aynı şekilde etkilenir. Ayrıca, önceki deneysel çalışmalar, SEZ'in sağılması yoluyla izole edilen NSC'lerin, in vivo, transgenik, hücre kaderi stratejileri^14,17 ile ortaya çıktığı gibi endojen NSC'lerinkine benzer bir davranış olan sınırlı kendini yenileme potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Doğum sonrası beyin NSC'leri sessizlikte tutulur, nadiren nörojenik ve gliojenik döl oluşturmak için mitotik aktivasyona geçer^18,19,20. Burada, GFAP'yi eksprese eden ve iyi niyetli NSC'leri içermesi beklenen sağımdan türetilmiş hücrelerin fraksiyonunun, hareketsiz NSC'lerin bir belirteci olan ID3'ü birlikte eksprese ettiğine dair kanıtlar sağlanmıştır²¹. Daha sonra tipik olarak postmortem izole edilen NSC'lerin kültürü için kullanılan NSC ortamında kaplanan hareketsiz NSC'lerin zenginleştirilmiş varlığı, toplanan NSC'lerin genişleme potansiyelini sınırlıyor gibi görünmektedir (örneğin, hücreler otolog transplantasyonlar için kullanılacaksa çok önemli bir süreç). Bunun nedeni, bu ortamların aktive edilmiş NSC'lerin hayatta kalması ve mitotik genişlemesi için özel olarak tasarlanmış olmasıdır; bu nedenle, hareketsiz NSC'lerin verimli ve hızlı mitotik aktivasyonunu sağlayan protokollerin oluşturulması, sağımın değerini ve kullanım kapsamını artıracaktır.

Genel olarak, bu veriler sağımın canlı sıçanlardan doğum sonrası beyin NSC'lerinin ve OPC'lerinin (salım kokteylini enjekte etmenin rostrokaudal seviyesine bağlı olarak) örneklenmesini sağladığını göstermektedir. Bu çalışma, aynı hayvanda, salım kokteylinin enjeksiyonundan sonra önemli zaman uzunluklarında bile ardışık sıvı biyopsilerin yapılmasının fizibilitesini göstermektedir (böylece, uzunlamasına deneysel çalışmaları planlamak ve gerçekleştirmek için), çünkü nöroblastlar enjeksiyondan 8 ay sonra bile ventriküler duvarlarda kümelenmiş halde kalır. Bu tür yöntemler kritik öneme sahiptir, çünkü fizyolojik varyasyon tarafından üretilen biyolojik gürültünün azalmasına neden olan bireysel hayvanlardaki olayların araştırılmasına izin verirler. Bu da, doğruluğun artmasına ve "3R" (değiştirme, azaltma ve iyileştirme) ilkelerinin uygulanmasına yol açar. Yöntemin iyileştirilmesi için gelecekteki kilit adımlar, bir serbest bırakma prosedüründen sonra likit biyopsilerin gerçekleştirilebileceği maksimum sayının ve zaman çerçevesinin belirlenmesi olacaktır, ancak gerekirse ek salım prosedürlerinin gerçekleştirilmesi mümkün olmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Serbest kokteyl
beta; 1-integrin bloke edici antikor	BD Biosciences	# 555002	saflaştırılmış NA / LE Hamster Anti-Rat CD29 Klonu Ha2 / 5, 1 mg / mL. Bloke edici aktiviteye sahip herhangi bir abntibody uygun olmalıdır.
Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich'ten		nöraminidaz#N2876 Diğer kaynaklardan (örneğin, Vibrio cholerae'den) nöraminidalar test edilmemiştir.
Rekombinant İnsan FGF-temel (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B,	1 &mu olarak tutulur; g/μ L stoğu, steril suda -20 ° C'de seyreltilmiş; C
Cerrahi işlemler
10 ve mikro; L Şırınga	Hamilton	# 80330	Model 701 RN, Küçük Çıkarılabilir İğne, 26s gauge, 2 inç, nokta stili 2
BD Mikro ince 1 mL insülin şırıngaları	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE KESİMİ. SOL %10 FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	STOK KODU:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenofin 0.3 mg/mL)
Dijital Yeni Standart Stereotaksik, Sıçan ve Fare	Çalma	51500D
Homeotermik İzleme Sistemi	Harvard Aparatı	55-7020
ISOFLURIN 1.000 mg/g inhalasyon buharı, sıvı	Vetpharma Hayvan Sağlığı	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Ketamin 100 mg/mL
Naylon sütür, Ethilon	Ethicon	D9635	Şeffaf, boyut 5-0
Şarj Edilebilir Akülü Cerrahi Düzelticiler	Çalıntı	Ürün:51472
Neşter bıçakları, steril	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  8 inç Swablar	Birchwood Laboratuvarları	34-7021-12P
Stereotaksik Yüksek Hızlı Matkap	Foredom	1474w/o1464
Çalma ' s Stereotaksik Alet	Kiti Çalmak	Ürün: 52189
Xylan% 2	Chanelle İlaç	13764 / 03 / 19-5-2004	Ksilazin, 25 mL
< güçlü > doku ve hücre işleme ve immün boyamalar< / mikroskopi
96 oyuklu plakalar	Greiner	# 655866	Ekran yıldızı
mikroplaka B27 takviyesi	ThermoFisher Scientific	A1486701
Sığır Serumu Albümini (BSA)	Merck	P06-1391100	Fraksiyon V, ısı şoku
Sitrat	Merck	71497	Sodyum sitrat monobazik
Kriyostat	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Nükleer boyama, Seyreltme: 1/1.000
DMEM	ThermoFisher Bilimsel	11995065	Yüksek glikoz, piruvat
eşek anti-keçi	Biotium	20016 veya 20106 veya 20048	Seyreltme: 1/1.000
eşek anti-fare	Biotium	20014 veya 20105 veya 20046	Seyreltme: 1/1.000
eşek anti-tavşan	Biotium	20015 veya 20098 veya 20047	Seyreltme: 1/1.000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (veya bFGF)	Peprotech	100-18B
keçi anti-GFAP	Abcam	ab53554	Seyreltme: 1/500
keçi anti-SOX2	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-17320	Seyreltme: 1/200
fare anti-ID3	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-56712	Seyreltme: 1/200
fare anti-S100 ve beta;	Sigma	S2532	Seyreltme: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem	475904	Montaj ortamı
N2 takviyesi	ThermoFisher Scientific	17502048
Parafolmadehyde	Merck	158127
Poli-D-Lizin	Merck, Millipore	A-003-E	Çözeltisi, 1.0 mg / mL
tavşan anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Seyreltme: 1/500
tavşan anti-PDGFR ve alfa;	Abcam	ab51875	Seyreltme: 1/200
tavşan anti-β- katenin	Abcam	ab16051	Seyreltme: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Mikroskopi ve görüntü analizi
Konfokal mikroskop	Leica	SP6 ve SP8
Görüntü analizi	NIH, ABD	ImageJ
Görüntü analizi	Leica	LasX