Yöntem makalesi

Metal-Organik Çerçeve Toksikolojik Profillerinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Elektrik Hücresi-Substrat Algılama

DOI:

10.3791/65313

⸱

26 Mayıs 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki çalışma, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir tarama tekniği olan elektrik hücresi-substrat empedans algılamasını (ECIS) kullanan seçilmiş bir metal-organik çerçevenin toksikolojik profilini değerlendirmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metal-organik çerçeveler (MOF'ler), organik çözücülerde metal iyonlarının ve organik bağlayıcıların koordinasyonu ile oluşturulan melezlerdir. MOF'ların biyomedikal ve endüstriyel uygulamalarda uygulanması, güvenlikleri ile ilgili endişelere yol açmıştır. Burada, zeolitik bir imidazol çerçevesi olan seçilmiş bir MOF'un profili, insan akciğer epitel hücrelerine maruz kaldıktan sonra değerlendirildi. Değerlendirme platformu gerçek zamanlı bir teknikti (yani, elektrik hücresi-substrat empedans algılama [ECIS]). Bu çalışma, seçilen MOF'un maruz kalan hücreler üzerindeki bazı zararlı etkilerini tanımlamakta ve tartışmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, kapsamlı hücre değerlendirmeleri için diğer biyokimyasal tahlillere karşı gerçek zamanlı yöntemi kullanmanın faydalarını göstermektedir. Çalışma, hücre davranışında gözlenen değişikliklerin, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip MOF'lara maruz kalmanın neden olduğu olası toksisiteye ve kullanılan bu çerçevelerin dozajına işaret edebileceği sonucuna varmıştır. Hücre davranışındaki değişiklikleri anlayarak, biyomedikal uygulamalar için kullanılacak MOF'ların fizikokimyasal özelliklerini özel olarak uyarlayarak tasarım gereği güvenli stratejilerin iyileştirilmesi yeteneği öngörülmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metal-organik çerçeveler (MOF'ler), organik çözücülerde metal iyonları ve organik bağlayıcıların 1,2 kombinasyonu ile oluşturulan hibritlerdir. Bu tür kombinasyonların çeşitliliği nedeniyle, MOF'lar yapısal çeşitliliğe3, ayarlanabilir gözenekliliğe, yüksek termal stabiliteye ve yüksek yüzey alanlarına 4,5 sahiptir. Bu özellikler, onları gaz depolamadan 6,7'den katalize 8,9'a ve kontrast maddelerden10,11'den ilaç dağıtım birimlerine12,13'e kadar çeşitli uygulamalarda çekici adaylar haline getirir. Bununla birlikte, MOF'ların bu tür uygulamalara uygulanması, hem kullanıcılar hem de çevre için güvenlikleriyle ilgili endişeleri artırmıştır. Ön çalışmalar, örneğin, hücrelerin MOF senteziiçin kullanılan metal iyonlarına veya bağlayıcılara maruz kalmasıyla hücresel fonksiyonun ve büyümenin değiştiğini göstermiştir 1,14,15. Örneğin, Tamames-Tabar ve ark. Zn tabanlı bir MOF olan ZIF-8 MOF'un, bir insan rahim ağzı kanseri hücre hattında (HeLa) ve bir fare makrofaj hücre hattında (J774) Zr bazlı ve Fe bazlı MOF'lara göre daha fazla hücresel değişikliğe yol açtığını göstermiştir. Bu tür etkiler muhtemelen, çerçeve parçalanması ve Zn iyonu salınımı1 üzerine potansiyel olarak hücre apoptozunu indükleyebilen ZIF-8'in metal bileşeninden (yani Zn) kaynaklanıyordu. Benzer şekilde, Gandara-Loe ve ark. Cu bazlı bir MOF olan HKUST-1'in, 10 μg/mL veya daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında fare retinoblastom hücre canlılığında en yüksek azalmaya neden olduğunu göstermiştir. Bu muhtemelen, bu çerçevenin sentezi sırasında dahil edilen ve bir kez serbest bırakıldığında maruz kalan hücrelerde oksidatif strese neden olabilen Cu metal iyonundankaynaklanıyordu 15.

Ayrıca analiz, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip MOF'lara maruz kalmanın, maruz kalan hücrelerin değişen tepkilerine yol açabileceğini göstermiştir. Örneğin, Wagner ve ark. ölümsüzleştirilmiş bir insan bronşiyal epitel hücresinin maruz kalmasında kullanılan ZIF-8 ve MIL-160'ın (Al tabanlı bir çerçeve), çerçevelerin fizikokimyasal özelliklerine, yani hidrofobikliğine, boyutuna ve yapısal özelliklerine bağlı hücresel tepkilere yol açtığını göstermiştir16. Tamamlayıcı olarak, Chen ve ark. insan normal karaciğer hücrelerine (HL-7702) maruz kalan 160 μg / mL MIL-100 (Fe) konsantrasyonunun, muhtemelen bu spesifik çerçevenin metal bileşeni (yani, Fe17) nedeniyle hücresel canlılıkta en büyük kayba neden olduğunu göstermiştir.

Bu çalışmalar, MOF'ların hücresel sistemler üzerindeki zararlı etkilerini fizikokimyasal özelliklerine ve maruziyet konsantrasyonlarına göre sınıflandırırken, özellikle biyomedikal alanlarda çerçeve uygulamasıyla ilgili potansiyel endişeleri gündeme getirirken, bu değerlendirmelerin çoğu tek zaman noktalı kolorimetrik analizlere dayanmaktadır. Örneğin, (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) tetrazolyum (MTT) ve suda çözünür tetrazolyum tuzu (WST-1) tahlilleri kullanıldığında, bu biyokimyasal reaktiflerin, hücrelerin de maruz kaldığı parçacıklarla etkileşimleri üzerine yanlış pozitiflere yol açabileceğigösterilmiştir 18. Tetrazolyum tuzu ve nötr kırmızı reaktiflerin, partiküllerin yüzeylerine yüksek bir adsorpsiyon veya bağlanma afinitesine sahip olduğu gösterilmiştir, bu da ajan sinyal girişimineneden olur 19. Ayrıca, daha önce MOF'lara maruz kalan hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanıldığı gösterilen akış sitometrisi gibi diğer test türleri için20,21, partiküllerin zararlı etkilerinin uygulanabilir bir analizi düşünülecekse, büyük sorunların atlatılması gerektiği gösterilmiştir. Özellikle, parçacıkların boyutlarının algılama aralıkları, özellikle MOF'lar tarafından sunulanlar gibi karışık popülasyonlarda veya hücresel değişikliklerden önce kalibrasyon için kullanılan parçacıkların referansları ele alınmalıdır22. Ayrıca, bu tür sitometri tahlilleri için hücre etiketlemesi sırasında kullanılan boyanın, hücrelerin maruz kaldığı nanopartiküllere de müdahale edebileceğigösterilmiştir 23.

Bu çalışmanın amacı, seçilmiş bir MOF'a maruz kaldıktan sonra hücre davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir değerlendirme testi kullanmaktı. Gerçek zamanlı değerlendirmeler, maruziyet pencereleriyle ilgili olarak zamana bağlı etkilere ilişkin içgörüler sağlamaya yardımcı olabilir16. Ayrıca, hücre-substrat etkileşimleri, hücre morfolojisi ve hücre-hücre etkileşimlerindeki değişikliklerin yanı sıra bu değişikliklerin ilgilenilen malzemelerin fizikokimyasal özelliklerine ve maruz kalma sürelerine nasıl bağlı olduğu hakkında bilgi sağlarlar24,25 sırasıyla.

Önerilen yaklaşımın geçerliliğini ve uygulanabilirliğini göstermek için insan bronşiyal epitel (BEAS-2B) hücreleri, ZIF-8 (zeolitik imidazolat16'nın hidrofobik bir çerçevesi) ve elektrik hücre-substrat empedans algılama (ECIS) kullanıldı. BEAS-2B hücreleri, akciğer maruziyeti 26 için bir modeli temsil eder ve daha önce hücrelerin nanokillere ve termal olarak bozulmuş yan ürünlerine26,27,28 maruz kalmasıyla ilgili değişiklikleri değerlendirmek ve ayrıca tek duvarlı karbon nanotüpler (SWCNT'ler) gibi nanomalzemelerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılmıştır18. Ayrıca, bu tür hücreler 30 yıldan fazla bir süredir pulmoner epitel fonksiyonu için bir model olarak kullanılmaktadır29. ZIF-8, katalizde30 ve biyogörüntüleme ve ilaç dağıtımı32 için kontrast madde31 olarak geniş uygulaması ve dolayısıyla bu tür uygulamalar sırasında akciğer maruziyeti için genişletilmiş potansiyel nedeniyle seçilmiştir. Son olarak, noninvaziv, gerçek zamanlı teknik olan ECIS, daha önce analitler (hem malzemeler hem de ilaçlar) ve maruz kalan hücreler arasındaki çeşitli etkileşimlerin bir sonucu olarak hücre aderansı, proliferasyonu, hareketliliği ve morfolojisindekideğişiklikleri değerlendirmek için kullanılıyordu 16,26 gerçek zamanlı olarak16,18,28. ECIS, altın elektrotlar üzerinde hareketsiz hale getirilen hücrelerin empedansını ölçmek için alternatif bir akım (AC) kullanır, empedans değişiklikleri, hücre-altın substrat arayüzündeki direnç ve kapasitanstaki değişiklikler, hücre-hücre etkileşimleri tarafından indüklenen bariyer işlevi ve bu tür altın elektrotların hücre üstü katman kapsamı hakkında fikir verir33,34. ECIS'in kullanılması, invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir şekilde nano ölçekli bir çözünürlükte kantitatif ölçümlere izin verir26,34.

Bu çalışma, hücresel davranışta MOF kaynaklı değişikliklerin değerlendirilmesinin basitliğini ve kolaylığını gerçek zamanlı olarak tek noktalı tahlil değerlendirmeleri ile değerlendirmekte ve karşılaştırmaktadır. Böyle bir çalışma, ilgilenilen diğer parçacıklara maruz kalmaya yanıt olarak hücre profillerini değerlendirmek için daha fazla tahmin edilebilir, böylece tasarım gereği güvenli parçacık testine izin verir ve daha sonra uygulamaya yardımcı olur. Ayrıca, bu çalışma tek noktalı değerlendirmeler olan genetik ve hücresel tahlilleri tamamlayabilir. Bu, parçacıkların hücresel popülasyon üzerindeki zararlı etkilerinin daha bilinçli bir analizine yol açabilir ve bu tür parçacıkların toksisitesini yüksek verimli bir şekilde taramak için kullanılabilir16,35,36.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ZIF-8 sentezi

  1. Bu örneğin amacı doğrultusunda, ZIF-8'i sentezlemek için 1:10:100 (metal:bağlayıcı:çözücü) kütle oranı kullanın. Bunun için çinko nitrat heksahidratı ölçün ve ölçümü kaydedin. Bağlayıcı, 2-metilimidazol ve çözücü (yani metanol) için gereken miktarı hesaplamak için örnek kütle oranını kullanın.
  2. Çinko nitrat heksahidratı ve bağlayıcıyı iki farklı cam şişeye yerleştirin. Hesaplanan metanol miktarının yarısını çinko nitrat heksahidrata ve diğer yarısını bağlayıcıya ekleyin. Her çözeltinin çözülmesine izin verin.
  3. İki çözümü birleştirin (yani, sırasıyla metal ve bağlayıcı içeren çözeltiler). Reaksiyon için kombine çözelti içeren kabı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca 700 rpm'de karıştırın.

2. ZIF-8 koleksiyonu

  1. Yukarıdaki reaksiyon sona erdiğinde (yani 24 saat sonra), çözeltiyi 50 mL'lik santrifüj tüplerine yerleştirin ve 5 dakika boyunca 3.075 x g'de santrifüjleyin (eşit miktarlar kullanın ve rotoru dengeleyin). Süpernatantlardan herhangi birini santrifüjlenmiş tüplerden çıkarın.
  2. Santrifüj tüplerine metanol (5-15 mL) ekleyin ve partikülleri yeniden dağıtın.
  3. Santrifüjleme ve yıkama adımlarını en az iki ila dört kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra süpernatanı boşaltın.
    NOT: Yıkama adımları, çökelmemiş türleri uzaklaştırır.
  4. Tüplerin kapaklarını çıkarın ve üstüne parafilm bandı yerleştirin; Daha sonra, parafilmde delikler açın. Tüpü/tüpleri yerleştirinamp24 saat kuruması için RT'de bir vakum odasına.

3. ZIF-8 yüzey morfolojisi (taramalı elektron mikroskobu [SEM])

  1. ZIF-8'in kuru tozlarını karbon bant üzerine monte edin ve SEM analizi sırasında oluşabilecek herhangi bir şarjı önlemek için 120 saniye boyunca altın-paladyum püskürtün.
  2. Mikroskobun hızlanma voltajını 15 kV'a ayarlayın. Parçacıkları odağa getirin ve büyütmeyi ayarlayın (500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x ve 40.000x büyütmeler kullanıldı.)
  3. Hem net bir parçacık boyutuna hem de morfoloji değerlendirmesine izin veren büyütme altındaki parçacıkları görüntüleyin (5 μm, 10 μm ve 20 μm'lik parçacıklar için aralıkların dikkate alınması önerilir).
  4. En az üç farklı görüş alanından veri toplayın ve her biri için farklı büyütmeleri göz önünde bulundurun.

4. ZIF-8 element bileşimi

  1. SEM görüntüleme için adımları takip ediniz.
  2. SEM mikroskobunun enerji dağıtıcı X-ışını (EDX) spektroskopi ünitesini kullanarak, numune element bileşimini analiz edin.
  3. SEM hızlandırma voltajının ve büyütmenin EDX monitörüyle eşleştiğinden emin olun. SEM mikroskobundaki kızılötesi kamerayı kapatın.
  4. EDX monitöründe Spektrum Topla'ya gidin ve 200 sn'lik bir toplama süresi girin. Bu, yanlış değerlendirmelere yol açabilecek partikül yüklenmesini ve parçalanmasını önlemek için önerilir.
  5. En az üç farklı görüş alanından veri toplayın. Toplama bittiğinde, verileri analiz edin ve ilgilenilen unsurları belirleyin.

5. Hücre kültürü

  1. Kültür, %5 fetal sığır serumu (FBS) ve %0.2 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş ortamda BEAS-2B hücrelerini ölümsüzleştirdi.
    NOT: Kullanılan hücre partisinde daha önce herhangi bir fenotipik değişiklik olmamasını sağlamak için 5-10 arasındaki pasajlar kullanılmalıdır37 (tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir).
  2. 100 mm'lik bir hücre kültürü plakası alın ve 10 mL ortamı plakaya yerleştirin. Plakaya 1 mL BEAS-2B hücre çözeltisi ekleyin.
  3. Plakayı bir inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin ve hücrelerin büyümesine izin verin.
  4. Hücrelerin% 80 birleşmeye ulaşıp ulaşmadığını belirlemek için 24 saat sonra plakayı kontrol edin. Burada, %80 birleşme, yapışan hücrelerin kapladığı yüzeyin yüzdesini ifade eder. Değilse, ortamı değiştirin ve% 80 birleşme seviyesine ulaşılana kadar hücrelerin büyümesine izin verin.

6. Hücre sayımı

  1. Plakadaki hücreler %80'lik bir birleşime ulaştığında, ortamı plakadan çıkarın. Plakayı 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  2. PBS'yi plakadan çıkarın. Plakaya 2 mL tripsin ekleyin ve 2 dakika boyunca inkübatöre (37 °C,% 5 CO2) koyun.
  3. Plakaya 2 mL ortam ekleyin ve hücreleri plakadan çıkarmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin. Çözeltiyi 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 123 x g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı tüpten çıkarın ve 2 mL ortam ekleyin. Hücreleri yeniden dağıtmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin.
  5. 1.5 mL'lik bir tüp kullanarak, 20 μL tripan mavisi ve ardından 20 μL hücre çözeltisi (1: 1 tripan mavisi: hücre çözeltisi oranı) ekleyin.
  6. 10 μL hücre karışımını bir cam slayt üzerine yerleştirin ve otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. Ekran netlenene kadar bekleyin, ardından yakala'yı seçin.
  7. Ekran, canlı hücre numaralarını ve hücre canlılığını görüntüler. Ölçüm aralığı 1 x 104-1 x 107 hücre arasında uzanır.
  8. Alternatif olarak, bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.
    1. Bunun için hemositometreye 15-20 μL tripan mavisi ile muamele edilmiş hücre çözeltisi ekleyin.
    2. Hemositometrenin ızgara çizgilerine 10x objektif odaklı dik bir mikroskop kullanın.
    3. Dıştaki dört karedeki hücre sayısını sayın ve sayıyı dörde bölün. Ardından, canlı hücre sayısı sayısını elde etmek için 10.000 ile çarpın.
    4. Hücre canlılığını hesaplamak için, toplam hücre sayısını elde etmek için canlı ve ölü hücre sayısını toplayın ve ardından canlı hücre sayısını toplam hücre sayısına bölün.

7. ZIF-8 doz hazırlama

  1. 1 mg/mL'lik bir ZIF-8 stok çözeltisi yapın. Bunun için ZIF-8 miktarını ölçün ve 1 mg/mL konsantrasyona ulaşmak için partiküllere deiyonize (DI) su ekleyin.
  2. Bir su banyosunda 30 s aralıklarla 2 dakika boyunca ZIF-8 stok çözeltisini sonikleştirin (sonikatörü sonics'e ayarlayın).
  3. C 1 V1= C2V 2 denklemini kullanarak istenen dozlara ulaşmak için gereken stok çözelti miktarını ve Dulbecco'nun modifiye kartal ortamını (DMEM) hesaplayarak hücresel maruziyetler için farklı dozlardaZIF-8 yapın. Dozlar 0-950 μg / mL arasında değişecektir.
    NOT: Bu deneyde 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL ve 950 μg/mL dozları seçilmiştir.

8. Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC 50)

  1. Hücre sayımından sonra, BEAS-2B hücrelerini 4 x 104 hücre/mL yoğunlukta 96 oyuklu bir plakada, 100 μL/oyukluk bir hacimle tohumlayın.
    1. 4 x 104 hücre/mL yoğunluğa ulaşmak için, ortamla birleştirilmesi gereken hücre çözeltisi miktarını hesaplamak için C 1 V1= C 2 V2kullanın.
    2. Her doz için boş kuyucukların muhafaza edildiğinden emin olun; ZIF-8 maruziyetine kadar bu kuyuları boş bırakın.
  2. 96 oyuklu plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin 24 saat boyunca birleşik bir tek tabakaya büyümesine izin verin.
  3. Ortamı kuyulardan çıkarın ve BEAS-2B hücrelerini 0-950 μg/mL arasında değişen ZIF-8 dozlarına maruz bırakın. İlgili boş ve hücre kuyucuklarına 100 μL ZIF-8 ekleyin.
  4. 96 oyuklu plakaları 48 saatlik bir maruz kalma süresi için inkübatöre geri yerleştirin.
  5. Maruz kaldıktan sonra, her bir oyuğa (boş ve hücre kuyucukları) 10 μL 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disülfonat (WST-1) ekleyin ve 2 saat inkübe edin. Medya kuyularda kalır; Oran 1:10'dur (reaktif:medya).
  6. 485 nm'lik bir absorbans kullanarak bir plaka okuyucudaki absorbanstaki değişiklikleri okuyun.
  7. IC50 değerini belirlemek için yazılım aracılığıyla hücre canlılığını hesaplayın (bkz. bölüm 10).

9. Elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS)

  1. ECIS analizi yapmak için 96 oyuklu bir plaka (96W10idf) kullanın. Plaka28 , yaklaşık 4mm2'lik bir alanı kaplayan sayısallar arası parmak bağlantı elektrotları içerir.
  2. İlk olarak, tüm kuyuların sensörler tarafından okunduğunu test edin. Bunun için 96 kuyulu plakayı kuyu istasyonuna yerleştirin ve Kurulum düğmesine tıklayın.
  3. Kuyular düzgün bağlanırsa yeşil görünecektir; Bağlantısız kuyular kırmızı olarak tanımlanacaktır. Böyle bir durum ortaya çıkarsa, kuyu plakasını çıkarıp yeniden takın ve tüm kuyular uygulanabilir yeşil okumalar sunana kadar Kurulum düğmesine tekrar tıklayın.
  4. Potansiyel kaymayı önlemek için elektrotları oyuk başına 200 μL ortam ile 40 dakika stabilize edin. Kullanılan her kuyucuğa 200 μL ortam ekleyin ve ardından 96 oyuklu plakayı ECIS istasyonuna yerleştirin. Plakanın doğru şekilde bağlandığından emin olmak için Kurulum/Kontrol üzerine tıklayın. Stabilize'ye tıklayın.
  5. Stabilizasyon tamamlandıktan sonra, plakayı istasyondan çıkarın ve ortamı her bir kuyudan çıkarın.
  6. BEAS-2B hücrelerini, oyuk başına 100 μL hacimle 4 x 104 hücre/mL yoğunlukta, hücreleri içeren kuyucuklara tohumlayın ve plakayı inkübatördeki ECIS istasyonuna yerleştirin.
  7. Monitörde, tüm elektrotların istasyondaki sensörler tarafından okunduğunu belirlemek için Kontrol Et'e tıklayın.
  8. Çoklu Frekans/Zaman (MFT) öğesini seçerek zaman rotası ölçümünü ayarlayın. Program her bir kuyuyu yedi farklı frekansta ölçecektir.
  9. Başlat'a tıklayın ve hücrelerin birleşik bir tek katman oluşturabilmesi için 24 saat çalışmasına izin verin.
  10. 24 saat sonra, hücreleri içeren kuyucuklar monitörde artan direnç gösterecektir. Bu, hücrelerin elektrotlara bağlandığının bir göstergesidir.
  11. Veri toplamayı durdurmak için monitördeki Duraklat düğmesine basın.
  12. Yukarıdaki 7. bölümde belirtilen adımları izleyerek ZIF-8 dozlarını hesaplanan IC50 değerinde, üstünde ve altında yapın.
  13. ZIF-8 nanopartiküllerini, kuyu başına 100 μL'lik bir hacimde ilgili boş ve hücre kuyularına maruz bırakın ve 96 oyuklu plakayı istasyona geri yerleştirin.
  14. Sensörlerin tüm elektrotları okuduğundan emin olmak için monitörde tekrar Kontrol Et'e tıklayın. Devam Et'e tıklayın ve hücresel davranışı ve eki izlemek için sistemin 72 saat çalışmasına izin verin.
  15. Veri toplama işlemi bittiğinde, monitörde Bitir'e tıklayın. Dosyayı kaydetmek için, Dosya > Farklı Kaydet'i tıklatın. Verileri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
  16. Alfa parametrelerini almak için Model'e tıklayın. Ekran açılır penceresinde, Yalnızca Medya Kutusu'na tıklayın, ardından yalnızca medyası olan kuyuyu seçin.
  17. Set Ref'e tıklayın. Monitörde Bul'a tıklayın.
  18. Sistemde gösterilen kuyu seçilenle aynı değilse, 9.16 adımını tekrarlayın.
  19. Ayarla'ya tıklayın. Veri toplama için istenen zaman aralığını belirlemek için Fit T-Range'e tıklayın.
  20. İşlenirken Alfa'ya tıklayın. Sistem analizi bitirdiğinde, RbA'yı Kaydet'e tıklayın ve bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    NOT: Üreticinin web sitesinde bulunan ECIS kılavuzunabakın 38.

10. Veri analizi

  1. SEM
    1. SEM görüntülerini analiz etmek için görüntüleme yazılımını açın. Dosya > Aç'ı tıklatın ve analiz edilecek görüntüyü seçin.
    2. Eşik işlemini gerçekleştirmek için görüntüyü gri tonlamaya dönüştürmek için Görüntü > Türü > 8 Bit'e tıklayın.
    3. Piksellerin mesafe ölçümünü mikron olarak kalibre edin. Düz Çizgi aracına tıklayın ve ölçülmesi amaçlanan her parçacığın uzunluğunu izleyin.
    4. Analiz Et'e ve ardından Ölçeği Ayarla'ya tıklayın. Bilinen mesafe, SEM görüntüsündeki ölçek çubuğunun boyutunun uzunluğuna ayarlanacaktır. Bilinen uzunluk birimi mikron olarak ayarlanacaktır. Global'i kontrol edin ve Tamam'a basın.
    5. Düz Çizgi aracına tıklayın ve parçacığın çapını izleyin, ardından Analiz Et ve Ölç'ü seçin. Uzunluk sonucunu kaydedin.
    6. Toplanan tüm görüntüler için tekrarlayın. Uygun bir istatistik değerlendirmesi için en az 60 parçacıktan tüm çapların ortalamasını alın.
  2. EDX (Büyüköğretim Kurumu
    1. Toplanan tüm görüntülerden her bir öğenin tüm ağırlık yüzdelerinin ortalamasını alın (yukarıdaki EDX bölümüne bakın).
    2. Bir elektronik tablo kullanarak, x eksenindeki her bir öğenin çubuk grafiğini ve y eksenindeki ortalama temel ağırlık yüzdesini çizin.
  3. IC50
    1. Boş kuyucukların ortalamasını alın ve her kopya için doz kuyucuklarının ortalamasını alın.
    2. Kontrol boş ortalamasını boş doz ortalamasından çıkararak ayarlanmış boşluğu hesaplayın. Ayarlanan boşluğu ortalama doz değerinden çıkararak her doz için gerçek hücre değerini hesaplayın.
    3. Her doz için ayarlanan boş değeri ortalama kontrol değerinden çıkarın. Denklemi kullanarak her dozun hücre canlılığını hesaplayın: hücre canlılığı = (gerçek hücre değeri / (kontrol değeri - ayarlanmış boş değer)) x 100.
    4. Bunu diğer tüm çoğaltmalar için yineleyin.
    5. Her doz için nihai hücre canlılığını elde etmek için her bir kopya için hücre canlılığının ortalamasını alın.
    6. Yazılımda, ekrandaki XY sekmesini seçin.
    7. Konsantrasyon (doz) değerlerini X sütununa ve her dozdan hücre canlılığını (%) Y sütununa girin.
    8. Çözümle > Dönüştür > Tamam'a ve Transform X = Log(X)'a tıklayarak X değerlerini dönüştürün.
    9. Dönüştürülmüş Veri sayfasını seçerek, Çözümle'ye tıklayarak ve ardından Normalleştir'i seçerek Y değerlerini normalleştirin.
    10. Dönüşümün Normalleştirilmesi veri sayfasını seçin, Çözümle'ye tıklayın ve Doğrusal Olmayan Regresyon (Eğri Sığdır) seçeneğini belirleyin. Doz-Yanıt-İnhibisyon'u seçin ve Log (İnhibitör) Vs. Yanıt Değişkeni Eğimi (Dört Parametre) seçeneğine tıklayın. Sonuçları görüntülemek için Tamam'a tıklayın.
  4. ECIS (Avrupa Halk Cumhuriyeti)
    1. Elektronik tablodan, her çoğaltma (boş kuyucuklar ve doz kuyuları) için direnç (ohm) sütunlarını alın ve bunların ortalamasını 4.000 Hz frekansından alın. Bu frekans, hücre-hücre teması değerlendirmesineizin verir 38.
    2. Her bir kopya için ortalama boşluğu ortalama dozdan çıkararak düzeltilmiş direnci hesaplayın. Her doz için kopyalar için düzeltilmiş direncin ortalaması.
    3. Ortalama alfa parametresini hesaplamak için alfa değerleri için aynı adımları tekrarlayın. Her doz değeri için x eksenini zaman (h) ve y eksenini ortalama direnç/alfa değerleri olarak çizin.

11. İstatistiksel analiz

  1. SEM
    1. ZIF-8 parçacıklarının ortalama çaplarının hesaplandığı elektronik tablo dosyasında standart bir sapma gerçekleştirin.
    2. Elektronik tablodaki STDEV işlevini kullanarak, 60 parçacığın verilerini vurgulayın ve Enter'a tıklayın. Hesaplanan her ortalama çap için standart sapmanın grafiğini çizin.
  2. EDX (Büyüköğretim Kurumu
    1. SEM'e benzer şekilde (11.1.1-11.1.2 adımları), elektronik tablodaki STDEV işlevini kullanarak her bir ortalama temel bileşim için standart sapmayı hesaplayın. Her ortalama element bileşimi için standart sapmaların grafiğini çizin.
  3. IC50
    1. IC50'yi hesaplamak için kullanılan yazılımı açın ve Gruplandırılmış Veri Sayfası'na tıklayın.
    2. ZIF-8 dozlarını Grup A, Grup B vb. etiketli satırlara girin. Her doz için ortalama hücre canlılığını girin ve ZIF-8 dozuna karşılık gelen sütunda çoğaltın.
    3. Analiz Et'e tıklayın ve Sütun Analizleri'nin altında Tek Yönlü ANOVA (ve parametrik olmayan veya karma) seçeneğini belirleyin.
    4. Deneysel Tasarım sekmesinde, Eşleştirme veya Eşleştirme Yok'u seçin. Artıkların Gauss Dağılımı altında, Evet ANOVA kullan'ı seçin. Son olarak, Eşit SD'leri Varsay altında Evet Sıradan ANOVA Testini Kullan'ı seçin.
    5. Birden Çok Karşılaştırma sekmesi altında, Her Sütunun Ortalamasını Kontrol Sütununun Ortalamasıyla Karşılaştır'ı seçin. Sonuçları görüntülemek için Tamam'a tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaygın bir in vitro model hücre hattı39 (BEAS-2B) kullanan bu çalışma, laboratuvarda sentezlenen bir MOF'a maruz kaldıktan sonra hücre davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek için ECIS'in fizibilitesini ve uygulanabilirliğini göstermeyi amaçladı. Bu değişikliklerin değerlendirilmesi, geleneksel kolorimetrik tahliller yoluyla yapılan analizlerle tamamlanmıştır.

Çerçevenin fizikokimyasal özellikleri, kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliğini, elde edilen ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki analizler, ECIS'in analitlere maruz kalan hücrelerin davranışını değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermiştir (yani, karbon nanotüpler35, ilaçlar43 veya nanokiller16). Ayrıca, Stueckle ve ark. nanokillere ve bunların yan ürünlerine maruz kalan BEAS-2B hücrelerinin toksisitesini değerlendirmek için ECIS'i kullandılar ve hücresel davranış ve bağlanmanın bu tür malzemelerin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olduğunu buldular

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) T32 programı (T32 GM133369) ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF 1454230) tarafından finanse edilmiştir. Ek olarak, WVU Ortak Araştırma Tesisleri ve Uygulamalı Biyofizik yardımı ve desteği kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzen disülfonat (WST-1 testi) Roche5015944001
%0,25 Tripsin-EDTA (1x)Gibco25255-056
100 mm plakalarCorning430167
1300 Serisi A2 biyofüme davlumbazThermo Scientific323TS
2510 Branson banyo sonikatörüProses Ekipmanları ve Tedarik A.Ş. 251OR-DTH
2-metilimidazol, %97Alfa Aesar693-98-1
5 mL steril mikrotüpArgos TechnologiesT2076S-CA
50 mL  tüpler Falcon352098
96W10idf kuyu plakalarıUygulamalı Biyofizik 96W10idf PET
96 kuyulu plakalarFisherbrandFB012931
BiorenderN / A
Kontes hücre sayma odası slaytlarıInvitrogenC10283
Kontes II FL otomatik hücre sayacıYaşam TeknolojileriC0916-186A-0303
Denton Desk V püskürtme ve karbon kaplayıcıDenton VakumYok
Dimeme oksit ve nbsp;Corning25-950-CQC
DPBS / ModifiyeCytivaSH30028.02
Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamıCorning10-014-CV
ECIS-Z & Theta;Uygulamalı Biyofizik ABP 1129
ExcelMicrosoftSürüm 2301
Falcon tüpleri (15 mL)Corning352196
Fetal sığır serumuGibco16140-071
FLUOstar OPTIMA plaka okuyucuBMG LABTECH413-2132
GraphPad Prizma Yazılımı (9.0.0)GraphPadYazılımı, LLCSürüm 9.0.0
HERAcell 150i CO2 İnkübatörThermo Scientific50116047
Hitachi S-4700 Enerji dağıtıcı X-ışını ile donatılmış alan emisyon taramalı elektron mikroskobu Hitachi High-Technologies CorporationS4700 ve EDAX TEAM analiz yazılımı
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık EnstitüleriN/A
Ölümsüzleştirilmiş insan bronşiyal epitel hücreleriAmerikan Tipi Kültür KoleksiyonuCRL-9609
Isotemp dondurucuFisher Scientific 
Metanol, %99Fisher Chemical67-56-1
Parafilm sızdırmazlık filmiLaboratuvar DeposuHS234526A
Penisilin / SteptomisinGibco15140-122
Sorvall Legend X1R Santrifüj ve nbsp;Thermo Scientific75004220
Sorvall T 6000BDU PONT  T6000B
MP Biomedicals,LLC'de %0.4'lük çözelti1691049
Vakum OdasıBelart999320237
Çinko Nitrat Hekzahidrat, %98 ekstra safAcros Organik101-96-18-9
Tripan mavisi, PBS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211(2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80(2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709(2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367(2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683(2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107(2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6(2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174(2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40(2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metal Organik er evelerMOF ToksisitesiElektrikli H cre Alg lamaGer ek Zamanl H cre zlemensan Akci er EpiteliZeolitik midazol er evesiEmpedans Alg lamaNanomalzeme ToksisitesiBiyomedikal UygulamalarH cre Davran Analizi

İlgili makaleler