DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Genomik DNA hasarı, spontan çürüme, iç hasar ve çevresel faktörler nedeniyle oluşur¹. Ortaya çıkan DNA lezyonları, hasarlı bazlar, uyumsuzluklar, tek ve çift iplikçik kopmaları, iplikçikler arası ve zincir içi çapraz bağlar ve DNA-protein çapraz bağları (DPC'ler) içerir. Kromatine bağlı bir protein, kovalent bağ yoluyla DNA üzerinde tutulduğunda bir DPC oluşur. DPC'ler, endojen DNA lezyonları ve reaktif metabolitlerin yanı sıra kemoterapötikler ve iki işlevli çapraz bağlama ajanları gibi eksojen ajanlar tarafından indüklenir. Belirli koşullar altında, enzim disfonksiyonu da DPC'lerin^oluşumuna yol açabilir 2. DPC indükleyicilerindeki büyük fark, kovalent bağlı proteinin kimliğinde, DPC'nin oluştuğu kromozom bölgesinde, proteine çapraz bağlı DNA'nın yapı tipinde ve protein ile DNA^arasındaki kovalent bağın kimyasal özelliğinde bir farklılığa neden olur ^2,3,4.

Kimyasal yapılarına bağlı olarak, DPC'ler genellikle iki gruba ayrılır: enzimatik DPC'ler ve enzimatik olmayan DPC'ler. Topoizomerazlar, glikozilazlar ve metil/asiltransferazlar gibi bazı enzimler, normal katalitik reaksiyonları sırasında tersinir enzim-DNA kovalent ara ürünleri oluşturarak etki eder. Bunlar kısa ömürlü enzim-DNA ara ürünleridir ve endojen veya eksojen ajanlar, özellikle kemoterapötikler tarafından yakalanmaları üzerine uzun ömürlü enzimatik DPC'lere dönüştürülebilir³. Topoizomeraz DPC'leri, klinik olarak yararlı topoizomeraz inhibitörleri (topoizomeraz I için topotakan ve irinotekan [TOP1] ve topoizomeraz II için etoposid ve doksorubisin [TOP2]) tarafından üretilebilen ökaryotik hücrelerde en sık görülen enzimatik DPC'ler arasındadır ve bu inhibitörlerin birincil terapötik mekanizmalarıdır ^5,6. DNA metiltransferazlar (DNMT) 1, 3A ve 3B, 5-aza-2'-deoksisitidinin (desitabin olarak da bilinir) hedefidir ve ilaca maruz kaldığında DPC'ler oluşturur⁷. Reaktif ajanların yanı sıra ultraviyole ışık ve iyonlaştırıcı radyasyon, proteinleri DNA'ya spesifik olmayan çapraz bağlayarak enzimatik olmayan DPC'leri indükler. Asetaldehit ve formaldehit (FA) gibi reaktif aldehitler genellikle hücresel metabolizmaların yan ürünleri olarak üretilir, bunların arasında FA, metanol metabolizması, lipid peroksidasyonu ve histon demetilasyonu sırasında mikromolar konsantrasyonlarda üretilir. Ayrıca FA, dünya çapında üretilen ve birçok insanın hem çevresel hem de mesleki olarak maruz kaldığı yüksek hacimli bir üretim kimyasalıdır ^8,9.

Hem enzimatik hem de enzimatik olmayan DPC'ler, hacimli protein bileşenleri, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere neredeyse tüm kromatin bazlı süreçleri verimli bir şekilde engellediğinden, onarılmadan bırakılırsa hücre döngüsü durmasına ve apoptoza yol açtığından, hücreler için oldukça toksiktir. Son yirmi yılda, DPC'lerin onarımı güçlü bir şekilde incelenmiştir ve DPC'leri doğrudan onaran veya onarım süreçlerini modüle eden anahtar faktörler olarak birkaç protein/yol tanımlanmıştır. Örneğin, bir DPC'nin protein kütlesinin proteolizinin, DPC onarımının çok önemli bir adımı olduğu ve proteolizin SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A 15, GCNA 16,17 veya^26S proteazom kompleksi 18,19,20,21,22 tarafından katalize edilebileceği iyi bilinmektedir, 23,24,25,26,27 hücre tipine veya hücresel bağlama bağlı bir şekilde. Bu proteazların tanımlanması ve karakterizasyonu büyük ölçüde enzimin in vivo kompleksine (ICE) testine^28,29 ve DNA eklenti geri kazanımına hızlı yaklaşıma (RADAR) testine^30,31 dayanmıştır^, her ikisi de DNA moleküllerini ve bunların kovalent bağlı proteinlerini serbest hücresel proteinlerden izole ederek çapraz bağlı proteinleri hedefleyen antikorları hedef alan antikorlar kullanarak DPC'lerin saptanmasına izin verir. Ayrıca, hapsolmuş agaroz DNA immün boyama (TARDIS) testi, tek hücre seviyesinde DPC'leri tespit etmek ve ölçmek için bir araç olarak kullanıldı³². Şu anda, araştırmacılar DPC'leri ölçmek için ICE testi yerine RADAR testini seçmektedir, çünkü ICE testi, son derece zaman alıcı olan sezyum klorür gradyan ultrasantrifüjleme kullanılarak nükleik asitlerin saflaştırılmasına dayanırken, RADAR testi çok daha kısa bir süre içinde etanol kullanarak nükleik asitleri çökeltir.

Son yıllarda, DPC hedefli proteazların 3,33,34,35 sinyalizasyonunda ve işe alınmasında çoklu translasyon sonrası modifikasyonların (PTM'ler) rol oynadığına dair artan kanıtlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, hem TOP1- hem de TOP2-DPC'lerin, DNA replikasyonu ve transkripsiyonundan bağımsız olarak, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO)-2/3 ve daha sonra SUMO-1'in SUMO E3 ligaz PIAS4 tarafından konjuge edildiği bulundu. Sıralı SUMO modifikasyonları, SUMOylated TOP-DPC'lere bırakılan ve RNF4 olarak adlandırılan SUMO hedefli bir ubikuitin ligaz tarafından lizin 48 kalıntısı yoluyla polimerik zincirler oluşturan ubikuitinin bir hedefi gibi görünmektedir. Daha sonra, ubikitin polimeri, 26S proteazomunu TOP-DPC'lere^23,36 bir sinyal verir ve işe alır. Aynı SUMO-ubiquitin yolunun yakın zamanda DNMT1-DPC'lerin yanı sıra onarımları için PARP-DNA kompleksleri üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir^37,38. Ek olarak, ubikuitin E3 ligaz TRAIP tarafından SUMO'dan bağımsız ubikitilasyonun, replikasyona bağlı bir şekilde proteazomal bozunma için DPC'leri hazırladığı bildirilmiştir³⁹. TOP-DPC'lerin proteazomal bozunmasına benzer şekilde, enzimatik ve enzimatik olmayan DPC'lerin replikasyona bağlı metalloprotaz SPRTN tarafından proteolizi ayrıca SPRTN^40,41'i devreye sokmak için bir mekanizma olarak DPC substratlarının her yerde bulunmasını gerektirir. SUMOylation ve ubiquitylation rolünün tanımlanması, bu PTM'lerle işaretlenmiş DPC'lerin algılanmasını gerektirir. Orijinal ICE tahlili ve RADAR tahlili, sindirilmemiş DNA örneklerini ölçmek için yarık-leke/nokta-leke aparatına dayandığından, bu iki testin hiçbiri farklı moleküler ağırlıklara sahip PTM konjuge DPC türlerini çözemez ve görselleştiremez. Bu sorunun üstesinden gelmek için, çapraz bağlı proteinleri serbest bırakmak için etanol çökeltme ve numune normalizasyonu ile saflaştırıldıktan sonra DNA örneklerini sindirdik, bu da proteinleri ve kovalent PTM'lerini sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile çözmemizi sağladı. Elektroforez, PTM'leri hedef alan spesifik antikorlar kullanarak PTM konjuge DPC'leri tespit etmemize ve ölçmemize izin verdi. Her yerde bulunan ve SUMOile edilmiş TOP-DPC'lerin tespitindeki sağlamlığını vurgulamak için başlangıçta bu geliştirilmiş yöntemi DUST testi olarak adlandırdık²³. Daha sonra, poli-ADP-riboz polimerlerine karşı antikorlar kullanarak in vivo TOP1-DPC'lerin ADP-ribozilasyonunu kantitatif olarak değerlendirmek için testin kullanımını genişlettik²⁰.

Burada, inhibitörleri tarafından indüklenen modifiye TOP-DPC'ler ve FA tarafından indüklenen spesifik olmayan/enzimatik olmayan DPC'ler için optimize edilmiş, her yerde bulunan, SUMOyleated ve ADP-ribosillenmiş DPC'leri tespit eden ve ölçen test için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, hücreleri kaotropik bir ajanla parçalayarak, DNA'yı etanol ile çökelterek ve aksi takdirde çapraz bağlı proteinleri ve bunların değiştiricilerini mikrokokal nükleaz ile serbest bırakarak PTM konjuge DPC'leri izole eder. Aksi takdirde DNA'ya bağlı proteinler ve bunların PTM'leri, spesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlama ile ölçülür. Bu tahlil, hücrenin hem enzimatik hem de enzimatik olmayan DPC'leri onardığı moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yeni bir yol açar. Spesifik olarak, TOP-DPC bozunması ve onarımının düzenlenmesi için önemli olan PTM'lerin indüksiyonu ve kinetiğinin ayrıntılı çalışmalarını mümkün kılar ve böylece PTM'leri dikte eden E3 ligazları gibi yeni faktörlerin keşfedilmesine izin verir, yanı sıra bu faktörleri hedef alan inhibitörler. TOP-DPC onarımından sorumlu PTM'lerin bazıları, platin bazlı ilaçlar²² gibi diğer kemoterapötikler tarafından indüklenen DPC'lerin onarımında yer aldığından, bu test aynı zamanda yeni ilaçların keşfine ve tedavi rejimlerine rehberlik etmek için hasta hücrelerinde topoizomeraz inhibitörleri veya platin bazlı antineoplastikler ile kombinatoryal tedavilerin rasyonel optimizasyonuna uygulama potansiyeline sahiptir.

1. İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre hattında hücre kültürü ve ilaç tedavisi

1. %10 fetal sığır serumu, %1 2 mM L-glutamin ve 100 ünite/mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiyeri (DMEM) kültür ortamını hazırlayın.
2. 60 mm'lik bir plakada 1 x 10 6 hücreyi veya tedavi koşulu artı kontrol başına⁶ oyuklu bir plakayı tohumlayın.
3. Ertesi gün, hücreleri tercih edilen DPC indükleyicileri ile tedavi edin.
   1. TOP1-DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylasyonunu indüklemek için, hücrelere 20 μM'de TOP1 inhibitörü kamptotekin ekleyin ve hücreleri 20, 60 ve 180 dakikada toplayın.
   2. TOP2α ve β-DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylasyonunu indüklemek için, hücrelerin hücrelere 200 μM'de TOP2 inhibitörü etoposid eklemesine ve hücreleri 20, 60 ve 180 dakikada toplamasına maruz bırakın.
   3. Enzimatik olmayan DPC'leri ve bunların her yerde bulunmasını ve SUMOylation'ını indüklemek için, 1 mM'de FA ekleyin ve maruziyetten 2 saat sonra hücreleri toplayın.
   4. TOP1-DPC'lerin PARilasyonunu indüklemek için, 10 μM'de PDD00017273 poli (ADP-riboz) glikohidrolaz (PARG) inhibitörü ile dePARilasyonu bloke etmek için hücreleri 1 saat ön işlemden geçirin, ardından 20, 60 ve 180 dakika boyunca 20 μM kamptoteksin ile birlikte tedavi edin.

2. Çapraz bağlı proteinler içeren DNA'nın izolasyonu ve normalizasyonu

1. İşlemden sonra ortamı bir emme pipeti ile hızlı bir şekilde aspire edin ve hücreleri buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. Hücreleri, 1x proteaz kokteyl inhibitörü, 1 mM ditiyotreitol (DTT) ve 20 mM N-etilmaleimid (deSUMOylalayıcı ve deubikitilleyici enzimlerin inhibitörü) içeren 600 μL DNAzol reaktifinde hemen parçalayın.
2. Plakayı titreşimli bir platform üzerinde 4 °C'de 10 dakika yavaşça çalkalayın.
3. Doğrudan plakaya 1/2 hacim %100 soğuk etanol (0,3 mL) ekleyin ve opak nükleik asit agregası görünür hale gelene kadar 2,2. adımı tekrarlayın. Hücre lizatını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve nükleik asidi ve çapraz bağlı proteinlerini çökeltmek için tüpü 4 ° C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda (20.000 x g) santrifüjlemeye tabi tutun.
4. Bir emme pipeti kullanarak süpernatanı aspire edin ve nükleik asit peletini 1 mL %75 etanol içinde yıkayın, ardından 4 °C'de 2 dakika 20.000 x g santrifüjleme yapın.
5. Süpernatanı aspire edin, aynı hızda döndürün ve kalan sıvıyı bir P20 pipeti kullanarak çıkarın. Peletleri 5 dakika havayla kurutun.
6. Nükleik asit peletini 0.1 mL ddH2O'da hızla çözün.Pelet, tekrarlanan pipetleme ile yeniden süspanse edin, ardından pelet en az üç kat daha büyük olana kadar (yaklaşık 30 dakika) 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
7. Peletin tamamen çözülmesi için numuneleri 10 saniye boyunca% 30 genlikte bir ultrasonik işlemci probu ile sonikleştirin.
8. İsteğe bağlı adım: Numuneleri RNase A/T1 karışımı (10 μg RNase A ve 25 U RNase T1) ile işlemden geçirin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Tüpe 1/10 hacim 3 M sodyum asetat ve iki hacim buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin, ardından DNA'yı almak için 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve çökeltilmiş DNA'yı 0.1 mL_ddH2O'daçözün.
9. İsteğe bağlı adım: Numuneyi 20.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
10. Ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Tipik DNA verimi 600-800 ng/μL civarındadır. RNA çıkarıldıktan sonra A260/A280 oranı 2.0-2.1'den 1.8-1.9'a düşürülmelidir.
11. DNA konsantrasyonunu 0.12 mL_ddH2O'da400-500 ng / μL'ye ayarlayın. Numunenin 20 μL'sini sindirilmemiş DNA yükleme kontrolü olarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (bkz. adım 2.4).
12. Kalan 100 μL ddH2O'da çözünen DNA'yı sindirmek için, numuneye 1/10 hacim (~ 11 μL) 10x kalsiyum mikrokoksiaz nükleaz reaksiyon tamponu ile birlikte 2.000 jel birim mikrokokal nükleaz ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

3. Sindirilmiş DNA örneklerinin batı lekelenmesi

1. 4x Laemmli numune tamponu ekleyin, ardından numuneyi 5 dakika kaynatın.
2. Modifiye edilmemiş ve PTM ile konjuge DPC'leri çözmek için %4-20 poliakrilamid jel üzerine 5-6 μg sindirilmiş numune (~15 μL) ve ardından SDS-PAGE⁴² yükleyin.
3. FA kaynaklı enzimatik olmayan DPC türlerini tespit etmek için, jeli gece boyunca oda sıcaklığında Coomassie mavi boyası ile inkübe edin. Jeli ddH 2 O ile₂saat yıkayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak bir görüntü elde edin.
4. Jeli aktarın ve membranları gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tamponda uygun primer antikor dilüsyonları ile inkübe edin.
   1. Ubikitilasyonu tespit etmek için, anti-ubikuitin antikorunun 1:100 oranında seyreltilmesini sağlayın.
   2. SUMO-1 veya SUMO-2/3 modifikasyonunu tespit etmek için, anti-SUMO-1 veya anti-SUMO-2/3 antikorunun 1:250 oranında seyreltilmesini sağlayın.
   3. ADP-ribozilasyonunu tespit etmek için, anti-PAR antikorunun 1:500 seyreltilmesini yapın.
   4. Toplam TOP1-, TOP2α- veya TOP2β-DPC'leri tespit etmek için anti-TOP1, anti-TOP2α veya anti-TOP2β antikorunun 1:500 seyreltilmesini yapın.
      NOT: Antikor seyreltmesi ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
5. 1x PBS-T (%0.1 ara 20) yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5.000 kat seyreltilmiş ikincil bir antikor ile inkübe edin.
6. Membranı gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi ile geliştirin ve görüntüleme sistemini kullanarak bir görüntü elde edin.

4. Sindirilmemiş DNA örneklerinin yuva lekelenmesi

1. 20 μL sindirilmemiş DNA örneğini 180 μL sodyum fosfat tamponu (25 mM, pH 6.6) içinde seyreltin.
2. Nitroselüloz membranı (0.45 μm) kesin ve sodyum fosfat tamponunda 5 dakika dengeleyin.
3. Yarık leke aparatını üreticinin talimatlarına göre monte edin ve bir vakum sistemine bağlayın.
4. Vakum uygulayarak kuyuları sodyum fosfat tamponu ile yıkayın. Kuyularda sızıntı olmadığından emin olun.
5. Vakumu durdurun ve numune başına 200 μL DNA yükleyin (1 μg). Boş kuyucukları 200 μL sodyum fosfat tamponu ile doldurun.
6. Vakumu uygulayın.
7. Tüm kuyucuklar tamamen boşaldığında, vakumu durdurun, her kuyucuğa 200 μL sodyum fosfat tamponu yükleyin ve adım 4.6'yı tekrarlayın.
8. Membranı alın ve oda sıcaklığında 0,5 saat boyunca %5 bloke edici tamponla bloke edin.
9. Anti-çift sarmallı DNA (dsDNA) antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de 1: 5.000 seyreltmede sondalayın.
10. 3x'i 1x PBS-T ile yıkayın ve 1: 5.000 seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) bağlantılı anti-fare ikincil antikoru ile inkübe edin.
11. Membranı gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi ile geliştirin ve görüntüleme sistemini kullanarak bir görüntü elde edin.

5. Dansitometrik analiz

1. ImageJ'yi kullanarak, her bir bandın/yaymanın yoğunluğunun sindirilmemiş DNA yuvasının yoğunluğuna oranını hesaplayın ve oranı, ilaç tedavisi olmayan/ilaç tedavisinden önceki hücrelerinkine göre normalleştirin.

Şekil 1'de sunulan temsili sonuçlar, ilaca bağlı TOP1-DPC'lerin oluşumunu ve kinetiğini ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ını göstermektedir. TOP1, DNA dupleksinin bir zincirini parçaladı ve TOP1 bölünme kompleksi (TOP1cc) olarak adlandırılan bir enzim-DNA kovalent ara maddesi oluşturdu. Bir TOP1 inhibitörü olan kamptothecin (CPT) tedavisi, TOP1cc'ye bağlanmış ve stabilize edilmiştir, bu da uzun ömürlü TOP1-DPC'lerin oluşumuna yol açar. TOP1-DPC'lerin indüklendiği ve CPT'ye maruz kaldıktan 20 dakika sonra zirveye ulaştığı gözlendi. Aynı zamanda, TOP1-DPC'ler, CPT tedavisinden 20 dakika sonra da zirve yapan SUMO-2/3 ile modifiye edildi. SUMO-2 ve SUMO-3 %95 dizi özdeşliğini paylaştığından, antikor birini diğerinden ayırt etmez. 60. dakikada, TOP1-DPC'ler ve SUMO-2/3 modifikasyonları, SUMO-1 modifikasyonlarının ve her yerde bulunmalarının doruk noktasıyla birlikte azaldı. 60 dakikalık ilaç tedavisinden sonra, TOP1-DPC SUMO-1 modifikasyonu ve ubikitilasyon seviyeleri düşmeye başladı. Memelilerde, TOP2 izozimleri α ve β, bir DNA çift sarmallı kırılması ve ayrıca geçici ve geri dönüşümlü bir enzim-DNA kovalent kompleksinin (TOP2cc) oluşumu yoluyla etki eder. Etoposid (ETOP) gibi TOP2 inhibitörleri, TOP2cc'yi TOP2-DPC'lere dönüştürür ve bunların SUMOylasyonunu ve ubikitilasyonunu indükler. TOP1-DPC'lerin ve bunların PTM'lerinin kinetiğine benzer şekilde, TOP2α- ve β-DPC'ler ve SUMO-2/3 modifikasyonları 20 dakikada zirveye ulaştı, ardından azalmaya başladı; bu arada, SUMO-1 ve ubikuitin modifikasyonları 60 dakikada zirveye ulaştı (Şekil 2). TOP-DPC'lerin klerensinin proteazomal bozunmadan kaynaklandığı gösterilmiştir ve TOP-DPC SUMOylation ve ubiquitylation'ın klirensi, muhtemelen tersine çevirici enzimleri tarafından sırasıyla deSUMOylation ve deubiquitylation yoluyla geri dönüşümden kaynaklanmaktadır. Şekil 3'teki deneyler, FA ile indüklenen enzimatik olmayan DPC'leri ve bunların PTM'lerini inceledi. DPC'lerin ve bunların SUMO-2/3, SUMO-1 ve ubikitilasyonunun FA dozuna bağlı bir şekilde oluştuğu ve biriktiği gözlendi. Son olarak, TOP1-DPC'lerin PARilasyonu, aynı yöntem kullanılarak bir anti-PAR antikoru ile kantitatif olarak tespit edildi (Şekil 4). Hücreye bir PARG inhibitörü eklenmedikçe TOP1-DPC PARilasyonu tespit edilemedi, bu da PARilasyonun hemen gerçekleştiğini ve oldukça dinamik olduğunu düşündürdü. Önceki bulgu ile tutarlı olarak, PARGi tarafından dePARilasyonun inhibisyonunun, muhtemelen proteolitik bozunmayı bloke ederek TOP1-DPC'leri biriktirdiği görülmüştür.

Şekil 1: HEK293 hücrelerinde CPT tedavisi üzerine TOP1-DPC'lerin oluşumu ve kinetiğinin ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ının kantitatif analizleri. (A) HEK293 hücreleri, belirtilen süreler boyunca 20 μM CPT ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HEK293 hücrelerinde ETOP tedavisi üzerine TOP2-DPC'lerin oluşumu ve kinetiğinin ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ının kantitatif analizleri. (A) HEK293 hücreleri, belirtilen süreler boyunca 200 μM ETOP ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: HEK293 hücrelerinde FA tedavisi üzerine enzimatik olmayan DPC'lerin kantitatif analizleri ve bunların SUMOylation ve ubiquitylation'ı. (A) HEK293 hücreleri, 2 saat boyunca belirtilen konsantrasyonlarda FA ile muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HEK293 hücrelerinde CPT tedavisi üzerine TOP1-DPC'lerin kantitatif analizleri ve bunların PARilasyonu. (A) HEK293 hücreleri, 1 saat boyunca 10 μM PARGi ile ön işleme tabi tutuldu ve daha sonra belirtilen süreler boyunca CPT ile birlikte muamele edildi. Hücre lizatları hasat edildi ve modifiye edilmiş RADAR testine ve belirtilen antikorlarla western blotlamaya tabi tutuldu. Sindirilmemiş DNA örnekleri, yükleme kontrolü olarak anti-dsDNA antikoru kullanılarak yuva lekelemeye tabi tutuldu. (B) Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı ile ölçüldü ve Prism yazılımı ile çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazar, hiçbir rakip çıkar beyan etmemektedir.