Yöntem makalesi

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 Nisan 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spatiotemporal gen transkripsiyonu, transkripsiyonu kontrol etmek için hedef gen promotörleriyle fiziksel yakınlığa dayanan arttırıcılar ve susturucular gibi distal düzenleyici unsurlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu düzenleyici elementlerin tanımlanması kolay olsa da, hedef genlerinin tahmin edilmesi zordur, çünkü çoğu hücre tipine özgüdür ve doğrusal genom dizisinde yüzlerce kilobaz ile ayrılabilir, diğer hedef olmayan genleri atlayabilir. Birkaç yıldır, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), distal düzenleyici elementlerin hedef genleriyle ilişkilendirilmesinde altın standart olmuştur. Bununla birlikte, PCHi-C, milyonlarca hücrenin mevcudiyetine dayanır ve birincil dokulardan yaygın olarak elde edilenler gibi nadir hücre popülasyonlarının incelenmesini yasaklar. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, genomun her genini kontrol eden distal düzenleyici elemanların repertuarını tanımlamak için uygun maliyetli ve özelleştirilebilir bir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C (liCHi-C) geliştirilmiştir. liCHi-C, PCHi-C ile benzer bir deneysel ve hesaplamalı çerçeveye dayanır, ancak minimum tüp değişiklikleri kullanarak, reaktif konsantrasyonunu ve hacimlerini değiştirerek ve adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, kütüphane inşaatı sırasında minimum malzeme kaybını hesaba katar. Toplu olarak, liCHi-C, gelişimsel biyoloji ve hücresel fonksiyon bağlamında gen regülasyonu ve mekansal temporal genom organizasyonunun incelenmesini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamansal gen ekspresyonu, hücre farklılaşmasını ve nihayetinde organizma gelişimini yönlendirir ve değişimi, çok sayıda hastalıkla yakından ilişkilidir 1,2,3,4,5. Gen transkripsiyonu, proksimal (yani gen promotörleri) ve distal (örneğin, arttırıcılar veya susturucular) olarak sınıflandırılabilen düzenleyici elementlerin etkisiyle ince bir şekilde düzenlenir, ikincisi sıklıkla hedef genlerinden uzakta bulunur ve gen ekspresyonunu modüle etmek için kromatin döngüsü yoluyla fiziksel olarak onlarla etkileşime girer 6,7,8.

Genomdaki distal düzenleyici bölgelerin tanımlanması üzerinde yaygın olarak anlaşmaya varılan bir konudur, çünkü bu bölgeler spesifik histon modifikasyonları 9,10,11 barındırır ve spesifik transkripsiyon faktörü tanıma motifleri içerir ve bunlar için işe alım platformları görevi görür12,13,14. Ayrıca, arttırıcılar ve süper arttırıcılar15,16 durumunda, aynı zamanda düşük nükleozom doluluk 17,18'e sahiptirler ve kodlamayan eRNA'lara 19,20'ye kopyalanırlar.

Bununla birlikte, her distal düzenleyici elementin hedef genlerini tahmin etmek daha zordur. Çoğu zaman, distal düzenleyici elementler ve hedefleri arasındaki etkileşimler hücre tipi ve uyarana özgü 21,22'dir, yüzlerce kilobaza yayılır, diğer genler üzerinde herhangi bir yönde köprü oluşturur 23,24,25 ve hatta hedef genlerinin veya diğer müdahale etmeyen genlerin intronik bölgelerinde bile bulunabilir26,27. Ayrıca, distal düzenleyici elementler aynı anda birden fazla geni kontrol edebilir ve bunun tersi de 28,29'dur. Bu konumsal karmaşıklık, aralarındaki düzenleyici ilişkileri belirlemeyi engeller ve bu nedenle, her düzenleyici elemanın her hücre tipindeki hedeflerinin çoğu bilinmemektedir.

Son yıllarda, kromatin etkileşimlerini incelemek için kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniklerinin geliştirilmesinde önemli bir patlama olmuştur. Bunlardan en yaygın kullanılanı olan Hi-C, bir hücrenin genomunun her bir parçası arasındaki tüm etkileşimlerin bir haritasını oluşturmaya izin verir30. Bununla birlikte, kısıtlama parçası düzeyinde önemli etkileşimleri tespit etmek için Hi-C, ultra derin dizilemeye dayanır ve bireysel genlerin düzenleyici manzarasını rutin olarak incelemek için kullanımını yasaklar. Bu ekonomik sınırlamanın üstesinden gelmek için, ChIA-PET 31, HiChIP32 ve düşük girdili muadili HiCuT33 gibi çeşitli zenginleştirme tabanlı3C teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu teknikler, belirli bir proteinin aracılık ettiği genom çapında etkileşimleri zenginleştirmek için antikorların kullanılmasına bağlıdır. Bununla birlikte, bu 3C tekniklerinin benzersiz özelliği aynı zamanda uygulamalarının felaketidir; Kullanıcılar, ilgilendikleri protein için yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine güvenir ve proteinin bağlanmasının dinamik olduğu koşulları karşılaştıramazlar.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), bu sınırlamaları aşan başka bir zenginleştirme tabanlı 3C tekniğidir34,35. PCHi-C, biyotinillenmiş bir RNA probu zenginleştirme sistemi kullanarak, promotör interaktom olarak da bilinen 28.650 insan veya 27.595 fare açıklamalı gen promotörü ile etkileşime giren genomik bölgelerin genom çapında yüksek çözünürlüklü kütüphanelerini üretebilir. Bu yaklaşım, hem aktif hem de inaktif promotörlerin kısıtlama fragmanı seviyesi çözünürlüğünde önemli uzun menzilli etkileşimleri tespit etmeyi ve histon modifikasyonlarının veya protein bağlanmasının dinamiklerinden bağımsız olarak herhangi bir durum arasındaki promotör etkileşimlerini sağlam bir şekilde karşılaştırmayı sağlar. PCHi-C, hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom reorganizasyonlarını tanımlamak için son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır 36,37, transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizmasını tanımlamak38,39 ve kodlamayan varyantlar tarafından hastalıkta deregüle edilmiş yeni potansiyel genler ve yollar keşfetmek 40,41,42,43,44,45,46,47,48, yeni sürücü kodlamayan mutasyonlarla birlikte49,50. Ayrıca, sadece yakalama sistemini değiştirerek, bu teknik herhangi bir interaktomu sorgulamak için biyolojik soruya göre özelleştirilebilir (örneğin, arttırıcı interaktom 51 veya kodlamayan değişiklikler koleksiyonunun interaktomu41,52).

Bununla birlikte, PCHi-C, tekniği gerçekleştirmek için en az 20 milyon hücreye dayanır, bu da gelişimsel biyoloji ve klinik uygulamalarda sıklıkla kullanılanlar gibi kıt hücre popülasyonlarının incelenmesini önler. Bu nedenle, düşük hücre girdili yüksek çözünürlüklü promotör etkileşimleri oluşturmak için PCHi-C'nin deneysel çerçevesine dayanan yeni bir uygun maliyetli ve özelleştirilebilir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C'yi (liCHi-C) geliştirdik. Deneyi minimum tüp değişiklikleriyle gerçekleştirerek, orijinal PCHi-C protokolünden adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, reaksiyon hacimlerini önemli ölçüde azaltarak ve reaktif konsantrasyonlarını değiştirerek, kütüphane karmaşıklığı en üst düzeye çıkarılır ve 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmak mümkündür53.

Düşük girdili Yakalama Hi-C (liCHi-C), PCHi-C ile karşılaştırılmıştır ve insan hematopoetik hücre farklılaşması sırasında promotör interaktom yeniden kablolamasını aydınlatmak, kodlamayan değişikliklerle deregüle edilen potansiyel yeni hastalıkla ilişkili genleri ve yolları keşfetmek ve kromozomal anormallikleri tespit etmek için kullanılmıştır53. Adım adım protokol ve teknik aracılığıyla farklı kalite kontrolleri, kütüphanelerin son nesline ve hesaplamalı analizlerine kadar burada detaylandırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimum malzeme kaybını sağlamak için, (1) DNA düşük bağlayıcı tüpler ve uçlarla çalışın (bakınız Malzeme Tablosu), (2) ucu numunenin içine sokmak yerine tüp duvarına reaktifler yerleştirin ve (3) mümkünse, numuneyi yukarı ve aşağı pipetlemek yerine ters çevirerek numuneyi karıştırın ve numuneyi geri kazanmak için daha sonra aşağı doğru döndürün.

1. Hücre fiksasyonu

  1. Süspansiyonda büyüyen hücreler
    1. 50.000 ila bir milyon hücre toplayın ve bunları düşük bağlanan 1.5 mL'lik bir DNA tüpüne yerleştirin.
      NOT: Bu çalışma için kullanılan hücre tipleri temsili sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır.
    2. Sabit açılı rotor santrifüjü kullanarak hücreleri 600 x g'de (4 °C'de) 5 dakika boyunca santrifüj edin ve pipetleme ile süpernatantı çıkarın.
    3. Oda sıcaklığında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL RPMI 1640'taki hücreleri yeniden askıya alın.
    4. % 2'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 143 μL metanol içermeyen% 16 formaldehit ekleyin ve karıştırın.
    5. Hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında dönerken hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: 10 dakikalık inkübasyonla mümkün olduğunca doğru olmaya çalışın. Hücrelerin aşırı veya az sabitlenmesi, kütüphanenin kalitesinde bir düşüşe neden olabilir.
    6. 164 μL buz gibi soğuk 1 M glisin ekleyerek reaksiyonu söndürün ve karıştırın. Hücreleri oda sıcaklığında döndürerek 5 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin, her ~ 5 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
    8. Sabit açılı rotor santrifüjü kullanarak hücreleri 1.000 x g'de (4 °C'de) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
    9. Peletleri 1 mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın.
    10. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.000 x g'de (4 ° C'de) santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
      NOT: Peletlenmiş hücreler sıvı azot veya kuru buzda flaş dondurulabilir ve -80 °C'de saklanabilir.
  2. Yapışkan hücreler
    1. Hücreleri kültür kabında 1x PBS ile yıkayın.
    2. Kültür kabını örtmek için oda sıcaklığında% 10 FBS ve% 2 metanol içermeyen% 2 formaldehit ile desteklenmiş yeterli RPMI 1640 hazırlayın.
    3. Takviye edilen medyayı hücrelerle birlikte kültür kabına ekleyin ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında sallayarak 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: 10 dakikalık inkübasyonla mümkün olduğunca doğru olmaya çalışın. Hücrelerin aşırı veya az sabitlenmesi, kütüphanenin kalitesinde bir düşüşe neden olabilir.
    4. 0.125 M'ye kadar 1 M glisin ekleyerek reaksiyonu söndürün ve sallayarak karıştırın.
    5. Hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin, oda sıcaklığında sallayın.
    6. Hücreleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin, her 3-4 dakikada bir sallayarak karıştırın.
    7. Ortamı çıkarın ve hücreleri soğuk 1x PBS ile yıkayın.
    8. Hücreleri kazıyın ve 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. Kültür kabını 0,5-1 mL soğuk 1x PBS ile temizleyin.
    9. Sabit açılı rotor santrifüjü kullanarak hücreleri 1.000 x g'de (4 °C'de) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş hücreler sıvı azot veya kuru buzda flaşla dondurulabilir ve -80 ° C'de saklanabilir.

2. Lizis ve sindirim

  1. Hücre zarını bozmak için hücreleri 1 mL soğuk lizis tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın. Tek başına tamponun eklenmesi, hücreleri yeniden askıya almak için yeterli olmalıdır, ancak gerekirse ışık vorteksi ile daha da yeniden askıya alınabilirler.
  2. Buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin, her ~ 5 dakikada bir ters çevirerek karıştırın. Çekirdekleri 1.000 x g'de (4 ° C'de) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Çekirdekleri 500 μL soğuk 1.25x kısıtlama tamponu 2 ile yeniden askıya alın (bkz.
  3. Çekirdekleri 1.000 x g'de (4 ° C'de) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Çekirdekleri 1.25x kısıtlama tamponu 2'nin 179 μL'sinde yeniden askıya alın.
  4. 5.5 μL% 10 sodyum dodesil sülfat (SDS; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karıştırın. Hücreler kümeler oluşturabilir; Bu normaldir ve vorteks ile mümkün olduğunca ayrıştırılması gerekir. Numuneyi bir termoblokta 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin, 950 rpm'de çalkalayın.
  5. SDS'yi 37,5 μL% 10 Triton X-100 ekleyerek söndürün ve karıştırın. Numuneyi bir termoblokta 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin, 950 rpm'de çalkalayın.
  6. 7.5 μL HindIII (100 U / μL; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek kromatini sindirin ve karıştırın. Numuneyi bir termoblokta gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin, 950 rpm'de çalkalayın.
  7. Ertesi sabah, fazladan 2,5 μL HindIII (100 U / μL) ekleyin ve numuneyi bir termoblokta 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin, uygun kromatin sindirimini sağlamak için 950 rpm'de çalkalayın.
    NOT: Sindirim verimliliği kontrollerinin bir parçası olarak (bkz. adım 5.1), sindirilmemiş kontrolü temsil etmek için 20.000 ila 40.000 çekirdeğin eşdeğerini başka bir tüpe aktarın. Sindirimden sonra, sindirilmiş kontrolü temsil etmek için aynı sayıda hücreyi tekrar başka bir tüpe aktarın. Başlangıç malzemesinin mevcudiyeti azsa, sindirim verimliliğini ayrı bir deney olarak test etmeniz önerilir.

3. Ligasyon ve çapraz bağlama

  1. Numuneyi buz üzerinde soğutun. Bir mastermix hazırlayın ve kısıtlama parçası çıkıntılarını doldurmak ve biyotinile etmek için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 3 μL 10x kısıtlama tamponu 2, 1 μL nükleaz içermeyen su, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotin-14-dATP ve 5 μL 5 U/μL Klenow (bkz. Numuneyi 37 ° C'de 75 dakika boyunca inkübe edin, her ~ 15 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
  2. Numuneyi buz üzerinde soğutun. Bir mastermix hazırlayın ve doldurulmuş DNA uçlarını bağlamak için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 50 μL 10x ligasyon tamponu, 2.5 μL 20 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 12.5 μL 1 U / μL T4 DNA ligaz ve 173 μL nükleaz içermeyen su (bkz.
  3. Numuneyi 16 ° C'de 4-6 saat inkübe edin, her ~ 1 saatte bir ters çevirerek karıştırın. Ayrıca, numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 μL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyerek kromatini çapraz bağlayın ve karıştırın. Numuneyi gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
  4. Ertesi sabah, fazladan 15 μL 10 mg / mL Proteinaz K ekleyin ve uygun kromatin çapraz bağlantısını sağlamak için numuneyi 65 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.

4. DNA saflaştırma

  1. Numuneyi oda sıcaklığına soğutun ve fenol-kloroform saflaştırma için uygun bir tüpe aktarın.
  2. DNA'yı saflaştırmak ve kuvvetlice çalkalayarak karıştırmak için 1 hacim (545 μL) fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) ekleyin.
  3. Numuneyi oda sıcaklığında 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst sulu fazı (545 μL) 2 mL DNA düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  4. DNA'yı çökeltmek için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: -20 ° C'ye soğutulmuş 1.362.5 μL% 100 etanol, 54.5 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 2 μL 15 mg / mL glikojen bir kopresipitant olarak.
  5. -80 ° C'de 1 saat veya -20 ° C'de bir gece boyunca inkübe edin.
  6. Numuneyi 4 °C'de 16.000-21.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. DNA pelet görünür olmalıdır.
  7. Pelet, 1 mL% 70 etanol, vorteks ekleyerek ve oda sıcaklığında 16.000-21.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yaparak yıkayın.
  8. Süpernatantı çıkarın ve peletin havayla kurumasını bekleyin. DNA peletini 130 μL nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
  9. Florometrik niceleme ile konsantrasyonu değerlendirin (bakınız Malzeme Tablosu). Protokole devam etmeden önce saflaştırılmış 3C malzemeyi birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.

5. İsteğe bağlı kalite kontrolleri

  1. Sindirim verimliliğini değerlendirin. Çapraz bağlama ve fenol: kloroform DNA saflaştırmasını, daha önce açıklandığı gibi, adım 2.13'te elde edilen sindirilmemiş ve sindirilmiş kontrollere gerçekleştirin. DNA peletini 10 μL nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın. Konsantrasyonu ölçün ve elde edilen DNA'yı gerekirse 4 ng / μL'ye seyreltin.
  2. Hem sindirilmemiş hem de sindirilmiş kontrollerin 4 ng DNA'sı ile kantitatif PCR'yi, HindIII hedefi olan ve olmayan açık bir kromatin lokusunu kapsayan primerlerle gerçekleştirin (astar tasarımı için Tablo 2'ye bakınız). Daha önce yayınlanmış bir raporu takiben sindirimin verimliliğini hesaplayın35.
    NOT: Ligasyonun verimliliği, şu formül kullanılarak yüzde olarak hesaplanır: sindirim (%) = 100 -100/(2^[(HindIII ile sindirilen Ct - HindIII olmadan sindirilmiş Ct) - (HindIII ile sindirilmemiş Ct - HindIII olmadan sindirilmemiş Ct)]) (bkz. Tablo 3), sindirilmemiş ve sindirilmiş kontrollerde her bir primer çifti için elde edilen farklı Ct'lerin farkını dikkate alır.
  3. Hem uzun hem de kısa menzilli hücre değişmez etkileşimlerini kapsayan primerlerle geleneksel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm hem F + R primerleri, 0,1 ve U/μL sıcak başlangıç polimeraz) gerçekleştirerek etkileşim tespitinin hassasiyetini değerlendirin (astar tasarımı için Tablo 2'ye bakınız). 50-100 ng 3C malzeme kullanın (sırasıyla kısa ve uzun menzilli etkileşimler için) ve aşağıdaki koşulları kullanarak yükseltin: 15 dakika boyunca 98 ° C, ardından 30 dakika için 98 ° C'lik 37 döngü, 1 dakika için 60 ° C, 1 dakika için 72 ° C ve 10 dakika boyunca 72 ° C ile bitirin. 4 °C'de tutun.
    NOT: Elde edilen DNA miktarı 2 μg'den azsa, tüm etkileşim paneli yerine yalnızca uzun ve kısa menzilli bir etkileşimi kontrol edin.
  4. Ürünü% 1.6 agaroz jeli kullanarak 1x tris-borat-EDTA (TBE) üzerinde çalıştırın ve karşılık gelen PCR amplikon54'ün varlığını arayın.
    NOT: Genomun öngörülemeyen "kesme ve yapıştırma" nedeniyle, spesifik olmayan bantlar ortaya çıkabilir. Doğru bant büyüklüğü gözlendiği sürece, doğru olarak sayılır.
  5. Kısa menzilli bir PCR ürününü HindIII, NheI ( Malzeme Tablosuna bakınız), hem enzimler hem de hiçbiri (su) ile farklı şekilde sindirerek ve ürünü 1x TBE% 1.6 agaroz jeli üzerinde çalıştırarak biyotin doldurma ve ligasyonunun verimliliğini değerlendirin. Doğru bir doldurma ve ligasyon, önceki HindIII hedefini ortadan kaldırır ve yeni bir NheI hedefi oluşturur, bu nedenle amplikon sadece NheI varlığında kesilmelidir.
    NOT: Malzeme kaybını en aza indirmek için, etkileşim kontrollerinden 2,5 μL kısa menzilli PCR ürünü alın ve doldurma ve bağlama kontrollerini gerçekleştirmek için beş kez yeniden yükseltin.

6. Sonication

  1. Numunenin 130 μL'sini (bazıları kontroller için kullanılmışsa nükleaz içermeyen su ile doldurun) sonikasyon için uygun bir küvete aktarın.
  2. Bir su banyosu sonikatörünü kurun ve aşağıdaki parametreleri kullanarak sonikleştirin ( Malzeme Tablosunda açıklanan model ve küvetler için optimize edilmiştir): görev faktörü:% 20; tepe insidans gücü: 50; patlama başına döngü: 200; Süre: 65 sn; ve sıcaklık aralığı: 6-10 °C (8 °C optimal).
  3. Numuneyi yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlama tüpüne aktarın.

7. Son onarım

  1. Bir mastermix hazırlayın ve sonikasyon sırasında oluşturulan DNA parçalarının düzensiz uçlarını onarmak için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 18 μL 10x ligasyon tamponu, her biri 18 μL 2.5 mM dNTP karışımı, 6.5 μL 3 U / μL T4 DNA polimeraz, 6.5 μL 10 U / μL T4 PNK ve 1.3 μL 5 U / μL Klenow (bkz.
  2. Numuneyi 20 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve Tris-düşük EDTA (TLE) tamponu ( bakınız Tablo 1) ile 300 μL arasında doldurun.

8. Biotin aşağı çekilme

  1. Numune başına 150 μL C1 streptavidin boncuklarını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın, 1,5 mL'lik bir tüp mıknatısa yerleştirin ve 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin. Boncukları geride bırakarak süpernatanı çıkarın.
  2. Boncukları 400 μL 1x Tween tamponu ile yıkayın (TB; bakınız Tablo 1). Boncukları yıkamak için tamponu ekleyin ve yumuşak vorteks ile tekrar askıya alın. Tüpü mıknatısa geri yerleştirin ve 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin. Boncukları geride bırakarak süpernatanı çıkarın.
  3. Boncukları 300 μL 1x aralama tamponu olmadan yıkayın (NTB; bkz. Tablo 1). Boncukları 300 μL 2x NTB'de yeniden askıya alın (bkz. Tablo 1).
    NOT: Boncuklar, deterjansız tamponlarla yıkarken tüp duvarının etrafında tozlu bir tabaka oluşturabilir. Bu normaldir ve protokolün sonucunu etkilemez.
  4. Bu 300 μL boncuğu 2x NTB'de numunenin 300 μL'si ile birleştirin. Bilgilendirici DNA parçalarını biyotin ile aşağı çekmek için oda sıcaklığında dönerek 15 dakika boyunca inkübe edin. Kütüphane şimdi C1 streptavidin boncuklarına yapışmıştır.
  5. Boncukları 400 μL 1x NTB ile yıkayın. Boncukları 100 μL TLE tamponu ile yıkayın ve daha sonra 35.7 μL TLE tamponunda tekrar askıya alın.

9. dATP-tailing, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu

  1. Bir mastermix hazırlayın ve onarılan DNA fragmanlarının uçlarını dATP-kuyruğuna sokmak için numuneye aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 5 μL 10x kısıtlama tamponu 2, 2.3 μL 10 mM dATP ve 7 μL 5 U / μL Klenow exo-. Numuneyi 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Klenow exo- numuneyi 65 ° C'de 10 dakika daha inkübe ederek devre dışı bırakın. Numuneyi buz üzerinde soğutun. Boncukları 300 μL 1x TB ile yıkayın. Boncukları 300 μL 1x NTB ile yıkayın.
  3. Boncukları 100 μL 1x ligasyon tamponu ile yıkayın ve daha sonra 50 μL 1x ligasyon tamponunda tekrar askıya alın. Numuneye 4 μL 15 μM önceden tavlanmış adaptör karışımı (bakınız Tablo 2) ve 1 μL 2.000 U/μL T4 DNA ligaz (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Boncukları 400 μL 1x TB ile yıkayın. Boncukları 200 μL 1x NTB ile yıkayın. Boncukları 100 μl 1x kısıtlama tamponu 2 ile yıkayın.
  5. Boncukları 50 μL 1x kısıtlama tamponu 2 ile yıkayın ve daha sonra 50 μL 1x kısıtlama tamponu 2'de tekrar askıya alın.
  6. Kütüphaneyi büyütmek üzere PCR reaksiyonunu hazırlamak için aşağıdaki reaktifleri karıştırın: kütüphane ile 50 μL boncuk, enzim ile 250 μL 2x PCR mastermix, 12 μL F + R primerleri (her biri 25 μM; bakınız Tablo 2) ve 188 μL nükleaz içermeyen su.
  7. PCR'yi aşağıdaki koşullarla gerçekleştirin (PCR reaktif karışımını 50 μL reaksiyonlarına bölün): 40 s için 98 °C, ardından 10 s için 98 °C, 30 s için 65 °C, 30 s için 72 °C X döngüleri ve 10 dakika boyunca 72 °C bitirin. 4 °C'de tutun.
    NOT: Kütüphane yakalamadan önce 500-1.000 ng çıkış hedefleyen diploid hücrelerde protokolü optimize etmek için başlangıç noktası olarak aşağıdaki döngü sayısını kullanın: sekiz döngü için bir milyon hücre; 10 döngü için 250.000 hücre; 12 döngü için 50.000 hücre.
  8. Aynı numunedeki tüm 50 μL reaksiyonları 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe toplayın, 1.5 mL'lik bir tüp mıknatısına yerleştirin ve 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin.
  9. Kütüphaneyi (500 μL) içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlamalı tüpe aktarın. Süpernatantın bir kısmı kaybolmuşsa TLE tamponu ile 500 μL'ye kadar doldurun. C1 streptavidin boncuklarına artık ihtiyaç duyulmamaktadır.
  10. Paramanyetik boncuk saflaştırma (0.4-1 hacim) kullanarak çift taraflı bir seçim55 gerçekleştirin. Bu, eklenen paramanyetik boncukların polietilen glikol ve tuz konsantrasyonuna bağlı olarak çok büyük (>1.000 bp) ve çok küçük fragmanların veya PCR primerlerinin (<200 bp) seçici olarak elimine edilmesine izin verir.
  11. Kütüphaneye 200 μL (0,4 hacim) stok boncuk ekleyin ve vorteks yaparak karıştırın. Oda sıcaklığında dönerek 10 dakika boyunca inkübe edin.
  12. Bir mıknatısın üzerine yerleştirin, 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin ve kütüphaneyi içeren süpernatantı (daha büyük parçalar olmadan) yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  13. Boncukları 750 μL stok boncuk alarak konsantre edin, bir mıknatıs üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin, 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin, süpernatanı çıkarın ve boncukları 300 μL yeni stok boncuklarında girdap yaparak yeniden askıya alın.
  14. Bu 300 μL konsantre boncukları numuneye (1 hacim) ekleyin ve vorteks ile karıştırın. Oda sıcaklığında dönerek 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir mıknatısın üzerine yerleştirin, 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin ve süpernatantı çıkarın (daha küçük parçaları ve PCR primerlerini içeren).
  15. Boncukları 1 mL% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Bunu yapmak için, boncuklu tüp hala mıknatısın üzerindeyken, boncukları rahatsız etmemeye çalışarak etanol ekleyin ve 30-60 s bekleyin. Daha sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
  16. Boncukların hava ile kurumasına izin verin ve vorteks yoluyla 21 μL TLE tamponunda yeniden askıya alın.
    NOT: Boncukların aşırı kuruması, DNA'yı salınırken verimi azaltabilir. Etanolden artık "parlak" olmadıklarından hemen sonra onları TLE tamponunda yeniden askıya almayı hedefleyin.
  17. Kütüphaneyi boncuklardan çıkarmak için numuneyi 37 ° C'de bir termoblokta 10 dakika boyunca inkübe edin. Tüpü bir mıknatısa yerleştirin ve kütüphaneyi içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  18. Otomatik elektroforez ile boyut ve konsantrasyonu ölçün (bkz. Saflaştırılmış Hi-C malzeme, protokole devam etmeden önce birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.

10. Kütüphane yakalama

  1. 500-1.000 ng kütüphane ile çalışın. DNA'yı bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutarak ve materyali 3.4 μL nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alarak kütüphaneyi konsantre edin.
  2. Hedef zenginleştirme kitinden aşağıdaki engelleyicileri örneğe ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu): 2,5 μL Engelleyici 1, 2,5 μL Engelleyici 2 ve adaptörler için 0,6 μL özel oligo engelleyici.
  3. İyice askıya alın, çözeltiyi 0,2 mL'lik bir PCR şeridine aktarın ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca bir termosiklerde inkübe edin, ardından ısıtılmış bir kapakla 65 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Tüpü 65 ° C'de inkübe etmeye bırakın.
  4. Hedef zenginleştirme kitinden (bkz. Malzeme Tablosu) aşağıdaki reaktifleri numune başına (13 μL) birleştirerek hibridizasyon çözeltisini hazırlayın. Tezgahta oda sıcaklığında tutun: 6,63 μL Hyb 1, 0,27 μL Hyb 2, 2,65 μL Hyb 3 ve 3,45 μL Hyb 4.
  5. Hedef zenginleştirme kitinden 0,5 μL RNaz bloğunu numune başına 1,5 μL nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Buz üzerinde numune başına 5 μL biyotinile RNA'yı çözün ve seyreltilmiş RNaz bloğunun 2 μL'sini ekleyin. Tezgahta oda sıcaklığında saklayın.
  6. Hibridizasyon çözeltisinin 13 μL'sini RNaz ile biyotinillenmiş RNA'nın 7 μL'sine ekleyin ve iyice karıştırın.
  7. 65 ° C'de termosikler üzerindeyken, hibridizasyon çözeltisini biyotinile RNA (20 μL) ile bloke edilmiş kütüphaneye aktarın. Tüp kapağını sıkıca kapatın ve termosiklerde gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Aynı anda birden fazla numune gerçekleştirirken numune buharlaşmasını en aza indirmek için (optimal olmayan RNA-DNA hibridizasyonuna yol açabilir), biyotinile RNA'yı aynı anda her kütüphaneye aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

11. Biotin aşağı çekme ve PCR amplifikasyonu

  1. Numune başına 50 μL T1 streptavidin boncuklarını 1,5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın, 1,5 mL'lik bir tüp mıknatısa yerleştirin ve 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin. Boncukları geride bırakarak süpernatanı çıkarın. Boncukları, hedef zenginleştirme kitinden 200 μL bağlama tamponu ile üç kez yıkayın.
  2. Boncukları 200 μL bağlama tamponunda tekrar askıya alın. Termosiklerle, 65 ° C'deyken, numuneyi yeniden askıya alınmış T1 streptavidin boncuklarına aktarın ve oda sıcaklığında dönerek 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Boncukları hedef zenginleştirme kitinden 200 μL yıkama tamponu 1 ile yıkayın. Oda sıcaklığında dönerek 15 dakika inkübe edin. Boncukları, 65 °C'ye ısıtılmış hedef zenginleştirme kitinden 200 μL yıkama tamponu 2 ile üç kez yıkayın. Bir termoblokta 65 ° C'de 10 dakika inkübe edin, yıkamalar arasında 300 rpm'de çalkalayın.
  4. Boncukları 200 μL 1x kısıtlama tamponu 2 ile yıkayın ve daha sonra 30 μL 1x kısıtlama tamponu 2'de tekrar askıya alın.
  5. Kütüphaneyi yükseltmek üzere PCR reaksiyonunu hazırlamak için aşağıdaki reaktifleri karıştırın: kütüphane ile 30 μL boncuk, enzim ile 150 μL 2x PCR mastermix, 7.2 μL F + R primerleri (her biri 25 μM; bakınız Tablo 2) ve 112.8 μL nükleaz içermeyen su.
  6. PCR'yi aşağıdaki koşullarla gerçekleştirin (PCR reaktif karışımını 50 μL reaksiyonlara bölün): 40 s için 98 °C, ardından 10 s için 98 °C, 30 s için 65 °C, 30 s için 72 °C olmak üzere dört döngü ve 10 dakika boyunca 72 °C ile bitirin. 4 °C'de tutun.
  7. Aynı numunedeki tüm 50 μL reaksiyonları 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı bir tüpe toplayın, 1.5 mL'lik bir tüp mıknatısına yerleştirin ve 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin.
  8. Kütüphaneyi (300 μL) içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlanmalı tüpe aktarın. Süpernatantın bir kısmı kaybolmuşsa TLE tamponu ile 300 μL'ye kadar doldurun. T1 streptavidin boncuklarına artık ihtiyaç duyulmamaktadır.
  9. Paramanyetik boncuklar kullanarak bir DNA saflaştırması gerçekleştirin (0.9 hacim; bakınız Malzeme Tablosu). Numuneye 270 μL stok boncuk ekleyin ve vorteks yaparak karıştırın.
  10. Oda sıcaklığında dönerek 10 dakika boyunca inkübe edin.
  11. Bir mıknatısın üzerine yerleştirin, 2-3 dakika veya tüm boncuklar duvara yapışana kadar bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
  12. Boncukları 1 mL% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Bunu yapmak için, boncuklu tüp hala mıknatısın üzerindeyken, boncukları rahatsız etmemeye çalışarak etanol ekleyin ve 30-60 s bekleyin. Daha sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
  13. Boncukların hava ile kurumasına izin verin ve vorteks yoluyla 21 μL TLE tamponunda yeniden askıya alın.
    NOT: Boncukların aşırı kuruması, DNA'yı salınırken verimi azaltabilir. Etanolden artık "parlak" olmadıklarından hemen sonra onları TLE tamponunda yeniden askıya almayı hedefleyin.
  14. Kütüphaneyi boncuklardan çıkarmak için numuneyi 37 ° C'de bir termoblokta 10 dakika boyunca inkübe edin.
  15. Tüpü bir mıknatısa yerleştirin ve kütüphaneyi içeren süpernatantı yeni bir 1.5 mL DNA düşük bağlayıcı tüpe aktarın.
  16. Otomatik elektroforez ile boyut ve konsantrasyonu ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C, 50.000 hücreye kadar yüksek kaliteli ve çözünürlüklü genom çapında promotör interaktom kütüphaneleri üretme imkanı sunar53. Bu, reaksiyon hacimlerinin ciddi şekilde azaltılması ve protokol boyunca DNA düşük bağlayıcı plastik eşyaların kullanılmasının yanı sıra, önemli malzeme kayıplarının meydana geldiği orijinal protokolden gereksiz adımların kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. Bunlar, çapraz bağlamadan sonra fenol saflaştırma, biyotin giderimi ve ardından fenol-kloroform saflaştırma ve et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C, PCHi-C'lerden benzer bir deneysel çerçeve kullanarak yüksek çözünürlüklü promotör interaktom kütüphaneleri oluşturma yeteneği sunar, ancak büyük ölçüde azaltılmış hücre sayısına sahiptir. Bu, fenol saflaştırma ve biyotin giderimi gibi gereksiz adımları ortadan kaldırarak büyük ölçüde elde edilir. Klasik çekirdek içi ligasyon Hi-C protokolü57 ve sonraki türev tekniği PCHi-C'de, biyotin, daha sonra bilgilendirici olmayan DNA parçalarının aşağı çekilmesini önlemek için bağlanmamış kısıtlama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Javierre laboratuvarından diğer üyelere makale hakkındaki geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Kurumsal destek için CERCA Programı'na, Generalitat de Catalunya'ya ve Josep Carreras Vakfı'na teşekkür ederiz. Bu çalışma FEDER/İspanya Bilim ve İnovasyon Bakanlığı (RTI2018-094788-A-I00), Avrupa Hematoloji Derneği (4823998) ve İspanyol Kansere Karşı Birliği (AECC) LABAE21981JAVI tarafından finanse edilmiştir. BMJ, La Caixa Bankacılık Vakfı Genç Lider projesi (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR bir AGAUR FI bursu (2019FI-B00017) ve LT-D bir FPI Bursu (PRE2019-088005) tarafından finanse edilmektedir. Universitat Autònoma de Barcelona biyokimya ve moleküler biyoloji doktora programına destekleri için teşekkür ederiz. Fon verenlerin hiçbiri deneysel tasarımın veya el yazması yazımının herhangi bir noktasında yer almadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SEl yazmasında kısıtlama tamponu 2 olarak atıfta bulunulmuştur
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponuNew England BiolabsB0202S
%16 formaldehit çözeltisi (a/h), metanol içermezThermo Scientific28908
20 mg/mL Sığır Serum AlbüminiNew England BiolabsB9000S
5 M NaClİnvitrojenAM9760G
5PRIME Faz Kilit Jeli Işık tüpleriQiuantabio 2302820Bölüm 4 fenol-kloroform saflaştırması için (DNA saflaştırması). Faz Kilitli Jel tüpleri, fenol-kloroform saflaştırmalarından sonra DNA geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için özel olarak tasarlanmış ticari bir tüp türüdür ve organik ve sulu faz arasına yerleşen ve bunları izole eden orta yoğunlukta bir reçine içererek organik fazdaki kirleticilerin taşınmasını önler. PLG tüpleri, reçinenin tüpün dibine iyi bir şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için kullanmadan önce 30 saniye boyunca 12.000 x g'da döndürülmelidir.
Kütüphane amplifikasyonu için adaptörler ve PCR primerleriEntegre DNATeknolojileri-NGS için PAGE saflaştırmalı bireysel primerler olarak satın alındı
Hücre sıyırıcılarNunc179693Veya başka bir marka
Santrifüj (1,5 mL tüpler için sabit açılı rotor)Herhangi bir marka
CHiCAGO R paketi1.14.0
CleanNGS boncuklarıCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AVeya başka bir marka
DNA LoBind tüpü, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tüpü, 2 mLEppendorf30108078
DNA polimeraz I büyük (Klenow) parça 5000 birim / mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 boncuklarıInvitrogen65002 bölüm 8'de önceden yakalanan kitaplığın biyotin çekmesi için (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 boncuklarıInvitrogen65602 Bölüm 11 (biyotin aşağı çekme ve PCR amplifikasyonu)
DynaMag-2Invitrogen12321DVeya 1.5 ml tüp için uygun başka herhangi bir mıknatısL
Etanol mutlakVWR20821.321
FBS, nitelikliGibco10270-106Veya başka bir marka
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue KopreçökitanİnvitrojenAM9515Bölüm 4'te DNA birlikte çökeltme için kullanılır< / güçlü> (DNA saflaştırması)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/&mikro; LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 birim / mLNew England BiolabsM0212L
Düşük tutma filtre uçları ( 10 ve mikro; L, 20 ve mikro; L, 200 ve mikro; L ve 1000 &mikro; L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Odaklanmış ultrasonicatorCovaris500295
Mikro TÜP AFA Fiber Ön yarık çıtçıtlı kapak 6 x 16 mm şişelerCovaris520045 6 / güçlü < bölümünde sonikasyon için> (sonikasyon)
NheI-HF, 100 U /&mikro; LNew England BiolabsR3131M
Nükleaz içermeyen moleküler biyoloji sınıfı suSigma-AldrichW4502
PCR primerleriEntegre DNATeknolojileri-PCR
şeritleri  ve kapaklarAgilent Technologies410022, 401425
Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol 25:24:1, 10 mM Tris ile Doymuş, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  HF Tamponu ile Yüksek Kaliteli PCR Master KarışımıNew England BiolabsM0531L Bölüm 9'da kütüphanenin amplifikasyonu için (dATP tailing, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu)
ve 11 (biotin pull-down ve PCR amplifikasyonu)
Proteaz inhibitör kokteyli (EDTA içermez)Roche11873580001
Proteinaz K, rekombinant, PCR sınıfıRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA Yüksek Hassasiyet kitiInvitrogenQ33230Bölüm 4 (DNA saflaştırma) çökeltmeden sonra DNA ölçümü için
Qubit tahlil tüpleriInvitrogenQ32856
rCutsmart tamponuNew England BiolabsB6004S
RPMI Orta 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Veya başka bir marka
SDS - Moleküler biyoloji için çözelti% 10PanReac AppliChemA0676
Sodyum asetat pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect özel 3-5.9 Mb kitaplığıAgilent Technologies5190-4831Yakalama için kullanılan özel tasarlanmış fare veya insan yakalama sistemi
SureSelect Hedef Zenginleştirme Kutusu 1Agilent Technologies5190-8645Yakalama için kullanılır
SureSelect Hedef Zenginleştirme Kiti ILM PE Tam AdaptörAgilent Technologies931107Yakalama
T4 DNA ligaz 1 U/µ için kullanılır; LInvitrogen15224025 Bölüm 3 (ligasyon ve çapraz bağlantı) ligasyonu için)
T4 DNA ligaz 2000000 / mLNew England BiolabsM0202T Bölüm 9< / strong>'daki ligasyon için (dATP kuyruğu, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu) T4
DNA polimeraz 3000 birim / mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 birim / mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 cihazıAgilent TechnologiesBölüm 9'da otomatik elektroforez için (dATP kuyruğu, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu) ve
bölüm 11 (Biyotin çekme ve PCR amplifikasyonu). Diğer herhangi bir otomatik elektroforez sistemi geçerlidir
Tapestation reaktifleriAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Bölüm 9 (dATP kuyruğu, adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu) ve
bölüm 11 (Biyotin çekme ve PCR amplifikasyonu). Diğer herhangi bir otomatik elektroforez sistemi geçerlidir
Triton X-100 moleküler biyoloji içinPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
Kalite kontrolleri için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16(2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384(2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610(2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161(2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121(2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222(2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923(2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165(2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526(2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154(2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615(2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81(2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268(2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923(2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86(2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310(2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175(2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127(2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859(2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924(2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938(2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Promot r Yakalama Hi CD k Girdi Yakalama Hi CSpatiotemporal Genom MimarisiKromatin OrganizasyonuGen Reg lasyonu3D Genom OrganizasyonuDistal D zenleyici ElementlerKromatin Etkile imiDNA K t phanesi Haz rlama

İlgili makaleler