Yeni Bir Soğutma Hücresi İşlemci Sisteminin Adacık Hücresi İzolasyon Tesisi Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

Summary

Buradaki protokol, işlem sonrası hücre canlılığını artırmak için iyi üretim uygulamaları (GMP) temiz odasıyla uyumlu özel bir soğutma hücresi işlemci sistemini tanımlar.

Abstract

Klinik transplantasyon için insan adacıklarını saflaştırmak için altın standart hücre işlemcisi de dahil olmak üzere standart hücre tedavisi ekipmanı, nadiren soğutulur ve santrifüjleme adımı sırasında hücreleri potansiyel olarak yüksek sıcaklıklara maruz bırakır. Özel soğutma sistemleri, insan adacık canlılığı ve işlevi üzerinde doğrudan bir faydaya sahiptir. Mevcut çalışma, minimum modifikasyon gerektiren yeni geliştirilmiş, hazır bir soğutulmuş hücre işlemci sisteminin etkinliğini test etmek ve insan hücresi yaşayabilirliği ve GMP temiz oda ortamı üzerindeki etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır. -30 °C'ye ayarlanmış, mekanik olarak soğutulmuş bir ısı eşanjörü olan soğutucu sistem, santrifüj kapağında açılan bir delikten hücre işlemci çanağına soğutulmuş tıbbi sınıf kuru hava vermek için kullanıldı. Katar'da pankreas donörlerinin sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, havuzlanmış insan kemik iliği buffy ceketinin sürekli yoğunluk gradyan saflaştırılması ile sistem doğrulaması yapıldı. Sterilite, türbülans ve partikül sayısı C sınıfı ve B sınıfı temiz oda ortamlarında ölçüldü. Soğutulmuş hücre işlemcisinin etrafında herhangi bir türbülans gelişmedi ve temiz oda GMP standartlarına göre aşırı 0,5 μm ve 5 μm havadaki partiküller oluşmadı. Toplama adımlarının başında ve sonunda, sıcaklık soğutmasız hücre işlemcisinde sırasıyla 0,34 °C± 21,93 °C ve 0,20 °C ± 21,93 °C'ye ve soğutulmuş hücreli işlemcide 0,17 °C ± sadece 10,9 °C ve 0,35 °C ± 11,16 °C'ye yükselmiştir (p <0,05). Soğutulmuş hücre işlemcisi, hem mononükleer hücre fraksiyonunun daha iyi geri kazanılmasına (% 98) hem de işlem sonrası canlılığa (% 100 ±% 2) yol açtı. Yeni soğutma sistemi, hücre işlemcisi tarafından üretilen ısıyı etkili bir şekilde azaltırken, GMP temiz oda ortamı üzerinde partikül etkisi yaratmaz. Burada açıklanan soğutulmuş hücre işlemcisi, sağlam soğutma sağlamak için ucuz (vergiler, gümrükleme ve nakliye dahil olmadan 16.000 $) ve minimal invaziv bir yöntemdir. Şu anda, GMP hücre tedavisi tesisindeki bu teknoloji, klinik program için insan adacık hücresi izolasyonu ve transplantasyonuna uygulanmaktadır.

Introduction

Şiddetli Tip 1 diyabet için adacık nakli, endojen insülin sekresyonunu geri yükleyebilir ve birçok ülkede bakım standardı haline gelmiştir¹. Adacık izolasyonu, pankreasın ılık enzimatik ve mekanik sindirimini, ardından sindirilmiş dokunun geri kazanımı için soğutulmuş fazları ve bir hücre işlemcisi üzerinde sürekli veya süreksiz yoğunluk gradyanları ile adacık saflaştırmasını içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Hızlı soğutma, enzimatik sindirim fazını yavaşlatır ve adacıkları, asiner hücreleri kirleterek salınan sindirim enzimlerinden korur. Hücre işlemcisi başlangıçta hücresel kan bileşenlerini ortam sıcaklığında ayırmak için tasarlanmıştır². 1989^{3'te Langerhans'ın insan pankreas adacıklarını saflaştırmak için yeniden tasarlandı}. Otuz yıl boyunca, insan adacıkları klinik deneyler için saflaştırıldı ve daha yakın zamanda, süreksiz gradyanlar⁴ veya sürekli yoğunluk gradyanları¹ veya eşdeğer bilgisayarla çalışan mikser^{5,6,7 ile . Diğer gruplar, büyük silindirik plastik şişeler kullanarak büyük memelilerden ve insanlardan adacık saflaştırıldığını bildirmiştir8,7,9, bu da saflaştırmanın etkinliğini ve adacık kalitesini önemli ölçüde artırdı.}

Gerçekten de, klinik transplantasyon için insan adacıklarını saflaştırmanın altın standardı göz önüne alındığında^10,11, üretilen hücre işlemcisi soğutmasızdı. Soğutma eksikliğinin doğrudan bir sonucu olarak, adacıklar arıtma adımı sırasında artan sıcaklıklara maruz bırakıldı. Santrifüjleme sırasında, rotor^{12,13'ün mekanik sürtünmesi nedeniyle sıcaklıkta kontrolsüz bir artış meydana gelir}. Hücre işlemcileri, adacık izolasyon merkezlerinde, glikozun neden olduğu insülin sekresyonunu ve hücre canlılığını istatistiksel olarak artıran bir soğutma sistemi ile uyarlandı ve saflaştırma prosedürü sırasında pankreas adacıklarını düşük sıcaklıklarda tutmanın avantajını doğruladı^14,15.

1980'lerin sonlarında, yoğunluk gradyanı saflaştırması sırasında adacık hasarını azaltmak için 10 soğutmalı prototipin üretildiği, ancak daha fazla ilgi görmediği belirtilmelidir. Hücre işlemcisi prototipleri, soğutulmuş polietilen glikol ile iş mili ve çanak soğutmasına dayanıyordu. Özellikle, organ koruma çözeltileri ve polisakkarit yoğunluk gradyanları dahil olmak üzere adacık saflaştırma çözeltileri, oda sıcaklığında veya üzerinde kullanıldığında adacık canlılığı için zararlı olabilir^16,17,18. Rotorun sürtünmesi nedeniyle meydana gelen kontrolsüz sıcaklık artışıyla mücadele etmek için adacık hücresi saflaştırması için hücre işlemcisinin orijinal soğutulmamış hücre işlemcisine karşı farklı soğutma stratejilerinin karşılaştırılması değerlendirildi. İnsan adacık saflaştırması sırasında hücre işlemcisini soğutmak için birkaç girişimde bulunulmuştur. Hücre işlemcisi, şu anda Illinois Üniversitesi'ndeki adacık izolasyon merkezlerinde kullanılan gradyan santrifüjleme sırasında 0-8 °C'lik bir sıcaklığı korumak için özel olarak tasarlanmış bir soğuk odaya geçici veya kalıcı olarak yerleştirilebilir<¹⁹, Miami Üniversitesi¹⁴, Oxford Üniversitesi tesisleri¹⁵ve San Francisco Üniversitesi (özel soğutma ünitesi, hücre işlemcisini kaplar). Diğer bir değişiklik, İsveç'in Cenevre kentinde ve Çek Cumhuriyeti'nde elektronik olarak kontrol edilen sıvı nitrojen soğutması kullanan bir soğutma sistemi ile hücre işlemci milinin çekirdek soğutmasını içerir^15,19. 2000'li yılların ortalarında başka bir alternatif, hücre işlemcisinin bir klima ünitesi^{12 ile çekirdek soğutması} veya Lille Üniversitesi'ndeki şaftın sıvı soğutmasıydı.

Hücre işlemcisinin soğutma modifikasyonları kolayca bulunamaz ve GMP temiz oda ortamlarında, garanti kaybı ve üreticinin makineye servis vermeyi reddetmesi dahil olmak üzere risklerle (nem, yoğuşma oluşumu) birlikte gelir. Sonuç olarak, Milano, İtalya, Oslo, Norveç ve Edinburgh, İskoçya dahil olmak üzere bazı adacık merkezleri, adacık saflaştırma işlemi sırasında hücre işlemcileri için bir soğutma sistemi kullanmamaktadır¹⁵.

Bu çalışma, minimal düzeyde modifiye edilmiş bir hücre işlemci sistemi ile birlikte yeni geliştirilen hazır bir soğutucunun etkinliğini test etmek için tasarlanmıştır. Kısaca burada açıklanan hava bazlı soğutucu, -40 °C ila -100 °C arasında dakikada 1 standart fit küp (SCFM) kuru gazın sıcaklığını kontrol eden mekanik olarak soğutulmuş bir ısı eşanjörüdür. Bu soğutma sistemi kuru bir tıbbi hava beslemesi gerektirir. Hava, hattan ve ısı eşanjöründen akacak ve (7.9 mm) nozuldan dışarı çıkacaktır. Nozul içinde bulunan bir ısıtıcı, hava akımının sıcaklığını kontrol etmek için ısı sağlar. Yedek bir katı plastik santrifüj kapağı satın alındı ve minimum değişiklikler yapıldı. Kapakta 13,3 mm çapında bir delik açılmış ve soğutulmuş hava, santrifüj kapağındaki delik vasıtasıyla soğutucu nozuldan hücre işlemcisine iletilmiştir. Soğutulmuş tıbbi hava, sıvıların sıcaklığının veya yoğunluk gradyanlarının sürekli kontrolü ile hücre işlemcisinin santrifüj haznesinin içine enjekte edildi.

Soğutulmuş hücre işlemcisinin teknik performansını ve soğutma elemanının GMP temiz oda ortamı üzerindeki etkisini değerlendirdik. Ana odak noktası, canlılığı korumak için insan adacık arıtması sırasında sağlam bir şekilde düşük (<10 °C) bir sıcaklık elde etmekti. Adacık izolasyonu için bir vekil olarak bir buffy coat yoğunluk ayrımı kullanarak, bu soğutma protokolünün hücre canlılığı üzerindeki etkinliğini belirledik.

Protocol

Bu protokol, kurum atma yönergelerine göre kullanıma uygun olmayan atılmış tam kan kullanmıştır. IRB onayı ve bilgilendirilmiş onam geçerli değildir.

1. Soğutulmuş hücre işlemcisi kurulumu

NOT: Tüm prosedürler temiz oda ortamında yapılmalı ve personel temiz oda giysisi prosedürlerine uymalıdır.

1. Ekipman alımı
   1. Yedek bir pleksiglas kapak satın alın. Soğutma ekipmanı sistemini, mekanik olarak soğutulmuş gaz akışı sıcaklık kontrol cihazına sahip soğutucuyu, hava kurutucuyu, basınç ve akış regülatörünü ve garantiyi (isteğe bağlı) satın alın. Referanslar için Malzeme Tablosuna bakınız.
      NOT: Toplam maliyet, nakliye veya gümrük ücretleri hariç 16,133 $ 'dır.
   2. Yerel tıbbi gaz tedarikçisinden standart sınıfa (Avrupa farmakopesi referansı 1238) uygun sıkıştırılmış bir tıbbi gaz olan tıbbi kuru hava sipariş edin. 6,8^m3'lük 2 silindir satın alın (47 U: 23 cm x 153 cm; çap x uzunluk).
2. Ekipmanın kurulumu (Şekil 1 ve Şekil 2)
   1. Ekipmanı GMP temiz odasına girin (GMP prosedürlerine göre temiz odaya girmeden önce dezenfekte edin.
   2. Tıbbi sınıf basınçlı hava için, gaz tüpünü doğrudan temiz odaya yerleştirmek yerine bir gaz hattı kurun.
3. Soğutma için hücre işlemcisinin modifikasyonu
   1. İlk önce pleksiglas kapağı çıkarın. Garanti ile ilgili bir sorun olması ihtimaline karşı orijinal pleksiglas kapağı saklayın. Santrifüj kapağının çatlamasını önlemek için hücre işlemcisinin yedek kapağına, soğutma cihazı nozul ucunun dış çapına uygun ve uygun bir çapa sahip bir delik açın (13.3 mm önerilir).
   2. Braketleri dairesel bir köpük parçasıyla birlikte sabitleyin. Bu, kapağın kırılmasını ve/veya çizilmesini önlemek, soğutucu nozulu hücre işlemcisinin üzerinde yerinde tutmak, enjekte edilen havanın yüksek basıncı nedeniyle kapağın aşırı bükülmesini önlemek, nozulun ağırlığını desteklemek ve son olarak deneysel prosedür sırasında gerekli tüm hücre işlemcisi işlevlerine ücretsiz ve güvenli erişim sağlamak için operatörün maksimum güvenliğini sağlamak için yapılır.
   3. Soğutma memesini pleksiglastaki deliğe takarak soğutma sistemini hücre işlemcisine bağlayın. Braketler ve köpük yastıklarla sabitleyin.
   4. Soğutma muhafazasını nozuldan en fazla 8 fit (2.44 m) uzağa yerleştirin. Sıcaklık kontrol cihazını ayrı bir kabine koyun ve soğutma muhafazasının 6 fit (1.83 m) yakınına yerleştirin.
   5. Soğutucu üzerindeki hava akışını soğutmak için soğutucu ayar noktasını -40 °C'ye ayarlayın. Çıkış havası sıcaklığı, dijital göstergede 0,1 °C'lik bir çözünürlüğe kadar sürekli olarak gösterilir. Sıcaklık kontrolörü ile çıkış sıcaklığını dijital olarak 0,1 °C'ye ayarlayın.
   6. Soğutucuya beslemeden önce basınç ve akış regülatörü modülündeki (Şekil 2) hava beslemesinin basıncını ve akış hızını kontrol edin. -30 °C ve 2 °C'de soğutulan bir hava akışında optimum koşullara ulaşmak için bunları sırasıyla 55 psi ± 4 SCFM akış hızına ayarlayın.
   7. Medikal gaz beslemesinin 5 bar'lık bir çıkış basıncında düzenlendiğini ve basınçlı havanın -30 °C'ye ulaşması için gerekli olduğundan en az 90 dakika dayanabileceğini doğrulayın.
      NOT: Tıbbi kuru hava, sıkıştırılmış tıbbi gazdır ve tamamen basınçlı kuru hava standart sınıfa uygundur.
   8. Santrifüj kapağında açılan bir delikten hücre işlemci kapağına bağlı bir soğutucu nozuldan 5 bar verin. Soğutulmuş tıbbi havayı hücre işlemcisinin santrifüj haznesine enjekte edin (Şekil 2). Hava enjeksiyonunun konumunu, soğutulmuş hava santrifüj rotorunun alüminyum kenarına dik olarak yönlendirilecek şekilde seçin.
   9. Hücre işlemcisini hazırlarken rotorun oda sıcaklığında (18 °C) olduğundan emin olun. Soğutma sisteminin otomatik termo regülatörünü -30 °C'ye ayarlayın ve rotora doğrudan soğuk hava enjeksiyonları yapın.
      NOT: Hücre işlemci hücre ayırıcı sisteminin termo direncinin ve santrifüjleme sırasında rotorun ısınmasının üstesinden gelmek için gerekli olan +4 °C'lik optimum sıcaklık gradyanına ulaşmak için farklı deneme koşulları test edilmiştir. Programlanan termo-regülatör, prosedür sırasında, özellikle santrifüjleme sırasında, +18 °C'lik temiz oda sıcaklığında hücre işleme makinesi içindeki optimum hedef sıcaklığı koruyacaktır.
      1. İşlemciyi (hücre işlemci kiti olmadan) 30 ila 45 dakika boyunca +3 °C'de soğutmak için hücre işlemcisini ilk ön soğutma aşaması ile ayarlayın ve hücre işlemcisini çalıştırmanın ikinci ön soğutma aşaması, kit 5 dakika boyunca 134 x g'de +4 °C'de önceden soğutulmuş kit ile yapılmalıdır.

2. Havadaki partikül sayısı

1. Çalışma aşamasında ısı cihazlarının etkisini değerlendirmek için soğutma cihazının ISO 14644-1 standardına göre GMP temiz oda ortamına uygunluğunu değerlendirin.
2. Dinlenme ve çalışma sırasındaki kritik kontrol noktalarında gerekli temizlik seviyesine ulaşıldığına dair kanıt sağlamak için partikül sayımı izlemeyi kullanın.
   1. Minimum numune yeri sayısı, ölçülen alana bağlıdır. Bunu şu denklemi kullanarak hesaplayın
      
      burada A, temiz odanın veya temiz hava kontrollü alanın m² cinsinden alanıdır ve NL, bir tam sayıya yuvarlanmış numune konumlarının sayısıdır.
   2. Havadan örnekleme hacmi, her konumdaki minimum hacimdir. Hava hacminin, belirtilen en büyük partikül boyutundan 20 partikülü sayacak kadar büyük olduğundan emin olun. Havadan örnekleme hacmini denklem aracılığıyla hesaplayın
      V= 20/C x 1000
      burada V, L cinsinden ifade edilen, konum başına minimum tek numune hacmidir ve C, sınıf sınırıdır (partikül sayısı/^m3).
   3. Her konum için, alana bağlı olarak bir veya daha fazla örnek kullanın. Her konumda örneklenen en az hacmin 2 L ve minimum örnekleme süresinin en az 1 dakika olduğundan emin olun.
3. Numune almadan önce, partikül sayacı cihazını bir temizleme filtresi ile temizleyin. Filtreyi çıkarın ve örnekleme için izokinetik prob ile yerleştirin.
4. Partikül sayacı cihazını belirlenen örnekleme konumuna yerleştirin. Partikül sayaç cihazının ana ekranından numune toplamayı başlatın.
5. Numune alma bittiğinde, partikül sayaç cihazını bir sonraki konuma götürün. Örnekleme için tüm konumlar tamamlandığında, verileri gözden geçirin ve bir rapor yazdırın.
6. Alandaki tüm numune alma noktaları için ortalama partikül konsantrasyonu Tablo 1'de belirtilen sınıf sınırının altına düştüğünde, izin verilen partikül konsantrasyonuna sahip olmak için geçilen odayı göz önünde bulundurun.

3. Gradyan hazırlama ve hücre ayırma işlemi

1. Deneyden önce, hafif ve ağır yoğunluk gradyanlarını ve hücre işlemci kitlerini gece boyunca +4 °C'de bir buzdolabında önceden soğutun.
2. Hücre işlemcisini dinlenme durumunda 45 dakika önceden soğutun (yani, kullanmadan önce hücre işlemcisini açın). Sıcaklığı +2 °C ile +5 °C arasında tutun. Hücre işlemci kitini +4 °C'de önceden soğutulmuş olarak yerleştirin.
3. Standart etanol soğutmalı çift cidarlı gradyan yapıcı için (isteğe bağlı; Şekil 3) 2 cam hazneyi bağlayın ve manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Boruyu 2 hazne arasına sıkıştırın. Degrade yapıcıyı etanol sirkülasyonlu bir soğutma soğutucusu ile 0 °C'de soğutun.
4. İlk olarak, hazneyi 130 mL ağır yoğunluk gradyanı (HD; 1.087 g/mL). 150 mL/dak pompa hızında yükleyin.
5. Ağır gradyan torbaya girdikten sonra, ön behere 130 mL yüksek yoğunluklu (HD) ve arkaya 140 mL düşük yoğunluklu (LD; 1.063 g/mL) gradyan ekleyin (kelepçe kapalı).
6. Kanama durdurucuyu/kelepçeyi 2 odacık arasına deklemp edin ve 50 mL/dk pompa hızında sürekli bir gradyan oluşturun.
7. Kan bankasının mevcudiyetine bağlı olarak, tam kan atık ürünlerinden toplanan (10 buffy coat torbasına 40 mL ila 60 mL tam kan eklenmiştir) çoklu havuzlanmış anonim buffy coat hücrelerinden saflaştırma için insan mononükleer buffy coat hücrelerini önceden hazırlayın.
   1. ÇUŞ Ayrımı
      1. Düşük yoğunluklu insan mononükleer hücre izolasyonu için yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanın. Bunu yapmak için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
      2. Hücre hazırlığı için kan hacmini hesaplayın (antikoagüle tam kan veya askıya alınmış buffy ceket). İnversiyon ile karıştırarak kanı 2x-4x tampon çözeltisi ile seyreltin. Kan ne kadar seyreltilirse, mononükleer hücrelerin saflığı o kadar iyi olur.
      3. Fosfat tamponunu bir antikoagülan ile karıştırarak tamponu hazırlayın. Kan hacmini 35 mL'ye bölerek ihtiyaç duyulan tüp sayısını hesaplayın ve her tüpe 15 mL 1.073 yoğunluk gradyan çözeltisi dökün.
      4. Bir iğneye bağlı 60 mL'lik bir şırınga kullanarak yoğunluk gradyanının yüzeyinde hafifçe ilerleyerek seyreltilmiş kan süspansiyonunun 35 mL'sini yoğunluk gradyanı üzerine kademeli olarak katmanlayın; Küçük hacimler için bir pipet kullanın. Arayüzü bozmamaya çalışın, çünkü bu zayıf bir mononükleer katmana neden olur.
      5. 400 x g'da 20 °C'de 20 dakika boyunca hiç ara vermeden santrifüjleyin (hızlanma 0, yavaşlama 0). Santrifüjlemeden sonra, steril bir transfer pipeti kullanarak mononükleer hücrelerin arayüz katmanını nazikçe hasat edin. Hücreleri başka bir yeni 50 mL konik tüpe aktarın.
      6. Hücreleri 2 kez tamponla yıkayın (antikoagülan eklenmiş PBS). İlk yıkama için, hücreleri içeren tüpü 50 mL'ye kadar tamponla doldurun. Pelet hücrelerine 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin (hızlanma 9, yavaşlama 0). Tüm süpernatantıları dikkatlice nazikçe çıkarın.
      7. Trombositlerin uzaklaştırılması için ikinci yıkamayı yapın. Peletleri tampon ile 50 mL'lik bir hacme yeniden süspanse edin. 20 ° C'de 10 dakika boyunca 200-300 x g'da santrifüjleyin (hızlanma 9, yavaşlama 0).
      8. Hücreleri 5 mL'lik bir nihai hacme kadar sulandırın, bu hücreler düşük yoğunluklu MNC'ye <1.073) benzeyen özgül ağırlığa sahip olmalıdır. Degradenin özgül yoğunluğunu bir dansiyometre ile ölçün.
      9. Pelet, bir transfer torbasında 95 mL yüksek yoğunluklu gradyan ortam (1.083 g / mL) ile 100 mL'lik nihai hacme yeniden süspanse edin. Bu ürünü bir hücre ayırıcı kullanarak saflaştırma için kullanın. 100 mL'lik son hacim, hücreler ve 1.083 yüksek yoğunluklu gradyan ortamı içerir.
         NOT: Buffy ceket, %0,5 BSA veya otolog plazma içeren PBS'de gece boyunca buzdolabında saklanabilir. Buffy ceket de yıkanabilir.
8. 25 mL/dk'da peristaltik bir pompa kullanılarak 100 mL konsantre koruma ortamında süspanse edilen buffy kaplamadan izole edilmiş maksimum 30 mL MNC ile önceden oluşturulmuş gradyanları üstten yükleyin. Gradyanı +4 °C'de tutun.
9. Önceden kalibre edilmiş bir termoprob ile hücre işlemcisinin içindeki sıcaklığı sürekli olarak ölçün. Steril bir termoproba bağlı bir dijital termokupl kullanarak, işlem sırasında gradyanların ve hücrelerin sıcaklığını izleyin.

4. Degrade yüklemenin farklı adımlarının optimizasyonu

1. +4 °C'de önceden soğutulmuş hücre işlemci kitini yerleştirin. Ağır gradyanı (130 mL) + 4.5 °C'de yükleyin. Gradyan yüklemenin sonunda, rotor tarafından üretilen ısıyı en aza indirmek için santrifüjü nispeten düşük bir hıza (537 x g) ayarlayın.
2. Hidrolik sistemin çalışma öncesi seviyelere geri dönmesini ve havayı serbest bırakmasını sağlamak için hücre işlemcisini kapatın.
3. Hücre işlemcisini 537 x g'da yeniden başlatın ve +4,3 °C'de sürekli bir yoğunluk gradyanı ve 50 mL/dk'lık bir akış hızı oluşturmak için ağır (130 mL) ve düşük (140 mL) yoğunluk gradyanlarını ekleyin.
4. Buffy coat (30 mL) +6 °C'de 100 mL soğuk depolama ortamı ve 25 mL/dk akış hızı ile doldurun. 50 mL (25 mL x 2) yıkama solüsyonu ekleyin.
5. +5 °C'de 5 dakika sonra, eğrilmiş gradyanı 100 mL/dk akış hızında 12 şişede toplayın.
6. Tüpleri yıkama ortamıyla doldurun (M199 +% 20 insan albümini +% 10 Penisilin streptomisin). Tüp 1'i 100 mL yıkama ortamı ve 150 mL hücre ve tüp 2-12'yi 225 mL yıkama ortamı ve 25 mL hücre ile doldurun.

Results

Soğutulmuş hücre işlemcisinin GMP temiz odası üzerindeki etkisi ilk olarak ölçüldü. Standartlaştırılmış yöntemlerde, hücre işlemcisine ve basınçlı hava soğutucu sistemine yakın kritik noktalarda GMP sınıfı C sınıfı ve B sınıfı temiz oda ortamında havadaki partikül kontaminasyonunu ölçen bir partikül sayacı kullanıldı. Sonuçlar, ekipmanın etrafında herhangi bir türbülans oluşmadığını gösterdi. Kaydedilen veriler, temiz oda GMP derece C, sınıf B ve BSL III standartlarına göre 0,5 μm ve 5 μm havadaki partikül fazlalığı olma...

Discussion

Dünyanın dört bir yanındaki adacık izolasyon tesisleri, onlarca yıldır yeniden tasarlanmış bir hücre işlemcisinde insan adacık saflaştırmasını benimsemiştir. Bazı adacık üretim tesisleri, soğutulmamış bir hücre işlemcisinde adacıkları işlemeye devam etse de, çoğu merkez, hücre işlemcisinin 10,11,15 soğutulmuş bir versiyonunu kullanır. Merkezler ya hücre işlemcisini neme ve yoğuşmaya maruz kalma gibi büyük bir dezavantaja sahip o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< güçlü > Ekipman< / güçlü >
Hava partikülleri sayacı	Lasair III
AirJet XR40 ve nbsp;	SP Scientific	FTS sistemi XR40
Biyogüvenlik Kabini	Thermo Scientific	EQ-1301
Sirkülasyonlu Soğutma Chiller	Julabo	CF30
COBE 2991	Terumo BCT
Konik Soğutma Tepsisi	Biorep	CCT-01
Çift ceketli gradyan yapıcı			evde özelleştirilmiş
KJT-Termokupl Termometre	Hanna Aletleri	HI93551N	Sıvıların sıcaklığını ölçmek için
Manyetik karıştırıcı ve nbsp;	Thermo Scientific	88880014
Peristaltik pompa	MasterFlex	MK-77921-79
Termometre	Extech Instruments	RMS 430	COBE sıcaklığı için
Susuz Boncuk Banyosu	Cole-Parmer	10122-00
Malzemeler ve reaktifler
BD kök hücre sayım kiti	BD Biosciences
COBE 2911 boru kiti	Terumo BCT	90819
Konik Tüpler 250ml	Corning	430776
Gradyan yoğunluğu 1.1	Biyokrom ve nbsp;	L6155
Dereceli tek kullanımlık şişeler	Thermo fisher	382019-1000
İnsan albümini %20	Kedrion Biyofarma	8091600
M199 yıkama solüsyonu	Corning	99-784-CM
Masterflex tüpler	Masterflex	96400-6
Medikal Kuru Hava	Linde Healthcare	Medi On 22
Pencillin-streptomisin	Gibco
Termoprob	Biorep	TC-02	Termosensör
Tripan mavi	Sigma Aldrich	15250061
Wisconsin Belzer Üniversitesi (UW)	Hayat Köprüsü	RM/N 4055	Koruma Ortamı