Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak
Bu makalede
Özet
Özet
Merkezi sinir sistemi (CNS) modelleri, in vivo olarak bulunan birbirine bağlı hücrelerin karmaşık ağını özetlemelidir.CNS öncelikle nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşur. Hayvan kullanımını değiştirme ve azaltma çabalarının artması nedeniyle, CNS enfeksiyonları ve patolojileri için terapötiklerin geliştirilmesine izin veren doğuştan gelen hücre özelliklerini keşfetmek için çeşitli in vitro hücre kültürü sistemleri geliştirilmiştir. Bazı araştırma soruları, (indüklenmiş) pluripotent kök hücreler gibi insan temelli hücre kültürü sistemleri tarafından ele alınabilirken, insan hücreleriyle çalışmanın kullanılabilirlik, maliyetler ve etik açısından kendi sınırlamaları vardır. Burada, embriyonik fare beyinlerinden hücreleri izole etmek ve kültürlemek için benzersiz bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan karışık nöral hücre kültürleri, beyinde in vivo olarak bulunan çeşitli hücre popülasyonlarını ve etkileşimlerini taklit eder. Mevcut eşdeğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol beynin özelliklerini daha yakından taklit eder ve ayrıca daha fazla hücre toplar, böylece hamile bir fareden daha fazla deneysel koşulun araştırılmasına izin verir. Ayrıca, protokol nispeten kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bu kültürler, 96 kuyucuklu yüksek verimli ekranlar, 24 kuyucuklu mikroskopi analizi ve akış sitometrisi ve ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi için 6 kuyucuklu kültürler dahil olmak üzere çeşitli ölçeklerde kullanım için optimize edilmiştir. Bu kültür yöntemi, in vitro yöntemlerin rahatlığı ile CNS'nin bazı karmaşıklıkları bağlamında enfeksiyon ve bağışıklığı araştırmak için güçlü bir araçtır.
Giriş
Merkezi sinir sistemi (CNS) hakkındaki anlayışımızı geliştirmek, birçok nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalık için terapötik seçenekleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Beyin, omurilik ve optik sinirler içindeki birbirine bağlı hücrelerin karmaşık bir ağı olan CNS, nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve bunların doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia1'i içerir. İn vitro bir yaklaşım genellikle anlamlı araştırmalar yapmak için gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabilir; Bununla birlikte, CNS'nin karmaşık doğası, hücre hatlarını kullanarak in vivo durumu özetlemeyi imkansız kılar. Karışık nöra....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, hayvan kullanımı için yerel yasalara ve yönergelere uygundur ve Glasgow Üniversitesi'ndeki yerel Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, İngiltere İçişleri Bakanlığı Proje Lisansı'nın himayesinde, İngiltere Hayvanları Bilimsel Prosedürler Yasası 1986 uyarınca belirli patojensiz koşullarda barındırılmıştır. Bu çalışma için, şirket içi yetiştirilmiş yetişkin C57BL / 6J fareler kullanılmıştır. Gebeliğin daha yüksek başarı oranı nedeniyle genç kadınların (8-12 hafta) kullanılması önerilir; Erkekler birden fazla üreme turu için tekrar kullanılabilir. Şekil 1 , karışık nöronal ve glial kültürler oluştur....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mikroskopi
Cam örtüler üzerinde yetiştirilen kültürler mikroskopi ile analiz etmek için idealdir. Kültürlerin gelişimini görselleştirmek için, kapak kaymaları DIV0'dan (hücreler bağlandıktan sonra) DIV28'e kadar birçok zaman noktasında% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi. Kültürler, daha önce tarif edildiği gibi immünofloresan görüntüleme için boyandı5 üç farklı boyama kombinasyonu kullanılarak: gelişimsel belirteçler olarak NG2 (olgunlaşmamış oligodendrositler) ve nesti.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CNS, beyinden omuriliğe kadar uzanan karmaşık bir ağdır ve ağırlıklı olarak nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia1 olmak üzere birçok hücre tipinden oluşur. Her hücrenin homeostazı korumada ve CNS 9,10,11'deki zorluklara uygun yanıtlar üretmede önemli bir rolü olduğundan, tüm bu hücre tiplerini içeren bir kültür sistemi, beynin bir uyarana nasıl tepki verebileceğini araştırmak için yararlı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Edgar ve Linington laboratuvarlarının üyelerine, özellikle Prof. Chris Linington, Dr. Diana Arseni ve Dr. Katja Muecklisch'e, tavsiyeleri, yararlı yorumları ve bu kültürleri kurarken kültürleri beslemedeki yardımları için teşekkür ederiz. Hücre Profilcisi boru hatları için başlangıç noktaları sağladığı için Dr. Muecklisch'e özellikle teşekkür ederiz. Bu çalışma MS Derneği (hibe 122) ve Yuri ve Lorna Chernajovsky vakfı tarafından MP'ye desteklendi; Glasgow Üniversitesi'nin JC ve MP'ye fon sağlaması; ve Wellcome Trust (217093 / Z / 19 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRV0109721) GJG'ye.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10x Tripsin | Sigma | T4549-100ML | Dokuyu sindirmek için |
| 140 mm TC Çanak | Fisher | 11339283 | 1 140 mm'lik çanak başına 8 35 mm tabak koyun |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | Kaplama ortamında yeniden süspansiyon için hücreleri pelet halinde toplamak için |
| 18 G iğne | Henke Sass | Wolf 4710012040 | Numunenin öğütülmesi için |
| 21 G iğne | BD | 304432 | Numunenin öğütülmesi için |
| 23 G iğne | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Numunenin öğütülmesi için |
| 35 mm TC Çanak | Corning | 430165 | Plaka çıkışı 1 35 mm çanak başına 3 PLL kaplı lamel |
| 5 mL şırınga | Fisher | 15869152 | Numunenin öğütülmesi için |
| 6 oyuklu plaka | Corning | 3516 | RT-qPCR ve akış için hücreleri plakalamak için sitometri |
| 7 mL Bijuteri | Fisher | DIS080010R | Beyin koymak için intp |
| 96 kuyulu plaka | Corning | 3596 | Yüksek verimli test için hücreleri ayırmak için |
| ACSA-2 Antikor, anti-fare, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Astrositlerin akış sitometrisi boyaması için |
| Açılı forseps | Dumont | 0108-5/45-PO | Diseksiyon için |
| Biotin | DM +/- | Sigma | B4501 |
| Borik asit tamponu için | Sigma | B6768-500G | |
| Brilliant Violet 421 anti-fare CD24 Antikor, klon M1-69 | Biolegend | 101825 | Nöronların ve astrositlerin akış sitometrisi boyaması için |
| Brilliant Violet 605 anti-fare CD45 Antikor, klon 30-F11 | Biolegend | 103139 | Mikroglia'nın |
| akış sitometrisi boyaması içinBrilliant Violet 785 anti-fare / insan CD11b Antikoru, klon M1/70 | Biolegend | 101243 | Mikroglia'nın akış sitometrisi boyaması için |
| BSA Fraksiyon V | Sigma | A3059-10G | SD İnhibitörü |
| CNP için Abcam | AB6319 | Olgun oligodendrositler | |
| Lamel | VWR | 631-0149 | Mikroskopi |
| Diseksiyonu için hücreleri | Sigma | S3146-1EA | Diseksiyon için |
| DMEM Yüksek glikoz, sodyum piruvat, L-Glutamin | Gibco | 21969-035 | DM +/- için ve kaplama ortamı için |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | , bunu veya sigma DNase I'den diğer Dnase'yi kullanabilir |
| Sigma | D4263 | , bunu veya thermofisher eBioscience'tan diğer Dnase'yi kullanabilir | |
| Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Canlı / Ölü leke |
| İnce forseps | Dumont | 0102-SS135-PO | Diseksiyon için |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrositler |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Kaplama ortamı için |
| HBSS w / o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | At Serumuna |
| eklenecek beyinler içinGibco | 26050-070 | Kaplama ortamı için | |
| Hidrokortizon | Sigma | H0396 | DM +/- |
| Iba1 | Alfa Laboratuvarları | için 019-1971 | |
| Leibovitz L-15 | için Microglia | İnhibitörü | |
| için GIbco 11415-049Fare CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kiti | BioTechne | DY478-05 | 96 oyuklu plakanın süpernatantlarında CCL5 konsantrasyonunu ölçmek için ELISA kiti |
| N1 medya takviyesi | Sigma | N6530-5ML | DM +/- |
| Nestin | Merck MAB353 | için Nöronal kök / progenitör hücreler | |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Nöronal hücre gövdesi |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Olgunlaşmamış oligodendrositler |
| O4 Antikoru, anti-insan/fare/sıçan, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Oligodendrositlerin akış sitometrisi boyaması için |
| Kalem/Strep | Sigma | P0781-100ML | DM +/- için ve kaplama ortamı için |
| Poli-L-Lizinhidrobromür | Sigma | P1274 | Borik asit / poli-L-lizin çözeltisi için lameller kaplamak için |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodyum Tetraborat | Sigma | 221732-100G | Borik asit tamponu için |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | RT-qPCR |
| Tripsin inhibitörü |
Kaynaklar
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
