Method Article

Postnatal Sağ Ventrikül Hacim Aşırı Yük Fare Modelinin Oluşturulması ve Doğrulanması

DOI:

10.3791/65372

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, abdominal arteriyovenöz fistüllü (AVF) farelerde doğum sonrası sağ ventrikül volüm aşırı yüklenmesi (VO) modelinin kurulmasını ve doğrulanmasını sunar ve VO'nun doğum sonrası kalp gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için uygulanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konjenital kalp hastalığı olan çocuklarda sağ ventrikül (RV) aşırı hacim yüklenmesi (VO) yaygındır. Farklı gelişim aşamaları göz önüne alındığında, RV miyokard, çocuklarda yetişkinlere kıyasla VO'ya farklı yanıt verebilir. Bu çalışma, modifiye abdominal arteriyovenöz fistül kullanan farelerde postnatal RV VO modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. VO oluşumunu ve RV'nin aşağıdaki morfolojik ve hemodinamik değişikliklerini doğrulamak için 3 ay boyunca abdominal ultrason, ekokardiyografi ve histokimyasal boyama yapıldı. Sonuç olarak, postnatal farelerde prosedür kabul edilebilir bir sağkalım ve fistül başarı oranı gösterdi. VO farelerinde, RV boşluğu kalınlaşmış bir serbest duvarla genişletildi ve inme hacmi ameliyattan sonraki 2 ay içinde yaklaşık% 30 -% 40 oranında arttı. Daha sonra, RV sistolik basıncı arttı, karşılık gelen pulmoner kapak yetersizliği gözlendi ve küçük pulmoner arter yeniden şekillenmesi ortaya çıktı. Sonuç olarak, modifiye arteriyovenöz fistül (AVF) cerrahisi, postnatal farelerde RV VO modelini oluşturmak için uygundur. Fistülün kapanma ve pulmoner arter direncinin artmış olma olasılığı göz önüne alındığında, uygulama öncesi model durumunu doğrulamak için abdominal ultrason ve ekokardiyografi yapılmalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konjenital kalp hastalığı (KKH) olan çocuklarda sağ ventrikül (RV) aşırı hacim yüklenmesi (VO) yaygındır, bu da patolojik miyokardiyal yeniden şekillenmeye ve kötü bir uzun vadeli prognoza yol açar 1,2,3. KKH'li çocuklarda iyi bir sonuç için RV yeniden şekillenmesi ve ilgili erken hedefli müdahalelerin derinlemesine anlaşılması esastır. Yetişkinlerin ve çocukların kalplerindeki moleküler yapılarda, fizyolojik işlevlerde ve uyaranlara verilen yanıtlarda çeşitli farklılıklar vardır 1,4,5,6. Örneğin, aşırı basınç yükünün etkisi altında, kardiyomiyosit proliferasyonu yenidoğan kalplerde ana yanıttır, oysa fibroz yetişkin kalplerdegörülür 5,6. Ek olarak, yetişkinlerde kalp yetmezliği tedavisinde etkili olan birçok ilacın çocuklarda kalp yetmezliği üzerinde terapötik bir etkisi yoktur ve hatta daha fazla hasara neden olabilir 7,8. Bu nedenle, yetişkin hayvanlardan elde edilen sonuçlar doğrudan genç hayvanlara uygulanamaz.

Arteriyovenöz fistül (AVF) modeli, farklı türlerin yetişkin hayvanlarında onlarca yıldır kronik kalp VO'sunu ve buna karşılık gelen kardiyak disfonksiyonu indüklemek için kullanılmıştır 9,10,11,12,13. Bununla birlikte, doğum sonrası farelerde model hakkında çok az şey bilinmektedir. Önceki çalışmalarımızda, abdominal AVF oluşturularak bir VO postnatal fare modeli başarıyla oluşturulmuştur. Postnatal kalpte değişen RV gelişim yolu dagösterildi 14,15,16,17.

Mevcut modelin altında yatan modifiye cerrahi süreci ve özelliklerini araştırmak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur; Bu çalışmada model 3 ay süreyle değerlendirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan tüm prosedürler, Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygundur ve Şanghay Çocuk Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Refahı ve İnsan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır (SCMC-LAWEC-2023-003). Bu çalışma için C57BL/6 fare yavruları (P7, erkek, 3-4 g) kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları ve emziren anneleri (yavrular: anneler = tek bir kafeste = 6:1), suya serbest erişim ve besleyici bir diyet ile 22 ± 2 ° C'de 12 saatlik aydınlık ve karanlık bir döngü altında spesifik-patojensiz laboratuvar koşullarında tutuldu. Yavrular iki gruba ayrıldı: bir VO grubu ve sahte (sahte) bir grup.

1. Ekipman ve cerrahi alet hazırlığı

NOT: Tüm malzemelerin/ekipmanların ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

  1. Aşağıdaki ekipman türlerinin hazır ve düzgün çalıştığından emin olun: ameliyat masası (köpük plastik panel), inhalasyon anestezi makinesi, dikey aydınlatmalı mikroskop ve dahili kamera, 24 MHz dönüştürücülü ultrason cihazı ve termostatik ısıtma platformu.
  2. Cerrahi aletleri sterilize edin (yani mikro iğne tutucu, ince uçlu forseps ve yuvarlak saplı Vannas yaylı makas).
  3. Aşağıdaki sarf malzemelerini birleştirin: İplikli 11-0 ve 9-0 cerrahi dikiş iğneleri (konik nokta), bant şeritleri, 5 mL şırınga iğneleri, 2-0 ipek (cerrahi fiksasyon), steril pamuklu çubuklar ve ultrason jeli.
  4. Aşağıdaki reaktiflerin mevcut olduğundan emin olun: Betadin, %70 etanol, normal steril salin, izofluran, asetaminofen, oftalmik merhem ve tüy dökücü krem.

2. Cerrahi prosedür

NOT: Fistül cerrahisi prosedürü daha önce açıklanan yöntemegöre değiştirildi 11. Şekil 1 , doğum sonrası farelerde AVF operasyonunun şematik bir diyagramını göstermektedir.

  1. Anestezi ve kısıtlama
    1. Fare yavrularını, akış 1 L/dk'ya ayarlanmış olarak 2 dakika boyunca %2 izofluran/oksijen içeren bir anestezi-indüksiyon kutusuna yerleştirin. Bir TB şırınga kullanarak asetaminofen (0.1 ml PO 80 mg / 2.5 ml) uygulayın.
    2. Anesteziyi sürdürmek için yavruları ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve 0,8 L/dk akışla %1,5 izofluran nazal inhalasyon yapın. Bacakları sabit şırınga iğnelerine bağlayarak yavrunun konumunu ayarlayın. Kornea kurumasını önlemek için yavruların gözlerine oftalmik merhem sürün.
    3. Ağrıya tepki verip vermediğini kontrol etmek için anestezi uygulanmış yavrunun kuyruğunu sıkıştırın; Belirgin vücut hareketlerinin olmaması yeterli anesteziyi gösterir.
  2. Fistül cerrahisi
    1. Cildi üç alternatif betadin ve% 70 etanol fırçası ile dezenfekte edin ve ardından cerrahi bölgeyi örtün. Karın organlarına zarar vermemeye dikkat ederek, periton boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için karın duvarını ve peritonu alt karın bölgesinden subksifoide doğru kesin. Dışlanmış organları nemlendirmek için normal steril salin damlatın.
    2. Retroperiton altındaki dikey abdominal aortu (AA) ve inferior vena kava'yı (IVC) görselleştirmek için pamuklu çubuklar kullanarak gastrointestinal sistemi ve mesaneyi cerrahi bölgeden nazikçe çekin. Ameliyat masasını saat yönünün tersine 90° döndürün ve iki yatay damarı net bir şekilde görselleştirmek için mikroskop büyütmesini ayarlayın.
    3. 11-0 dikiş iğnesi (çap = 0.07 mm) ile fistülleri AA'dan IVC'ye renal arterin 1 cm distalinde eğik yönde delin. IVC'de venöz ve arteriyel kanın şişmesine ve karışmasına dayalı olarak başarılı fistül oluşumunu doğrulayın.
    4. Ardından, 15 saniye boyunca kuru pamuklu çubuklarla uygulanan uygun bir kuvvet kullanarak kanama noktasını hızla sıkıştırın. Hemostatik sıkıştırmayı teşvik etmek için karın boşluğundaki mideyi, bağırsakları ve mesaneyi mümkün olan en kısa sürede değiştirin.
    5. Karın duvarını ve peritonu 9-0 dikiş ipliği kullanarak bir battaniye dikişi ile dikin. Anesteziyi bırakın ve yavrulara 1 dakika boyunca %100 oksijen verin.
  3. Anestezi resüsitasyonu
    1. Yavruları 38 °C'lik bir ısıtma platformuna yerleştirin. Canlılıkla tam bir uyanıştan sonra, yavruları emziren annelerine geri verin. Tüm prosedür yaklaşık 15 dakika sürer.
      NOT: Bu çalışmada sahte grup, delme adımı dışında aynı prosedüre tabi tutulmaktadır.

3. Fistülün ultrason onayı

NOT: Ultrason cihazının genel çalışması önceki raporlarlaaynıydı 18,19.

  1. Fistülün abdominal ultrason ile doğrulanması
    1. Anestezi indüksiyonundan sonra (adım 2.1.1), fareleri sıcak platform üzerinde sırtüstü pozisyonda bant şeritleri ile sabitleyin. Ardından, fareleri ultrason jeli ile bir elektrokardiyogram (EKG) monitörüne bağlayın. 0,8 L / dak akışta% 1,5 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün.
    2. Tüy dökücü krem kullanarak göğüs ve karın derisini hazırlayın. Birkaç saniye sonra, kremayı ılık suya batırılmış pamuklu bir uçla çıkarın. Dönüştürücüyü (24 MHz) orta karın çizgisine yerleştirin ve dönüştürücü işaretleyiciyi farelerin kafasına döndürün.
    3. Platformu farelerin sol veya sağ tarafına doğru hareket ettirin ve damarların ve kan sinyallerinin uzun eksen görünümünü görselleştirmek için B modunu ve renkli Doppler modunu kullanın18,19. Darbeli dalga Doppler modu ile AVF açıklığını doğrulamak için AA, IVC ve fistülün kan akış hızını ölçün.
      NOT: Ultrasonda başarılı fistül oluşumu, AA ve IVC arasında görülebilen türbülanslı bir akış sinyali ile gösterildi (Şekil 2C). AVF bölgesinde Doppler kan akım hızı, AA'da nispeten daha düşük sistolik hıza kıyasla anlamlı olarak yüksekti (Şekil 2A,C). Ayrıca, IVC'deki normal akış paternlerinin aksine (Şekil 2B), AVF'ye yakın IVC kan akışının pulsatil dalga formu da fistülün başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğruladı (Şekil 2D).
  2. Ekokardiyografi ile VO'nun doğrulanması
    1. Platformun kuyruk ucu kısmını aşağı doğru hareket ettirin, dönüştürücüyü (24 MHz) göğsün üzerine yerleştirin ve dönüştürücü işaretleyiciyi farelerin sağ omzuna döndürün. Pulmoner arterin (PA) modifiye edilmiş parasternal uzun eksen görünümünü B modu ve renkli Doppler modunu kullanarak görselleştirin.
    2. Darbeli dalga Doppler modunu kullanarak, hız zaman integrali (PA-VTI), PA valfinin çapı (PAD), pulmoner arteriyel hızlanma süresi (PAT) ve RV ejeksiyon süresi (RVET) dahil olmak üzere PA'daki kan akış sinyallerini ölçün (Şekil 2E, F ve Şekil 3A, B).
    3. Ultrason parametrelerini ardışık üç ölçümün ortalamasından ölçün. Aşağıdaki formülleri20 kullanarak RV strok hacmini (RVSV, mL) ve RV sistolik basıncını (RVSP, mmHg) hesaplayın:
      RVSV [mL] =1/4 × πD2 × VTIPA
      RVSP [mmHg] = -83.7 × PAT/RVET - indeks + 63.7
      NOT: Ultrason ölçüm yanlılığı göz önüne alındığında, sahte gruptaki farelere kıyasla VO farelerinde RVSV veya VTIPA'da % >15'lik bir artış, RV'de VO olarak kabul edildi (Şekil 2E, F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 ay içinde sağkalım oranı ve AVF açıklığı
VO grubunda toplam 30 (% 75) fare ve sahte grupta 19 (% 95) fare AVF ameliyatından kurtuldu (Şekil 4A). VO grubunda, sekiz fare aşırı kanama (n = 5) veya yamyamlık (n = 3) nedeniyle ameliyattan sonraki 1 gün içinde ölürken, iki fare 1 ayda bilinmeyen nedenlerden öldü.

Hayatta kalan VO farelerinden (n = 30), ultrason, postoperatif 21 farede başarılı bir şekilde fistül oluşumunu doğruladı, bunların posto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceden, klasik RV VO modeli, valf yetersizliği21 kullanılarak oluşturulmuştu; bununla birlikte, AVF ile karşılaştırıldığında, açık kalp kapakçığı cerrahisi daha karmaşık teknikler gerektirebilir ve özellikle doğum sonrası farelerde önemli ölçüde daha yüksek mortalite ile ilişkili olabilir. Hayvan çalışmaları, VO'nun aynı etkisinin AVF22 ile elde edildiğini gösterdiğinden, bu çalışmada daha az travma ile modifiye abdominal fistül cerrahisi kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (no. 82200309) ve Ningbo'daki Seçkin Tıp Ekibinin İnovasyon Projesi (no. 2022020405) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 70 EtanolTiandz, Chia
ACETAMINOPHEN Oral ÇözeltiVistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, ABDNDC 66689-054-01
Anestezi makinesiRWD Yaşam Bilimi, ÇinR550IP
Anestezi maskesiRWD Yaşam Bilimi, Çin68680
C57BL / 6 fareXipu ' er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Şangay, Çin)
Epilasyon kremiVeet, FransaVT-200
Hematoksilen ve eozin Kiti Beyotime Biyoteknoloji C0105M 
IsofluranRWD Yaşam Bilimi, ÇinR510-22-10
Mikroskop  Yuyan Instruments, ÇinSM-301
Cerrahi sütür iğneleriNINGBO TIBBİ İĞNE CO., LTD, Çin
Termostatik ısıtma platformuQingdao Juchuang Çevre Koruma Group Co., Ltd, Çin
Ultrason cihazıFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100Görüntü modları, B-Modu, Renkli Doppler Modu ve Darbeli Dalga Doppler Modunu içerir
Ultrason jeliParker Laboratories, Amerika Birleşik DevletleriREF 01-08
Ultrason dönüştürücüFUJIFILM VisualSonics, Inc.HANIM 400

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanz, J., Sanchez-Quintana, D., Bossone, E., Bogaard, H. J., Naeije, R. Anatomy, function, and dysfunction of the right ventricle: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (12), 1463-1482 (2019).
  2. Alonso-Gonzalez, R., Dimopoulos, K., Ho, S., Oliver, J. M., Gatzoulis, M. A. The right heart and pulmonary circulation (IX). The right heart in adults with congenital heart disease. Revista Española de Cardiología. 63 (9), 1070-1086 (2010).
  3. Kovacs, A., Lakatos, B., Tokodi, M., Merkely, B. Right ventricular mechanical pattern in health and disease: beyond longitudinal shortening. Heart Failure Reviews. 24 (4), 511-520 (2019).
  4. Ye, L., et al. Role of blood oxygen saturation during postnatal human cardiomyocyte cell cycle activities. JACC: Basic to Translational Science. 5 (5), 447-460 (2020).
  5. Ye, L., et al. Pressure overload greatly promotes neonatal right ventricular cardiomyocyte proliferation: a new model for the study of heart regeneration. Journal of the American Heart Association. 9 (11), e015574(2020).
  6. Geraets, I. M. E., Glatz, J. F. C., Luiken, J., Nabben, M. Pivotal role of membrane substrate transporters on the metabolic alterations in the pressure-overloaded heart. Cardiovascular Research. 115 (6), 1000-1012 (2019).
  7. Burns, K. M., et al. New mechanistic and therapeutic targets for pediatric heart failure: report from a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Circulation. 130 (1), 79-86 (2014).
  8. Shaddy, R. E., et al. Carvedilol for children and adolescents with heart failure: a randomized controlled trial. Journal of the American Medical Association. 298 (10), 1171-1179 (2007).
  9. Flaim, S. F., Minteer, W. J., Nellis, S. H., Clark, D. P. Chronic arteriovenous shunt: evaluation of a model for heart failure in rat. American Journal of Physiology. 236 (5), H698-H704 (1979).
  10. Liu, Z., Hilbelink, D. R., Crockett, W. B., Gerdes, A. M. Regional changes in hemodynamics and cardiac myocyte size in rats with aortocaval fistulas. 1. Developing and established hypertrophy. Circulation Research. 69 (1), 52-58 (1991).
  11. Scheuermann-Freestone, M., et al. A new model of congestive heart failure in the mouse due to chronic volume overload. European Journal of Heart Failure. 3 (5), 535-543 (2001).
  12. Du, Y., Plante, E., Janicki, J. S., Brower, G. L. Temporal evaluation of cardiac myocyte hypertrophy and hyperplasia in male rats secondary to chronic volume overload. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1155-1163 (2010).
  13. Wu, J., Luo, X., Huang, Y., He, Y., Li, Z. Hemodynamics and right-ventricle functional characteristics of a swine carotid artery-jugular vein shunt model of pulmonary arterial hypertension: An 18-month experimental study. Experimental Biology and Medicine. 240 (10), 1362-1372 (2015).
  14. Sun, S., et al. Postnatal right ventricular developmental track changed by volume overload. Journal of the American Heart Association. 10 (16), e020854(2021).
  15. Wang, S., et al. Metabolic maturation during postnatal right ventricular development switches to heart-contraction regulation due to volume overload. Journal of Cardiology. 79 (1), 110-120 (2022).
  16. Zhou, C., et al. Downregulated developmental processes in the postnatal right ventricle under the influence of a volume overload. Cell Death Discovery. 7 (1), 208(2021).
  17. Cui, Q., et al. Volume overload initiates an immune response in the right ventricle at the neonatal stage. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 772336(2021).
  18. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments. (84), e51041(2014).
  19. Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013(2019).
  20. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (2), 157-163 (2010).
  21. Mori, Y., et al. A new dynamic three-dimensional digital color doppler method for quantification of pulmonary regurgitation: validation study in an animal model. Journal of the American College of Cardiology. 40 (6), 1179-1185 (2002).
  22. Bossers, G. P. L., et al. Volume load-induced right ventricular dysfunction in animal models: insights in a translational gap in congenital heart disease. European Journal of Heart Failure. 20 (4), 808-812 (2018).
  23. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  24. Jouannic, J. M., et al. The effect of a systemic arteriovenous fistula on the pulmonary arterial blood pressure in the fetal sheep. Prenatal Diagnosis. 22 (1), 48-51 (2002).
  25. Jouannic, J. M., et al. Systemic arteriovenous fistula leads to pulmonary artery remodeling and abnormal vasoreactivity in the fetal lamb. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (3), L701-L709 (2003).
  26. Patel, M. D., et al. Echocardiographic assessment of right ventricular afterload in preterm infants: maturational patterns of pulmonary artery acceleration time over the first year of age and implications for pulmonary hypertension. Journal of the American Society of Echocardiography. 32 (7), 884-894 (2019).
  27. Habash, S., et al. Normal values of the pulmonary artery acceleration time (PAAT) and the right ventricular ejection time (RVET) in children and adolescents and the impact of the PAAT/RVET-index in the assessment of pulmonary hypertension. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 35 (2), 295-306 (2019).
  28. Arkles, J. S., et al. Shape of the right ventricular Doppler envelope predicts hemodynamics and right heart function in pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (2), 268-276 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Right Ventricular OverloadArteriovenous FistulaPostnatal Mouse ModelCongenital Heart DiseaseAbdominal UltrasoundEchocardiographyHemodynamic ChangesPulmonary Artery RemodelingHistochemical StainingStroke Volume

Related Articles