Yöntem makalesi

Ultrastrüktürel Genleşme Mikroskobu in Üç İn Vitro Yaşam Döngüsü Aşamaları Trypanosoma cruzi

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65381

⸱

12 Mayıs 2023

 ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında ultrayapı genişletme mikroskobunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Hücre iskeleti proteinleri ve pan-proteom etiketleme için optimize edilmiş tekniği dahil ediyoruz.

Özet

Burada, mikroskobik görüntüleme için bir hücrenin veya dokunun uzamsal çözünürlüğünü artırmaya izin veren bir teknik olan Trypanosoma cruzi'de üst yapı genişletme mikroskobunun (U-ExM) uygulanmasını açıklıyoruz. Bu, bir numunenin kullanıma hazır kimyasallar ve yaygın laboratuvar ekipmanı ile fiziksel olarak genişletilmesiyle gerçekleştirilir.

Chagas hastalığı, T. cruzi'nin neden olduğu yaygın ve acil bir halk sağlığı sorunudur. Hastalık Latin Amerika'da yaygındır ve artan göç nedeniyle endemik olmayan bölgelerde önemli bir sorun haline gelmiştir. T. cruzi'nin bulaşması, Reduviidae ve Hemiptera familyalarına ait hematofag böcek vektörleri yoluyla gerçekleşir. Enfeksiyonu takiben, T. cruzi amastigotlar memeli konakçı içinde çoğalır ve replikatif olmayan kan dolaşımı formu olan tripomastigotlara farklılaşır. Böcek vektöründe, tripomastigotlar epimastigotlara dönüşür ve ikili fisyon yoluyla çoğalır. Yaşam döngüsü aşamaları arasındaki farklılaşma, hücre iskeletinin kapsamlı bir şekilde yeniden düzenlenmesini gerektirir ve farklı hücre kültürü teknikleri kullanılarak laboratuvarda tamamen yeniden oluşturulabilir.

Burada, hücre iskeleti proteinlerinin immünolokalizasyonunun optimizasyonuna odaklanan, Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında U-ExM'nin uygulanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, farklı parazit yapılarını işaretlememizi sağlayan bir pan-proteom etiketi olan N-Hidroksisüksinimit esterin (NHS) kullanımını da optimize ettik.

Giriş

Genleşme mikroskobu (ExM) ilk kez 2015 yılında Boyden ve ark.1 tarafından tanımlanmıştır. Konvansiyonel bir mikroskobun kırınım sınırının altında bir uzamsal çözünürlük elde edebildiği bir görüntüleme protokolüdür. Bu daha yüksek çözünürlük, numunenin fiziksel olarak büyütülmesi nedeniyle elde edilir. Bunu başarmak için, floresan etiketli moleküller, daha sonra su ile izotropik olarak genleşen bir hidrojel ile çapraz bağlanır. Bu genişlemenin bir sonucu olarak, sinyaller her üç boyutta da neredeyse izotropik olarak ayrılır. Bu yöntem düşük maliyetli kimyasallar kullanır ve konfokal (konfokal) mikroskoplar kullanılarak yaklaşık 65 nm'lik bir uzamsal çözünürlük sağlar, bu da konfokal bir mikroskobun standart çözünürlüğünden (yaklaşık 250 nm) yaklaşık dört kat daha iyidir1.

Genleşme mikroskobunun birçok biyolojik alanda kullanılmasını sağlayan bir sonraki dönüm noktası, immünofloresan etiketlemenin geleneksel antikorlar2 ile uyarlanmasıydı. Başlangıçta yayınlanan ExM protokolünden bir başka uyarlama, proteomun (MAP) büyütülmüş analizidir.3. Bu yöntem, protein içi ve proteinler arası çapraz bağlanmayı önlemek için numune-hidrojel daldırmasından önce yüksek konsantrasyonlarda akrilamid ve paraformaldehit kullanımını tanıttı, bu da numunelerin protein içeriğinin ve hücre altı mimarisinin daha iyi korunmasına yol açtı. Bu alternatif protokol, fiksatif ajanların (formaldehit/paraformaldehit ve akrilamid) daha düşük konsantrasyonlarında kullanılarak izole edilmiş organellerin genel üst yapısının daha iyi korunmasını sağlamak için optimize edilmiştir; bu yaklaşım ultrastrüktür genleşme mikroskobu (U-ExM)4 olarak adlandırıldı.

Daha da fazla çözünürlük elde etmek için, 20 nm'nin altındaki çözünürlüklere ulaşmak için ExM'nin uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu veya tek molekül lokalizasyon mikroskobu dahil olmak üzere süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleriyle kombinasyonu da rapor edilmiştir5.

ExM'nin kullanımı, sinirbilim ve hücre iskeleti araştırmaları6 alanlarında geniş çapta bildirilmiştir, ancak parazitik protistler üzerinde sadece birkaç çalışma yapılmıştır. Laboratuvarımız, T. cruzi7'de U-ExM uygulamasını ilk bildiren kişi olmuştur. Vakıf protokolü esas olarak Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. ve Trypanosoma brucei 8,9,10,11'deki önceki U-ExM raporlarına dayanmaktadır.

ExM'nin en büyük avantajlarından biri, farklı biyolojik numunelere uyum sağlamak için büyük esneklik sağlayan modüler yapısıdır. Protokol, deneysel gereksinimlerini karşılamak için kullanıcı tarafından kolayca ayarlanabilen adımlara (fiksasyon, çapraz bağlama önleme veya jelleşme gibi) ayrılabilir. Ek olarak, bu boru hattı, model organizma ile uyumluluğu artırmak veya belirli bir çözünürlük elde etmek için değiştirilebilir. Sonuç olarak, ExM hem gelişmiş hem de gelişmiş olmayan optik sistemler için muazzam bir potansiyel sunarak gelecekte daha geniş uygulamalar sağlar.

Amerikan tripanozomiyazis olarak da adlandırılan Chagas hastalığı, Latin Amerika'da bir protozoan parazit olan Trypanosoma cruzi'nin neden olduğu endemik bir hastalıktır. Parazitin yaşam döngüsü karmaşıktır ve memelilerde iki gelişim aşamasını ve bu hastalığın biyolojik vektörü olan böcek konakçısında (Triatominidae ailesinin üyeleri) iki aşamayı içerir. Chagas hastalığı, Dünya Sağlık Örgütü tarafından listelenen ihmal edilmiş tropikal hastalıklar grubuna aittir ve Latin Amerika'da önemli bir ekonomik ve sosyal sorunu temsil etmektedir. Epidemiyolojik çalışmalar, dünya çapında 8 milyon insanın Chagas hastalığı ile yaşadığını ve yılda 10.000'den fazla ölüm olduğunu tahmin ediyor. Bu rakamlar, Chagas hastalığının dünya çapında bir halk sağlığı sorunu olarak önemini örneklemektedir. Chagas hastalığının coğrafi dağılımı son yıllarda değişmiştir ve birçok enfekte birey, başlangıçta bulunduğu Latin Amerika'nın öncelikli olarak kırsal bölgelerinin aksine, artan göçler nedeniyle küresel olarak büyük kentsel alanlarda ikamet etmektedir12.

T. cruzi'nin gelişim aşamaları, tamamen in vitro olarak çoğaltılabilen yaşam döngüsü boyunca farklılık gösterir. Epimastigotlar, böcek vektöründe replikatif formlardır ve hücre gövdesinin merkezi bölgesinde küresel bir çekirdeğe ve çekirdeğe göre ön bölgede çubuk şeklinde bir kinetoplast (kinetoplastidlere özgü mitokondriyal DNA içeren bir yapı) bulunurlar. Tripomastigotlar enfektif, replikatif olmayan formdur ve uzun bir çekirdeğe, yuvarlak bir posterior kinetoplasta ve parazitin tüm uzunluğu boyunca plazma zarına bağlı bir kamçıya sahiptir. Amastigotlar hücre içi replikatif formdur; Orta bölgede bir çekirdeğe, hücre gövdesinin ön kısmında çubuk şeklinde bir kinetoplasta ve indirgenmiş bir kamçıya sahiptirler. Parazitin farklı ortamlara uyum sağlama yeteneği, bu morfolojik varyasyonların bir yansımasıdır. Bu yaşam döngüsünün simetrik bölünme ve farklı geçiş gelişim aşamalarını içerdiğini de belirtmekte fayda var13. Farklılaşma sırasında, tripanosomatidlerin hücre iskeleti kritik bir rol oynar. Bu yapı, plazma zarının altında düzenli bir stabil mikrotübül dizisi halinde düzenlenmiş bir subpelliküler mikrotübül korsesi tarafından oluşturulur. Ayrıca, bu organizmalarda, paralel uzanan ve kamçılı aksonem14'e bağlı kafes benzeri bir yapı olan bir paraflagellar çubuk bulunur. Hücre döngüsü aşamaları boyunca kesin hücre iskeleti organizasyonu ve nükleer yapısal değişiklikler, tripanosomatidlere özgü benzersiz gen düzenleme mekanizmalarını içerir ve bu da onları hücre biyolojisi çalışmaları için ilginç modeller haline getirir.

T. cruzi ve diğer protozoan parazitlerin küçük boyutu göz önüne alındığında, U-ExM bu önemli patojenlerin yapısal özelliklerini analiz etmek için mükemmel bir araç sunar. Daha önce de belirtildiği gibi, bu tekniğin T. cruzi üzerinde uygulanabilirliği ilk kez Dr. Alonso7 tarafından doğrulanmıştır. Bu rapor, T. cruzi'nin farklı yaşam döngüsü aşamaları sırasında hücre iskeleti proteinlerinin immünolokalizasyonuna vurgu yapan eksiksiz bir U-ExM protokolünü detaylandırmaktadır. Ayrıca, çeşitli parazit yapılarını işaretlememizi sağlayan bir pan-proteom etiketi olan N-Hidroksisüksinimit esterin (NHS) kullanımını optimize ettik. Ek olarak, parazitin üç aşamasını elde etmek için bir in vitro metodoloji açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Şekil 1 , deney tasarımının tamamını göstermektedir.

Tripanozomiyaz yaşam döngüsü diyagramı; mikroskop hazırlığı; genleşme mikroskobu; immünofloresan.
Şekil 1: T. cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşaması için U-ExM iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Poli-D-lizin kaplı lamellerin hazırlanması

  1. Bir Petri kabına 10 cm x 10 cm kare bir sızdırmazlık filmi yerleştirin. Lamelleri 35 mm'lik bir cam Petri kabında mutlak etanol ile yıkayarak yıkayın.
  2. Lamelleri cımbızla etanol banyosundan çıkarın ve fazla sıvıyı kağıt mendil ile boşaltın. Lamelleri sızdırmazlık filminin üzerine yerleştirin.
  3. Etanolün geri kalanını mikroskopi dereceli kağıtla emdirin. Lamelin ortasına% 0.1 v / v'lik bir poli-D-lizin çözeltisi ekleyin ve yüzeyinin yaklaşık% 80'ini kaplayacak şekilde ucu ile yayın. Petri kabını kapatın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: 22 mm2 lamel için 200 μL poli-D-lizin çözeltisi kullanın; 12 mm'lik yuvarlak lameller için 100 μL poli-D-lizin çözeltisi kullanın.
  4. Lamelleri üç kez ultra saf suyla yıkayın. Her yıkama arasında suyu çıkarmak için vakumlu aspirasyon kullanın. 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.

2. Çözelti hazırlama

  1. 8 (a/a) sodyum akrilat (SA) stok çözeltileri hazırlayın.
    1. Karıştırırken 31 mL nükleaz içermeyen suya yavaşça 19 g SA ekleyin.
      NOT: Bu çözelti çok viskozdur; Pipetleme yaparken dikkat edin.
    2. SA tamamen çözüldüğünde, steril bir kapta saklayın. 4 °C'de tutun ve her 6 ayda bir değiştirin.
      NOT: SA bazen markaya bağlı olarak sodyum poliakrilat ile kontaminasyon belirtileri gösterir, bu da stok çözeltisini hazırlarken sarımsı ve bulanıklaşırken fark edilir. Bu durumda dikkatli kullanın.
  2. % 40 (a / h) akrilamid (AA) ve% 2 (a / h) N, N'-metilen bisakrilamid (BIS) stok çözeltisi hazırlayın. Her bir bileşiği ultra saf suda çözün ve 0,22 μm steril şırınga filtresi ile filtreleyin. Steril bir kapta 4 °C'de saklayın.
    DİKKAT: AA ve BIS oldukça toksik maddelerdir. Çeker ocak altında çalışın ve uygun koruma elemanları (eldiven, koruyucu giysi, maske ve koruyucu gözlük) kullanın.
  3. 38 μL 7 formaldehit (FA) çözeltisi ile 50 μL @ akrilamid stok çözeltisi (adım 2.2) 912 μL fosfat tamponlu salin (PBS; Tablo 1) %1.4 formaldehit ve %2 akrilamid nihai konsantrasyonu elde etmek için.
    NOT: CP solüsyonunu her zaman taze olarak hazırlayın ve pipetleme sırasında son derece hassas olun. Örneğin, 900 μL PBS almak için bir P1000 pipeti ve kalan 12 μL PBS'yi almak için bir P20 pipeti kullanın.
  4. Monomerik çözeltiyi hazırlayın
    NOT: Çözeltiyi hazırlandıktan hemen sonra kullanmayın; Kullanmadan önce en az 24 saat -20 °C'de saklayın.
    1. 500 μL% 38 SA çözeltisi (adım 2.1), 250 μL % 40 AA çözeltisi ve 50 μL BIS çözeltisi (adım 2.2) ve ayrıca 100 μL 10x PBS'yi karıştırın (Tablo 1).
    2. 900 μL'lik bu son hacmi, her biri 90 μL monomerik çözelti içeren 10x 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde alikot edin. -20 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
      NOT: SA çözeltisi çok viskoz olduğu için pipetleme sırasında uçta kalabilir; Dikkatli olun ve her şeyi dağıtın.
  5. Denatüre edici çözeltiyi hazırlayın
    1. Ultra saf suda hazırlanan 114.3 mL 350 mM sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisini, ultra saf suda hazırlanan 10 mL 4 M sodyum klorür çözeltisi ile karıştırın. 250 mL'lik bir beherde karıştırırken 12 g Tris ekleyin.
      DİKKAT: SDS oldukça toksiktir; Eldiven, koruyucu kıyafet, maske ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında kullanın.
    2. Konsantre bir hidroklorik asit çözeltisi ile pH'ı 9'a ayarlayın. Ultra saf su ile 200 mL'ye kadar hazırlayın ve 4 °C'de steril bir şişede saklayın.
  6. % 10'luk bir amonyum persülfat (APS) çözeltisi ve% 10'luk bir TEMED çözeltisi hazırlayın.
    1. 0.1 g APS'yi 1 mL ultra saf suda çözün.
    2. Ultra saf suda 1 mL% 10 TEMED çözeltisi hazırlayın.
    3. 1.5 mL mikrosantrifüj steril tüplerinde her iki çözeltiden 100 μL alikot hazırlayın ve bunları -20 ° C'de 1 aya kadar saklayın.
  7. Paraformaldehit çözeltisini hazırlayın.
    1. 60 ° C'de karıştırırken 2 g paraformaldehiti 40 mL PBS'de çözün. Çözelti beyazdan renksizliğe dönene kadar damla damla 1 M NaOH ekleyin.
      DİKKAT: Formaldehit oldukça zehirlidir; Eldiven, koruyucu kıyafet, maske ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında kullanın.
    2. Çözeltiyi oda sıcaklığında soğutun ve pH'ı NaOH ile 50 mL'lik bir son hacimde 7.2'ye ayarlayın. 0,22 μm steril şırınga filtresi ile filtreleyin ve steril bir kapta saklayın.
    3. 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  8. Paraformaldehit/glutaraldehit çözeltisini hazırlayın.
    1. 3.5 mL ultra saf suya ve 50 μL 16 M NaOH çözeltisine 0.2 g paraformaldehit ekleyin. Paraformaldehiti çözmek için çözeltiyi 60 °C'ye ısıtın.
    2. Soğutun ve 300 μL% 70 gluteraldehit ekleyin. Hacmi ultra saf su ile 5 mL'ye ve son olarak PBS ile 10 mL'ye yükseltin.
      DİKKAT: Paraformaldehit ve gluteraldehit oldukça toksiktir; Eldiven, koruyucu giysi, maske ve koruyucu gözlük takarak çeker ocak altında kullanın.
    3. 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.

3. Parazit kültürlerinin hazırlanması

  1. T. cruzi epimastigotlarını büyütün.
    1. Bir T-25 şişesinde (25cm2 büyüme alanı) bir aksenik kültür kullanın ve her 48-72 saatte bir% 10 fetal buzağı serumu (FCS; Tablo 1).
    2. Kapağın güvenli bir şekilde kapatıldığından emin olun ve inkübasyon için kültür şişesini dikey olarak 28 °C'de tutun. Her alt kültür sırasında bir Neubauer odasında hücre sayımı ile parazit büyümesini izleyin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan Dm28c suşu için, log faz kültürlerindeki epimastigot konsantrasyonu 1-5 x 107 parazit/mL arasındadır.
    3. % 10 FCS ile desteklenmiş LIT ortamında bir log faz kültüründen 2 x10 6 epimastigot / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın. Süspansiyonu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleyin. PBS ile bir veya iki kez yıkayın ve 200 μL PBS'de tekrar süspanse edin.
    4. Daha önce poli-D-lizin ile kaplanmış yuvarlak 12 mm'lik lamel üzerine yapıştırın (bölüm 1). RT'de 15-20 dakika inkübe edin. Çapraz bağlama önleme adımına geçin (bölüm 4).
      NOT: Alternatif olarak, parazitlerin lamele yapışmasından önce epimastigotları 7 dakika boyunca soğuk metanol veya RT'de 10 dakika boyunca paraformaldehit/glutaraldehit çözeltisi (adım 2.8) ile sabitleyin. Sabit parazitleri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklamak mümkündür.
  2. Amastigotları enfekte Vero hücrelerinden elde edin.
    1. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının altına 12 mm'lik steril bir yuvarlak lamel yerleştirin. % 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) 2 x 105 Vero hücresi / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın. Tohum Kuyucuk başına 500 μL süspansiyon.
      NOT: Bu çalışma, hücrelerin daha yavaş büyümesine izin vermek için% 2 FCS ile DMEM kullanır.
    2. Hücre bağlanmasını sağlamak için gece boyunca (AÇIK; 12-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    3. İnkübasyondan sonra, hücreleri 500 μL steril PBS kullanarak iki kez yıkayın. Kuyu başına% 2 FCS ile 100 μL DMEM'de 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücrelere T. cruzi tripomastigotları ekleyin, bu da kuyu başına bir milyon tripomastigota karşılık gelir. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 6 saat inkübe edin.
    4. İnkübasyondan sonra, plakaları PBS ile iki kez durulayın. % 2 FCS ile desteklenmiş 500 μL DMEM ekleyin. Bu noktada, çapraz bağlama önleme adımına geçin (bölüm 4).
      NOT: İntrasitoplazmik amastigotlar, enfeksiyondan 2 gün sonra ters çevrilmiş bir optik mikroskop ile görülebilir (Ek Şekil 1). Alternatif olarak, parazitlerin lamel ile yapışmasından önce tripomastigotları -20 ° C'de 7 dakika soğuk metanol veya RT'de 10 dakika paraformaldehit / glutaraldehit ile sabitleyin.
  3. Enfekte Vero hücrelerinden tripomastigotlar elde edin.
    1. Tripomastigotlarla enfekte olmuş bir Vero hücre tek tabakasının (% 30 -% 40 birleşme) süpernatantını toplayın (MOI 1: 10; Kuluçka döneminde) enfeksiyondan 4 gün sonra.
      NOT: Bir T-25 şişesi için, kullanılan Vero hücrelerinin başlangıç konsantrasyonu 800.000 hücredir ve bir T-75 şişesi için iki milyon hücredir.
    2. Hücre sayımı için bir Neubauer odası kullanarak tripomastigot konsantrasyonunu belirleyin. RT'de 7.000 x g'da 4 x 106 tripomastigotu 10 dakika santrifüjleyin.
    3. PBS ile iki kez durulayın ve 200 μL PBS'de tekrar süspanse edin. Poli-D-lizin ile kaplanmış yuvarlak, 12 mm'lik bir lamel üzerine uygulayın (bölüm 1). RT'de 10-15 dakika inkübe edin. Çapraz bağlama önleme adımına devam edin (bölüm 4).
      NOT: Alternatif olarak, parazitlerin lamel üzerine yapışmasından önce tripomastigotları -20 ° C'de 7 dakika soğuk metanol veya RT'de 10 dakika paraformaldehit/glutaraldehit ile sabitleyin.

4. Çapraz bağlanma önlemenin yapılması (1. GÜN)

  1. 12 mm'lik lamel yapışmış parazitler veya enfekte olmuş hücrelerle (yukarı bakacak şekilde) her bir oyukta 0.5 mL CP çözeltisi (adım 2.3) bulunan 24 oyuklu bir plakaya batırın.
  2. Buharlaşmayı azaltmak için boş kuyuları suyla doldurun. Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. 37 °C'de 5 saat inkübe edin. Bu adım, 4 °C'de bir ON inkübasyonuna kadar uzatılabilir.
    NOT: Lameli her zaman çözeltiye batırın; Fiksatif solüsyonu lamellerin üzerine pipetlemeyin.

5. Numunenin jelleşmesinin gerçekleştirilmesi

  1. Kağıt mendilin üzerine bir sızdırmazlık filmi ile bir Petri kabına nemli bir oda monte edin (Şekil 2A). Kağıt mendile su ekleyin ve soğuması için -20 °C'de 20 dakika inkübe edin. Bir TEMED ve bir APS alikotunu 20 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün (adım 2.6).
    NOT: APS'yi üç defadan fazla dondurmayın.
  2. Serin, nemli odayı buzun üzerine yerleştirin (Şekil 2A). 4. bölümde hazırlanan 24 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın. CP solüsyonunu 3 mL'lik bir Pasteur pipeti ile aspire edin, bir miktar solüsyon bırakın, aksi takdirde lamellerin çıkarılması zor olacaktır.
  3. 12 mm'lik lamelleri cımbızla sabitleyici solüsyondan çıkarın ve parazitler yukarı bakacak şekilde kağıt mendil üzerine koyun.
    NOT: Lameli kaldırmak için steril bir iğne kullanmak ve ardından cımbızla tutmak faydalı olacaktır.
  4. 90 μL monomerik çözeltinin bir alikotuna (adım 2.4), daha önce çözülmüş 5 μL TEMED ve 5 μL APS ekleyin. 2-3 saniyeden fazla olmamak üzere bir girdap karıştırıcı ile karıştırın; Tüpü kapakla kapatmak gerekli değildir.
    NOT: Her zaman önce TEMED'i ve en son APS'yi ekleyin. Monomerik çözeltiye önce APS ve en son TEMED'in eklenmesi, jelleşme sürecini daha hızlı hale getirir ve onu manipüle etmek için zaman vermez.
  5. Her lamel için nemli haznenin sızdırmazlık filmi üzerine hızlı bir şekilde 35 μL'lik bir damla damlatın. Lameli hemen cımbızla alın ve parazitler aşağı bakacak şekilde damlanın üzerine (Şekil 2B) yatırın.
    NOT: Bir seferde en fazla iki lamel yapın; Çözelti çok hızlı bir şekilde polimerize olduğu için bu adımı geciktirmemek çok önemlidir.
  6. Nemli odayı buz üzerinde 5 dakika ve ardından 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Bir sonraki adım için doğru sıcaklığı sağlamak için 95 °C'de bir ısıtma bloğunu açın.

Jel içinde hücre kapsüllemesi; A-B: buz üzerinde petri kabı; C: jel altındaki hücrelerin diyagramı, lamel kurulumu.
Şekil 2: Jelleşme adımı detayları. (A) Nemli odanın montajı. (B) Lamellerin jelleşme için TEMED ve APS ile monomer çözeltisi üzerine bırakılması. (C) Görüntüleme için bir araya getirilen jelin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Jelleşmiş numunelerin denatüre edilmesi ve izotropik genleşmenin gerçekleştirilmesi

  1. Denatürasyon solüsyonunu (adım 2.5) 4 °C'den çıkarın. Çökelirse, tamamen eriyene kadar sıcak su banyosuna koyun.
  2. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2 mL denatüre edici çözelti ekleyin. Lamelleri adım 5.3'ten denatürasyon solüsyonu ile plakaya aktarın. Jelin lamelden ayrılması için hafifçe çalkalayarak RT'de 15 dakika inkübe edin.
  3. Jeli (12 mm'lik lamel den çıkararak) metal bir spatula ile 1 mL denatüre edici solüsyon içeren 1.5 mL steril bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. Tüpleri sabitlemek için kapak kilitleri kullanın. Bir ısıtma bloğunda 95 ° C'de 1 saat 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adımda jeller genişlemeye başlar; Jeli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarırken nazik olun.
    DİKKAT: İnkübasyondan sonra, jeli içeren tüp 95 °C'dedir ve bu tehlikeli olabilir. Yanıkları ve çıkıntıları önlemek için koruyucu eldiven kullanın ve tüpleri tutmadan önce soğumasını bekleyin.
  4. Genişletmenin ilk turunu gerçekleştirin
    1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünden denatüre edici solüsyonu bir P1000 pipeti ile jel ile aspire edin. Jeli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünden küçük bir spatula kullanarak 30 dakika boyunca 10 mL ultra saf su içeren bir Petri kabına aktarın.
    2. Tek kullanımlık 3 mL Pasteur pipeti kullanarak ultra saf suyu değiştirin. RT'de inkübe edin.
      NOT: Jellere karşı nazik olun, çünkü ilk 30 dakikalık inkübasyondan sonra kırılgan hale geldiler.
    3. Tek kullanımlık 3 mL Pasteur pipeti kullanarak ultra saf suyu bir kez daha değiştirin.
      NOT: Her biri 30 dakikalık üç su inkübasyonu yeterlidir, ancak pratiklik için ikinci inkübasyonu AÇIK bırakmak daha iyidir.

7. Hedef proteinlerin floresan etiketlemesinin yapılması (2. GÜN)

  1. Tek kullanımlık 3 mL Pasteur pipeti ile jel ile Petri kabındaki suyu çıkarın. Genleşmeyi hesaplamak için jelin çapını bir kumpas ile ölçün (dört ila beş kat arasında).
  2. 15 dakika boyunca 10 mL PBS ile iki kez yıkayın. Jeli bir tıraş bıçağıyla dairesel jelin ortasında yaklaşık 10 mm x 10 mm'lik kareler halinde kesin. Test edilecek koşul başına bir kare kullanın.
    NOT: Jel, PBS inkübasyonlarından sonra küçülür. Jeller PBS'de 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
  3. Her kareyi 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve çalkalayarak 37 ° C'de 2 saat ve 30 dakika% 2 PBS-sığır serum albümini (BSA) içinde seyreltilmiş 500 μL primer antikor ile inkübe edin.
    NOT: Alternatif antikor inkübasyonu 4 °C'de AÇIK olarak gerçekleştirilebilir. Kullanılabilecek minimum antikor hacmi 24 oyuklu bir plakada 300 μL'dir. Genel bir kural olarak, konvansiyonel immüno-etiketleme için kullanılan antikor konsantrasyonunun iki katını kullanın.
  4. 6 oyuklu bir plakada çalkalarken 10 dakika boyunca% 0.1 polisorbat 20 ile 2 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Jeli 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve DAPI ile PBS'de 500 μL ikincil antikor ve istenen florofora konjuge edilmiş 10 μg / mL NHS-ester ile 37 ° C'de 2 saat ve 30 dakika boyunca hafifçe çalkalama ile inkübe edin.
    NOT: Genel bir kural olarak, geleneksel immünoetiketleme için kullanılan antikor konsantrasyonunun iki katını kullanın. Alternatif olarak, bu inkübasyon 4 ° C'de AÇIK olarak gerçekleştirilebilir.
  6. 6 oyuklu bir plakada çalkalarken 10 dakika boyunca% 0.1 polisorbat 20 ile 2 mL PBS ile üç kez yıkayın.
  7. Jeli ultra saf su ile bir Petri kabına aktarın. 30 dakika inkübe edin. Adım 6.4'te yapıldığı gibi tek kullanımlık 3 mL Pasteur pipeti ile suyu iki kez değiştirin.

8. Görüntüleme ve görüntü işleme (3. GÜN)

  1. Tek kullanımlık 3 mL Pasteur pipeti ile Petri kaplarındaki suyu çıkarın ve genleşme faktörünü hesaplamak için jel çapını bir kumpas ile ölçün.
  2. Jiletle ~10 mm x 10 mm boyutlarında küçük bir parça kesin ve 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağa yerleştirin.
    NOT: Alternatif olarak, jeli bir slayt ile bir lamel arasına yerleştirin (poli-D-lizin olmadan). Slayt, jelin kalınlığı hakkında bir oda oluşturmak için yanlara tutturulmuş bir elmas bıçakla kesilmiş iki küçük slayt parçasına sahip olmalıdır.
  3. Yönlendirmeyi 10x veya 20x büyütmede kontrol edin. Düzgün bir şekilde odaklanmak için parazitlerin lamel ile karşı karşıya olduğundan emin olun; aksi takdirde, jeli ters çevirip tekrar kontrol etmek gerekir (Şekil 2C).
  4. Doğru yönlendirme bulunduğunda, kalan jeli mikroskopi kağıdı ile kurulayın. Jeli poli-D-lizin kaplı bir lamel ile örtün.
  5. Konfokal mikroskopla görselleştirmek için jele küçük bir damla ultra saf su ekleyin.
    NOT: Düzgün görüntülemeyi sağlamak için, jel içeren hücrelerin yüzeyine yakın tarafının uçtaki cam tabanlı tabağa bakacak şekilde işlem boyunca jel oryantasyonunu korumak çok önemlidir. 35 mm'lik tabaklar kullanılırken, tabana yerleştirilen lamele poli-D-lizin eklemek, görüntü elde etme sırasında jel kaymasını azaltır.
  6. Görüntü alma parametreleri
    1. Numuneleri 63x yağa daldırma 1.4 sayısal açıklık (NA) objektifi kullanarak konfokal bir mikroskopta (Malzeme Tablosu) görüntüleyin.
    2. Örneklemeye, sinyal yoğunluğuna ve alım sürelerinin optimizasyonuna bağlı olarak ampirik olarak belirlenecek Z yığınlarını, her bir z adımının genişliğini ve piksel başına maruz kalma süresini elde edin. İsterseniz etkili büyütme için tarama yakınlaştırmasını kullanın.
    3. Görüntü işleme yazılımını kullanarak Z yığınını açın (Malzeme tablosu). Her kanal için, Grup Z-projesi seçeneğini kullanarak yığılmış görüntüleri gruplandırın. Maksimum yoğunluk projeksiyonunu seçin.
    4. Görüntüleri birleştirmek için Kanalları Birleştir aracını kullanın ve her kanalın rengini seçin. İşleme yazılımındaki Ölçek Çubuğu aracını kullanarak bir ölçek çubuğu ekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, her kanal istenildiği gibi renklendirilebilir (temsili sonuçlardaki örneklere bakın).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol düzgün bir şekilde yürütüldüyse (Şekil 1), numuneler suda 4-4.5x faktöre kadar genişletilebilen düzlemsel ve yarı saydam bir jel olarak görünür olacaktır (Şekil 3A). Bu genişleme, son genleşme faktörüne ve kullanılan görüntüleme sistemine bağlı olarak değişebilen yaklaşık 70 nm'lik etkili bir çözünürlük sağladı. İkinci genişleme işleminden ve konfokal mikroskopta görüntü elde edildikten sonra, yaklaşık 4.5 genişleme faktörünü gözlemleyebildik. Bu genişl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ultrastrüktürel genleşme mikroskobu, biyolojik numunelerin fiziksel olarak orijinal boyutlarının birkaç katına kadar genişletilerek yüksek çözünürlüklü görüntülerinin elde edilmesini sağlayan bir tekniktir. U-ExM protokolü, en iyi sonuçları elde etmek için dikkatli bir şekilde yürütülmesi gereken birkaç kritik adımı içerir4. İlk olarak, numune bir CP ajanı ile sabitlenmeli ve şişirilebilir bir hidrojel matrisine gömülmelidir. CP çözeltisinde bulunan formaldehit, n...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Vero hücre kültürüne yardımcı olduğu için Dolores Campos'a ve T. cruzi kültürüne yardımcı olduğu için Romina Manarin'e teşekkür ederiz. Bu çalışma Arjantin'den Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2019-0526), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) ve Birleşik Krallık Araştırma Konseyi [MR/P027989/1] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 mikrometre steril şırınga filtreleri PESMembran çözeltileriSFPES030022S
1 L beherSchott Duran10005227
1.5 mL SPINWIN Mikro Santrifüj TüpüTarsonT38-500010
10 mL tek kullanımlık steril seryngeNP66-32
10 mL serolojik pipet sterilJet BiofilGSP211010
12 mm lamellerMerienfeld GmbH01 115 20Yuvarlak lameller
12 kuyucuklu plakalarJet BiofilTCP011012
22 mm lamellerCorning2845-22Kare lameller
24 kuyucuklu plakalarJet BiofilTCP-011-024
250 mL beherSchott DuranC108.1
3 mL Pasteur pipetDeltalab200037
35 mm cam alt tabaklarMatsunami cam içD11130H
4 & prime ;, 6-Diamidin-2 & prime; -fenilindol dihidroklorürSigma AldrichD9542DAPI
5 ml serolojik pipet sterilJet BiofilGSP010005
6 oyuklu plakalarSarstedt83.3920
AkrilamidBioRad1610101
Amonyum persülfatSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS esterBOC SciencesF10-0107Pan-proteom etiketleme için
Biosafty KabiniTelstarBio II A/P
Sığır Sodyum AlbüminSigma AldrichA7906BSA
CO2 İnkübatörSanyoMCO-15A
Konfokal MikroskopZeissLSM 880
Tek Kullanımlık PetridishTarsons46009590 mm çaplı
DMEM, Yüksek GlikozluThermo Fisher Kimyasal 12100046Toz
Elektronik dijital kumpasRadarRADAR-SÜRGÜ-KUMPAS
Etanol MutlakSupelco1,00,98,31,000
Fetal Buzağı SerumuInternegocios SAFCS FRA 500Steril ve ısıyla inaktive edilmiş
Fiji görüntü işleme paketiImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehit %37Sigma AldrichF8775FA
Cam PetridishMarienfeld SuperiorPM-340030060 mm çap
Glukoza D(+)Cicarelli
Glutaraldehit% 70Sigma AldrichG7776
Keçi anti-Fare IgG İkincil Antikoru Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
Keçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikor FICTJackson İmmünoaraştırma115-095-003
Dereceli silindirNalgene3663-1000
Dereceli cam şişeGlasscoGL-274.202.01100 mL
Isıtma BloğuIBREvde üretilmiştir
HeminFrontier ScientificH651-9
Hidroklorik asit %36,8-38,0Ciccarelli918110
Buz kovasıCorning1167U68
İnkübatörTecno DalvoTOC130
Karaciğer İnfüzyonuDifco226920
Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcıLaboratuvar arkadaşıHP-3000
Metal spatulaSALTTECH200MM
Metal cımbızMarienfeld SuperiorPM-6633002
Metanol absolutCicarelli897110
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mLTarson500010-N
Mikroskopi dereceli kağıt KimWipes KimtechScienceB0013HT2QW
Milli-Q su sistemiMerk MilliporeIQ-7003
fare anti-alfa tübülin klonu DM1ASigma AldrichT9026
fare anti-PFR. Ariel Silber (USP) tarafından bağışlanansaflaştırılmış antikorlar
N, N ve akut; -metilenbisakrilamidICN193997Bis
Na2HPO4Cicarelli834214
Neubauer haznesiBoecoBOE 01
p1000 pipetGilsonPIPETMAN P1000
p1000 pipet uçlarıTarsonTAR-521020B
p20 pipetGilsonPIPETMAN P20
p20 pipet uçlarıTarsonTAR-527108
p200 pipetGilsonPIPETMAN P200
p200 pipet uçlarıTarsonTAR-521010Y
ParaformaldehitSigma AldrichP6148PFA
pH / ORP / ° C metreHANNA AletleriHI 2211
Poli-D-Lizin %0.1Sigma AldrichP8920
Potasyum KlorürCicarelli867212KCl
Tıraş bıçağıPrintexBS 2982:1992
Sızdırmazlık FIlm "Parafilm M"BemisPM996
Sodyum AkrilatSigma Aldrich408220-25GSA
Sodyum BikarbonatCicarelli929211NaHCO3
Sodyum KlorürCicarelli750214NaCl
Sodyum Dodesil SülfatBioRad1610302SDS
Sodyum HidroksitMerk1-06498NaOH
Sorvall ST 16 SantrifüjThermo Fisher Scientific75004380
T-25 şişeleriCorning430639
TEMEDInvitrogen15524-010
Kağıt mendilElite
TriptoseMerck1106760500
TrisBioRad1610719
Tween-20Biopack2003-07Polisorbat 20
Vakum pompasıSilfabN33-A
Vero hücreleriATCCCRL-1587
Girdap MIxerEjderha LaboratuvarıMX-S
716214 Dr

Kaynaklar

  1. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  2. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  4. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).
  5. Tillberg, P. W., Chen, F. Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).
  6. Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy. Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).
  7. Alonso, V. L. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes. Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).
  8. Kalichava, A., Ochsenreiter, T. Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei. Open Biology. 11 (10), 210132(2021).
  9. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).
  10. Liffner, B., Absalon, S. Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein. Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).
  11. Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii. Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).
  12. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).
  13. Carrea, A., Diambra, L. Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi. PloS One. 11 (1), e0146947(2016).
  14. Vidal, J. C., De Souza, W. Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease. , InTech. (2017).
  15. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  16. Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  17. Sahabandu, N., et al. Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia. Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).
  18. Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications. Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).
  19. Trinks, N., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy. Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).
  20. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  21. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).
  22. Shaib, A. H., et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv. , (2023).
  23. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ultrastr kt r Geni letme MikroskopisiChagas HastalSitoskelet ProteinleriKonfokal Mikroskopimm nolokalizasyonPan Proteom EtiketlemeEpimastigot EvresiFlagellar Aksonem

İlgili makaleler