Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Çoklu foton mikroskobu ve moleküler teknolojilerin ilerlemesiyle, floresan görüntüleme, canlı beyin dokularının yapısını, işlevini ve plastisitesini incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmek için hızla büyüyor. Konvansiyonel elektrofizyoloji ile karşılaştırıldığında, floresan mikroskobu, hücrelerin morfolojisinin yanı sıra nöral aktiviteyi de yakalayabilir ve tanımlanan nöron popülasyonlarının tek hücreli veya hücre altı çözünürlükte uzun süreli kayıtlarını sağlar. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tipik olarak, hayvanın hareketini kısıtlayan kararlı, kafaya sabitlenmiş bir kurulum gerektirir ve şeffaf camın düz bir yüzeyinin hazırlanması, nöronların bir veya daha fazla yatay düzlemde görselleştirilmesine izin verir, ancak farklı derinliklerde çalışan dikey süreçlerin incelenmesinde sınırlıdır. Burada, bir kafa plakası fiksasyonu ile çok katmanlı ve çok modlu görüntüleme sağlayan bir mikroprizmayı birleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. Bu cerrahi preparat, yalnızca fare görsel korteksinin tüm kolonuna erişim sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kafaya sabitlenmiş bir pozisyonda iki fotonlu görüntülemeye ve serbestçe hareket eden bir paradigmada bir fotonlu görüntülemeye izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı kortikal katmanlar boyunca tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını kafa sabit ve serbestçe hareket eden durumlar altında kaydedebilir ve aylar boyunca uzun vadeli değişiklikleri izleyebilir. Bu nedenle, bu yöntem, iyi kontrol edilen uyaranlar tarafından ve doğal bir davranış paradigması altında uyandırılan sinirsel aktivitelerin doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan mikro devrelerin kapsamlı bir tahlilini sağlar.
Giriş
Optik sistemlerdeki yeni teknolojileri ve genetiği değiştirilmiş floresan göstergelerini birleştiren in vivo iki fotonlu floresan görüntülemenin 1,2 ortaya çıkışı, canlı beyindeki karmaşık yapıyı, işlevi ve plastisiteyi araştırmak için sinirbilimde güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 3,4. Özellikle, bu görüntüleme yöntemi, nöronların hem morfolojisini hem de dinamik aktivitelerini yakalayarak geleneksel elektrofizyolojiye göre benzersiz bir avantaj sunar ve böylece tanımlanan nöronların uzun süreli izlenmesini kolaylaştırır 5,6,7,8.
Kayda değer güçlü yönlerine rağmen, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme uygulaması genellikle hayvanın hareketliliğini kısıtlayan statik, başa sabitlenmiş bir kurulum gerektirir 9,10,11. Ek olarak, nöronları görselleştirmek için şeffaf bir cam yüzeyin kullanılması, gözlemleri bir veya daha fazla yatay düzlemle sınırlandırarak, farklı kortikal derinliklere uzanan dikey süreçlerin dinamiklerinin keşfini sınırlar12.
Bu sınırlamaları ele alan bu çalışma, çok katmanlı ve çok modlu yeteneklere sahip bir görüntüleme modalitesi oluşturmak için kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopu entegre eden yenilikçi bir cerrahi prosedürün ana hatlarını çizmektedir. Mikroprizma, kortikal kolon 13,14,15,16 boyunca dikey işlemenin gözlemlenmesine izin verir, bu da bilginin korteksin farklı katmanlarından geçerken nasıl işlendiğini ve dönüştürüldüğünü ve plastik değişimler sırasında dikey işlemenin nasıl değiştiğini anlamada kritik öneme sahiptir. Ayrıca, aynı nöral popülasyonların kafaya sabitlenmiş bir paradigmada ve serbestçe hareket eden bir ortamda görüntülenmesine izin verir, çok yönlü deneysel ortamlarıkapsar 17,18,19: örneğin, duyusal algı değerlendirmesi ve 2-foton paradigması altında kararlı kayıtlar gibi iyi kontrol edilen paradigmalar için genellikle kafa fiksasyonu gerekirken, serbestçe hareket etmek davranışsal çalışmalar için daha doğal, esnek bir ortam sunar. Bu nedenle, her iki modda da doğrudan karşılaştırma yapabilme yeteneği, esnek, işlevsel yanıtları mümkün kılan mikro devreler hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için çok önemlidir.
Özünde, kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopun floresan görüntülemeye entegrasyonu, beynin yapısının ve işlevselliğinin inceliklerini araştırmak için umut verici bir platform sunar. Araştırmacılar, tüm kortikal katmanları kapsayan çeşitli derinliklerde tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını hem iyi kontrol edilen hem de doğal paradigmalardaki yanıtlarını doğrudan karşılaştırabilir ve20 ay boyunca uzun vadeli değişikliklerini izleyebilir. Bu yaklaşım, bu nöral popülasyonların farklı deneysel koşullar altında zaman içinde nasıl etkileşime girdiğine ve değiştiğine dair değerli bilgiler sunarak, nöral devrelerin dinamik doğasına bir pencere sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler, 1986 tarihli Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre, uygun etik incelemenin ardından Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan ve verilen kişisel ve proje lisansları altında gerçekleştirilmiştir. Yetişkin transgenik hatlar CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 yetiştirildi ve yavruları deneyde kullanıldı. Deneycilerin güvenliği ve steril koşulların sürdürülmesi için tüm prosedürler aseptik koşullar altında ve tam kişisel koruyucu ekipmanlarla gerçekleştirilmiştir.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- Ödemi en aza indirmek için, ameliyattan 12-24 saat önce Deksametazon (0.2 mg / kg) deri altından uygulayın.
- Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin ve ameliyattan önce cerrahi alanı damıtılmış su ve% 70 etanol ile stabilize hipokloröz asit ile sterilize edin. Tüm cerrahi ekipmanların AÇIK olduğundan emin olun.
- Hayvanı (24 haftalık, 31 g ağırlığında erkek) izofluran kullanarak %5'lik bir indüksiyon dozu ile anestezi altına alın, fare stereotaksik çerçeveye girdikten sonra %1-2'ye düşürülür ve O2 1-2 L / dak arasında tutulur. NSAID'leri (Carprofen, 2.5 mg / kg) deri altına enjekte edin.
- Anestezi derinliğini değerlendirmek için ayak parmağı sıkıştırma refleksinin olup olmadığını kontrol edin (refleks görülürse izofluran konsantrasyonunu %0,5'lik artışlarla artırın).
- Hayvanın kafasını bir düzeltici kullanarak kulakların arkasından gözlerin biraz üstüne kadar tıraş edin. Bu alanı alkollü mendil ve povidon-iyot solüsyonu ile temizleyin ve hayvanın gözleriyle temastan kaçının.
- Hayvanı homeotermik ısıtma yastığına ve kulak ve diş çubuklarıyla donatılmış stereotaksik çerçeveye monte edin ve kafayı sabitleyin. Aşağıdaki prosedürün başarılı olması için bu çok önemli olduğundan, kafanın sabit olduğundan emin olun (Şekil 1).
- Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün ve ışıktan korumak için folyo ile örtün. Hayvanı steril bir cerrahi örtü ile örtün.
Şekil 1: Ameliyat öncesi hazırlık. Fare, bir burun parçası ve kulak çubukları ile sabitlenmiş stereotaksik çerçeveye yerleştirilir. Fare, sıcaklık ayarlı ısıtmalı bir ped üzerine yerleştirilir. Gözlerin üzerinde oftalmik merhem bulunur ve alüminyum folyo ile kaplıdır. Kafa traş edilir ve kafatası açığa çıkar. Hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Kraniyotomi
- Cerrahi makas kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için cildi başın traşlı bölgesinin orta hattı boyunca kesin.
- Herhangi bir bağ dokusunu çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk ve seyreltilmiş hidrojen peroksit (%3 w/v %35H2O2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aynı nöronal popülasyonun birkaç haftalık bir süre boyunca, hem bir hem de iki foton görüntüleme modaliteleri kullanılarak, serbestçe hareket eden ve başa sabitlenmiş koşullar altında kronik çok katmanlı in vivo kalsiyum görüntülemesi yapma yöntemi gösterilmiştir. Burada, hayvan karanlıkta açık bir arenayı keşfederken tek fotonlu görüntüleme altında eşleşen nöronal popülasyonları tanımlama yeteneği gösterilmiştir (Şekil 7A). Tanımlanan nöronlardan kalsiyum izleri çıkarıldı ve karşıl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, aynı nöral popülasyonlarda kafaya sabitlenmiş ve serbestçe hareket eden koşullarda nöronları gözlemleme ve doğrudan karşılaştırma yeteneğini gösterdik. Uygulamayı görsel kortekste göstermiş olsak da, bu protokol hem kortikal alanlar hem de derin çekirdekler 24,25,26,27,28 ve diğer veri toplama ve davranışsal kurulumlar 29,...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir rakip finansal çıkar veya çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Bayan Charu Reddy ve Profesör Matteo Carandini'ye (Cortex Lab) cerrahi protokol ve transgenik fare suşunun paylaşılması konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Dr Norbert Hogrefe'ye (Inscopix) ameliyatın geliştirilmesindeki rehberliği ve yardımı için teşekkür ederiz. Cerrahi kurulum ve veri işleme konusundaki yardımları için Bayan Andreea Aldea'ya (Sun Lab) teşekkür ederiz. Bu çalışma Moorfields Eye Charity tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| İnfüzyon için% 0.9 Sodyum Klorür çözeltisi (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Hidrasyon ve ilaç yeniden yapılandırması için tuzlu |
| 18004-1 Trephine 1.8mm çaplı frez | FST | 18004-18 | Matkap ucu |
| 1ml şırınga | Terumo | MDSS01SE | 1ml şırınga |
| 23G x 5/8 inç %6 LUER iğnesi | Terumo | NN-2316R | 23G iğne |
| 71000 Dahili yazılımlı otomatik stereotaksik cihaz | RWD-RWD | ||
| Emilebilir Hemostatik Jelatin Sünger (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | jel-köpük |
| Alkol pedleri %70 izopropil alkol | Braun | 9160612 | Alkol pedleri |
| Alüminyum folyo | Ameliyat sırasında gözleri kapatmak için | herhangi bir | perakendeci-Folyo |
| Eklemli Beyin Omurilik Sıvısı | Tocris Bioscience a Bio-Techne Marka | 3525/25ML | ACSF |
| Otomatik mikroenjeksiyon pompası | WPI | 8091 | |
| Betadine çözeltisi (%10 iyotlu Povidon) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (özelleştirilmiş) | Bruker-İki | foton görüntüleme sistemi | |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anestezi emici |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objektif lens |
| Kompakt Anestezi sistemi - tek gaz - izofluran K/F, oksijen konsantratörlü Model: ZY-5AC ve süpürücü ünitesi | Vet-Tech | AN001 | Kompakt anestezi sistemi |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Dezenfektan (hipokloröz asit) |
| Deksametazon Sodyum Fosfat Enjeksiyonu, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Deksametazon |
| Diseksiyon Bıçağı, kesme kenarı 4 mm, kalınlık 0,5 mm, paslanmaz çelik | Güzel Bilim Araçları | 10055-12 | Korteks kesisi için bıçak |
| Çift Taraflı, Delinmeyen Fare & Yenidoğan Sıçan Kulak Çubukları | Çalmak | 51649 | Kulak çubuğu |
| Kukla mikroskop | Inscopix | Kukla mikroskop | İmplantasyona yardımcı olmak için |
| Etanol (% 100) | VWR | 40-1712-25 | %70 etanol yapmak için kullanılır; |
| Balıkçı markası Nitril İndigo Tek Kullanımlık Eldivenler KKD Cat III | FischerScientific | 17182182 | Eldivenler |
| Homeotermik Monitör 50-7222-F | Harvard Aparatı | 50-7222-F | Homeotermik izleme sistemi/ısıtma yastığı |
| Görüntü işleme yazılımı | ImageJ-Görüntü | işleme yazılımı | |
| Inscopix Veri İşleme Yazılımı (IDPS) | kalsiyum görüntüleme işleme yazılımı | ||
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | İki fotonlu görüntüleme lazeri |
| IsoFlo 250ml %100 inhalasyon ile | Zoetis | WM 42058/4195 | İzofluran |
| Kwik-Sil Düşük Toksisiteli Silikon Yapıştırıcı Dünyası | Hassas Müdahaleler (WPI) | KWIK-SIL | Silikon yapıştırıcı |
| MICROMOT şebeke adaptörü NG 2/S, Matkap ünitesi 60/E | PROXXON | ileNO 28 515 | El tipi matkap |
| nVoke Entegre Görüntüleme ve Optogenetik Sistem paketi | Inscopix-One-photon | Görüntüleme sistemi ve yazılımı | |
| ProView İmplant Kiti | Inscopix | ProView İmplant Kiti | Kukla mikroskop, stereotaksik kol ve ataşmanı |
| ProView Prizma Probu | Inscopix | 1050-002203 | Mikroprizma lens |
| Rimadil (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Masa kelepçeli mafsallı kol üzerinde Stereotaksi Mikroskobu | WPI | PZMTIII-AAC | mikroskop |
| Süper Bağ Üniversal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Yapıştırıcı çimento |
| İki fotonlu kalsiyum görüntü yazılımı | Suite2P-İki | fotonlu kalsiyum görüntüleme işleme yazılımı | |
| Vapouriser | Vet-Tech-Isofluran | vapouriser | |
| Xailin Kayganlaştırıcı Göz Merhemi 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Oftalmik merhem |
Kaynaklar
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3(2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472(2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970(2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579(2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678(2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728(2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894(2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897(2023).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
