Yöntem makalesi

Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/65387

⸱

19 Ocak 2024

 ,  , 
1Institute of Ophthalmology, University College London

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu foton mikroskobu ve moleküler teknolojilerin ilerlemesiyle, floresan görüntüleme, canlı beyin dokularının yapısını, işlevini ve plastisitesini incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmek için hızla büyüyor. Konvansiyonel elektrofizyoloji ile karşılaştırıldığında, floresan mikroskobu, hücrelerin morfolojisinin yanı sıra nöral aktiviteyi de yakalayabilir ve tanımlanan nöron popülasyonlarının tek hücreli veya hücre altı çözünürlükte uzun süreli kayıtlarını sağlar. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tipik olarak, hayvanın hareketini kısıtlayan kararlı, kafaya sabitlenmiş bir kurulum gerektirir ve şeffaf camın düz bir yüzeyinin hazırlanması, nöronların bir veya daha fazla yatay düzlemde görselleştirilmesine izin verir, ancak farklı derinliklerde çalışan dikey süreçlerin incelenmesinde sınırlıdır. Burada, bir kafa plakası fiksasyonu ile çok katmanlı ve çok modlu görüntüleme sağlayan bir mikroprizmayı birleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. Bu cerrahi preparat, yalnızca fare görsel korteksinin tüm kolonuna erişim sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kafaya sabitlenmiş bir pozisyonda iki fotonlu görüntülemeye ve serbestçe hareket eden bir paradigmada bir fotonlu görüntülemeye izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı kortikal katmanlar boyunca tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını kafa sabit ve serbestçe hareket eden durumlar altında kaydedebilir ve aylar boyunca uzun vadeli değişiklikleri izleyebilir. Bu nedenle, bu yöntem, iyi kontrol edilen uyaranlar tarafından ve doğal bir davranış paradigması altında uyandırılan sinirsel aktivitelerin doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan mikro devrelerin kapsamlı bir tahlilini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik sistemlerdeki yeni teknolojileri ve genetiği değiştirilmiş floresan göstergelerini birleştiren in vivo iki fotonlu floresan görüntülemenin 1,2 ortaya çıkışı, canlı beyindeki karmaşık yapıyı, işlevi ve plastisiteyi araştırmak için sinirbilimde güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 3,4. Özellikle, bu görüntüleme yöntemi, nöronların hem morfolojisini hem de dinamik aktivitelerini yakalayarak geleneksel elektrofizyolojiye göre benzersiz bir avantaj sunar ve böylece tanımlanan nöronların uzun süreli izlenmesini kolaylaştırır 5,6,7,8.

Kayda değer güçlü yönlerine rağmen, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme uygulaması genellikle hayvanın hareketliliğini kısıtlayan statik, başa sabitlenmiş bir kurulum gerektirir 9,10,11. Ek olarak, nöronları görselleştirmek için şeffaf bir cam yüzeyin kullanılması, gözlemleri bir veya daha fazla yatay düzlemle sınırlandırarak, farklı kortikal derinliklere uzanan dikey süreçlerin dinamiklerinin keşfini sınırlar12.

Bu sınırlamaları ele alan bu çalışma, çok katmanlı ve çok modlu yeteneklere sahip bir görüntüleme modalitesi oluşturmak için kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopu entegre eden yenilikçi bir cerrahi prosedürün ana hatlarını çizmektedir. Mikroprizma, kortikal kolon 13,14,15,16 boyunca dikey işlemenin gözlemlenmesine izin verir, bu da bilginin korteksin farklı katmanlarından geçerken nasıl işlendiğini ve dönüştürüldüğünü ve plastik değişimler sırasında dikey işlemenin nasıl değiştiğini anlamada kritik öneme sahiptir. Ayrıca, aynı nöral popülasyonların kafaya sabitlenmiş bir paradigmada ve serbestçe hareket eden bir ortamda görüntülenmesine izin verir, çok yönlü deneysel ortamlarıkapsar 17,18,19: örneğin, duyusal algı değerlendirmesi ve 2-foton paradigması altında kararlı kayıtlar gibi iyi kontrol edilen paradigmalar için genellikle kafa fiksasyonu gerekirken, serbestçe hareket etmek davranışsal çalışmalar için daha doğal, esnek bir ortam sunar. Bu nedenle, her iki modda da doğrudan karşılaştırma yapabilme yeteneği, esnek, işlevsel yanıtları mümkün kılan mikro devreler hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için çok önemlidir.

Özünde, kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopun floresan görüntülemeye entegrasyonu, beynin yapısının ve işlevselliğinin inceliklerini araştırmak için umut verici bir platform sunar. Araştırmacılar, tüm kortikal katmanları kapsayan çeşitli derinliklerde tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını hem iyi kontrol edilen hem de doğal paradigmalardaki yanıtlarını doğrudan karşılaştırabilir ve20 ay boyunca uzun vadeli değişikliklerini izleyebilir. Bu yaklaşım, bu nöral popülasyonların farklı deneysel koşullar altında zaman içinde nasıl etkileşime girdiğine ve değiştiğine dair değerli bilgiler sunarak, nöral devrelerin dinamik doğasına bir pencere sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, 1986 tarihli Birleşik Krallık Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na göre, uygun etik incelemenin ardından Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan ve verilen kişisel ve proje lisansları altında gerçekleştirilmiştir. Yetişkin transgenik hatlar CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 yetiştirildi ve yavruları deneyde kullanıldı. Deneycilerin güvenliği ve steril koşulların sürdürülmesi için tüm prosedürler aseptik koşullar altında ve tam kişisel koruyucu ekipmanlarla gerçekleştirilmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

  1. Ödemi en aza indirmek için, ameliyattan 12-24 saat önce Deksametazon (0.2 mg / kg) deri altından uygulayın.
  2. Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin ve ameliyattan önce cerrahi alanı damıtılmış su ve% 70 etanol ile stabilize hipokloröz asit ile sterilize edin. Tüm cerrahi ekipmanların AÇIK olduğundan emin olun.
  3. Hayvanı (24 haftalık, 31 g ağırlığında erkek) izofluran kullanarak %5'lik bir indüksiyon dozu ile anestezi altına alın, fare stereotaksik çerçeveye girdikten sonra %1-2'ye düşürülür ve O2 1-2 L / dak arasında tutulur. NSAID'leri (Carprofen, 2.5 mg / kg) deri altına enjekte edin.
  4. Anestezi derinliğini değerlendirmek için ayak parmağı sıkıştırma refleksinin olup olmadığını kontrol edin (refleks görülürse izofluran konsantrasyonunu %0,5'lik artışlarla artırın).
  5. Hayvanın kafasını bir düzeltici kullanarak kulakların arkasından gözlerin biraz üstüne kadar tıraş edin. Bu alanı alkollü mendil ve povidon-iyot solüsyonu ile temizleyin ve hayvanın gözleriyle temastan kaçının.
  6. Hayvanı homeotermik ısıtma yastığına ve kulak ve diş çubuklarıyla donatılmış stereotaksik çerçeveye monte edin ve kafayı sabitleyin. Aşağıdaki prosedürün başarılı olması için bu çok önemli olduğundan, kafanın sabit olduğundan emin olun (Şekil 1).
  7. Ameliyat sırasında kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün ve ışıktan korumak için folyo ile örtün. Hayvanı steril bir cerrahi örtü ile örtün.

figure-protocol-1
Şekil 1: Ameliyat öncesi hazırlık. Fare, bir burun parçası ve kulak çubukları ile sabitlenmiş stereotaksik çerçeveye yerleştirilir. Fare, sıcaklık ayarlı ısıtmalı bir ped üzerine yerleştirilir. Gözlerin üzerinde oftalmik merhem bulunur ve alüminyum folyo ile kaplıdır. Kafa traş edilir ve kafatası açığa çıkar. Hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kraniyotomi

  1. Cerrahi makas kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için cildi başın traşlı bölgesinin orta hattı boyunca kesin.
  2. Herhangi bir bağ dokusunu çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk ve seyreltilmiş hidrojen peroksit (%3 w/v %35H2O2

figure-protocol-2


figure-protocol-3

figure-protocol-4



figure-protocol-5


figure-protocol-6

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aynı nöronal popülasyonun birkaç haftalık bir süre boyunca, hem bir hem de iki foton görüntüleme modaliteleri kullanılarak, serbestçe hareket eden ve başa sabitlenmiş koşullar altında kronik çok katmanlı in vivo kalsiyum görüntülemesi yapma yöntemi gösterilmiştir. Burada, hayvan karanlıkta açık bir arenayı keşfederken tek fotonlu görüntüleme altında eşleşen nöronal popülasyonları tanımlama yeteneği gösterilmiştir (Şekil 7A). Tanımlanan nöronlardan kalsiyum izleri çıkarıldı ve karşılaştırma için z-skorlandı (Şekil 7B). Nöronlar, 3 hafta arayla yapılan seanslarda karşılaştırılabilir seviyelerde floresan ve ateşleme oranları gösterdi.

figure-results-1
Şekil 7: Birincil görsel korteksten kalsiyum dinamiği, 3 haftaya yayılan seanslar boyunca stabil bir şekilde kaydedilebilir. (A) 3 haftalık bir süreyi kapsayan, tek foton serbestçe hareket eden kalsiyum görüntüleme altında aynı görüş alanının üç ayrı kaydından alınan maksimum projeksiyon görüntüleri üzerine yerleştirilmiş tanımlanmış nöronların uzamsal filtreleri. ROI'ler (B)'de sunuldukları sıraya göre etiketlenir. İkinci (orta) ve üçüncü (sağ) oturumlardaki koyu bölgeler, ilk (sol) oturumu referans olarak kullanan görüntü kaydının sonuçlarıdır (Ölçek çubuğu 0,5 mm'yi temsil eder). (B) (A)'da gösterilen birinci (sol), ikinci (orta) ve üçüncü (sağ) oturumlarda kayıtlı ROI'lerin Z-skorlu kalsiyum aktiviteleri. Yatay ölçek çubuğu 10 sn ve dikey ölçek çubuğu 10 sd'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Daha sonra, farklı görüntüleme modalitelerinde bir nöronal popülasyonun kaydı gösterildi. Aynı gün bir foton ve iki foton görüntüleme seansı yapıldı. ROI'ler tek foton verilerinden tanımlandı ve bir hücre haritası oluşturmak için manuel olarak seçildi (Şekil 8A). Benzer şekilde, hücrelerin otomatik olarak tanımlandığı ve gösterim için manuel olarak seçildiği bir hücre haritası oluşturmak için iki foton verisi işlendi. Daha sonra, bir foton oturumundan elde edilen ortalama projeksiyon görüntüsü, MIRA platformu ile iki fotonlu z yığınından gelen maksimum projeksiyon görüntüsüne hizalandı (Şekil 8B). Bu çarpık hücre haritası daha sonra dışa aktarıldı, iki fotonlu maksimum projeksiyon görüntüsünün üzerine bindirildi ve iki fotonlu hücre haritası ile hizalandı (Şekil 8C). Bu, nöronal yanıtların kantitatif analizi için kullanılabilecek her iki görüntüleme yöntemi altında aynı hücrelerin aktivitelerini gösteren hücre tanımlamasına izin verdi (Şekil 8D).

figure-results-2
Şekil 8: Farklı görüntüleme modaliteleri arasında kaydedilen birincil görsel korteksten kalsiyum dinamiği. (A) Tanımlanmış nöronların uzamsal filtreleri, tek fotonlu, serbestçe hareket eden bir oturumdan maksimum projeksiyon görüntüsü üzerine bindirilmiştir. Etiketli nöronlar, (C)'de sunulan iki foton kayıt verilerine başarıyla kaydedilen nöronlardır. (B) (A)'da gösterilen aynı konturlar, (C)'de gösterilen iki foton oturumu verileriyle eşleşecek şekilde çarpıtılmıştır. (C) Hizalamadan sonra (A)'da gösterilen ROI'lerin uzamsal filtreleri (beyaz) ve aynı gün içinde iki fotonlu kafaya sabitlenmiş bir kayıt oturumundan (yeşil) 2P işleme yazılımı kullanılarak tanımlanan ROI'ler, iki fotonlu oturumdan maksimum projeksiyon görüntüsünün üzerine bindirilir. Çakışan ROI'ler kayıtlı olarak kabul edilir ve daha fazla analiz için seçilir (Ölçek çubukları 0,5 mm'yi temsil eder). (D) Bir foton (sol) ve iki foton (sağ) kayıt oturumlarında kayıtlı ROI'lerin Z puanlı kalsiyum aktiviteleri (yatay ölçek çubuğu 10 s ve dikey ölçek çubuğu 10 sd'dir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, aynı nöral popülasyonlarda kafaya sabitlenmiş ve serbestçe hareket eden koşullarda nöronları gözlemleme ve doğrudan karşılaştırma yeteneğini gösterdik. Uygulamayı görsel kortekste göstermiş olsak da, bu protokol hem kortikal alanlar hem de derin çekirdekler 24,25,26,27,28 ve diğer veri toplama ve davranışsal kurulumlar 29,30 olmak üzere çok sayıda başka beyin alanına uyarlanabilir.

Optimum veri toplamaya izin verdikleri için bu protokoldeki kritik adımları not etmek önemlidir. İlk olarak, z-yığınları gerçekleştirirken, baştan sona tutarlı parlaklığı korumak çok önemlidir. Daha önce açıklandığı gibi, ışık ne kadar çok dokuya nüfuz ederse o kadar çok dağılır; böylece lazer, kazancı artırarak dokuya daha fazla nüfuz edebilecek ve yatırım getirilerimizi heyecanlandırabilecek daha fazla güce sahip olur. Bununla birlikte, derin dokudaki ROI'leri uyarmak için gereken kazançta z-yığınının başlatılması tavsiye edilmez, çünkü bu, floresan yapıların aşırı maruz kalmasına ve fototoksisiteye neden olur ve korteks yüzeyindeki dokuyu ağartabilir. Bu nedenle, Göreli üstel gradyan seçeneğinin seçilmesi, yazılımın z-yığınının her adımında optimum olabilmek için gereken sabit bir güç gradyanını hesaplamasına olanak tanır. İkinci olarak, hücre setlerinin zaman içinde tutarlı bir şekilde kaydedilmesine yardımcı olacak bir sonraki kritik adım, ilk tek fotonlu görüntüleme oturumunda çekilen filmin ortalama görüntüsünün kaydedilmesini sağlamaktır. Bu, kullanıcının hücre kümelerinde ve veri toplamada sürekliliği sağlamak için sonraki görüntüleme oturumlarını orijinal görüntüyle karşılaştırmasına olanak tanır.

Hafif minyatür iki fotonlu mikroskopların bağımsız olarak tasarlandığınıbelirtmekte fayda var 31,32, bu da serbestçe davranan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin verir. Yüksek çözünürlüklü in vivo görüntüleme için heyecan verici bir gelişmeyi vurgularken, kısıtlı görüş alanı (FOV) ve son derece özel tasarım, genel son kullanıcılar için onu zorlaştırıyor. Tanımladığımız yöntem, ticari tedarikçilerden kolayca temin edilebilen birkaç köklü platformu entegre ederek onu erişilebilir bir seçim haline getirir. Teorik olarak, açık kaynaklı bir miniskop ve genel bir iki foton mikroskobu33,34 ile uyumlu, özelleştirilmiş, kendi kendine monte edilmiş bir mikroprizma ile de değiştirilebilir.

Bununla birlikte, bu protokol, doğru mikroprizma implantasyonu gibi zorluklarla karşı karşıyadır, çünkü hatalar uygun olmayan FOV'lara ve sonuç olarak verilerin tehlikeye atılmasına neden olabilir. Farklı modalitelerde tutarlı FOV'ları korumak, görüntüleme elde etmek için kullanılan farklı hedefler nedeniyle de zordur. Bununla birlikte, mikroprizmanın XY eksenleri sabit kaldığından, FOV'daki varyasyon Z ekseni boyuncadır; bu nedenle, FOV'ları senkronize etmek için her iki görüntüleme modunda (kan damarları, kortikal dokudaki artefaktlar ve özdeş nöronlar gibi) bulunan spesifik yer işaretleri kullanılır. Ayrıca, aynı nöronları farklı modaliteler altında hizalamak ve tanımlamak için kayıt uygulamak çok önemlidir. Dikkat edilmesi gereken bir diğer zorluk, her iki modalitede de edinim sırasında GCaMP dokusunun foto ağartılmasını en aza indirmektir. Bu nedenle, kayıt için harcanan süreyi azaltmak, sinyal-gürültü oranını optimize etmek (LED/lazer gücü yerine kazancı artırarak) ve görüntüleme seansları arasında 24-48 saat beklemek önemlidir.

Bu doğal karmaşıklıklara rağmen, protokolümüz, cerrahi hassasiyet ve uygun görüntü işleme teknikleriyle yürütüldüğünde, nöral aktiviteleri karşılaştırmak için sağlam bir platform sağlar. Sıkı bir şekilde kontrol edilen görevlerde kafaya sabitlenmiş durumlar ile daha doğal davranışları taklit eden serbestçe hareket eden durumlar arasında karşılaştırma yapılmasını sağlar, böylece sinirbilim alanındaki potansiyel uygulamaları genişletir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip finansal çıkar veya çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bayan Charu Reddy ve Profesör Matteo Carandini'ye (Cortex Lab) cerrahi protokol ve transgenik fare suşunun paylaşılması konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Dr Norbert Hogrefe'ye (Inscopix) ameliyatın geliştirilmesindeki rehberliği ve yardımı için teşekkür ederiz. Cerrahi kurulum ve veri işleme konusundaki yardımları için Bayan Andreea Aldea'ya (Sun Lab) teşekkür ederiz. Bu çalışma Moorfields Eye Charity tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnfüzyon için% 0.9 Sodyum Klorür çözeltisi (Vetivex 11) 250mlDechra20091607Hidrasyon ve ilaç yeniden yapılandırması için tuzlu
18004-1 Trephine 1.8mm çaplı frezFST18004-18Matkap ucu
1ml şırıngaTerumoMDSS01SE1ml şırınga
23G x 5/8 inç %6 LUER iğnesiTerumoNN-2316R23G iğne
71000 Dahili yazılımlı otomatik stereotaksik cihazRWD-RWD
Emilebilir Hemostatik Jelatin Sünger (10x10x10mm)SurgisponSSP-101010jel-köpük
Alkol pedleri %70 izopropil alkolBraun9160612Alkol pedleri
Alüminyum folyoAmeliyat sırasında gözleri kapatmak içinherhangi birperakendeci-Folyo
Eklemli Beyin Omurilik Sıvısı Tocris Bioscience a Bio-Techne Marka3525/25MLACSF
Otomatik mikroenjeksiyon pompasıWPI8091
Betadine çözeltisi (%10 iyotlu Povidon) 500mlVidene/Ecolab3030440Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (özelleştirilmiş)Bruker-İkifoton görüntüleme sistemi 
Cardiff AldasorberVet-TechAN006Anestezi emici
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XCNikonMRH4823020x objektif lens
Kompakt Anestezi sistemi - tek gaz - izofluran K/F, oksijen konsantratörlü Model: ZY-5AC ve süpürücü ünitesiVet-TechAN001Kompakt anestezi sistemi 
Contec Prochlor Aston PharmaAP2111L1Dezenfektan (hipokloröz asit)
Deksametazon Sodyum Fosfat Enjeksiyonu, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25HikmaCovetrus:70789Deksametazon
Diseksiyon Bıçağı, kesme kenarı 4 mm, kalınlık 0,5 mm, paslanmaz çelikGüzel Bilim Araçları10055-12Korteks kesisi için bıçak
Çift Taraflı, Delinmeyen Fare & Yenidoğan Sıçan Kulak ÇubuklarıÇalmak51649Kulak çubuğu
Kukla mikroskopInscopixKukla mikroskopİmplantasyona yardımcı olmak için
Etanol (% 100) VWR40-1712-25%70 etanol yapmak için kullanılır;
Balıkçı markası  Nitril İndigo Tek Kullanımlık Eldivenler KKD Cat IIIFischerScientific17182182Eldivenler
Homeotermik Monitör 50-7222-FHarvard Aparatı50-7222-FHomeotermik izleme sistemi/ısıtma yastığı
Görüntü işleme yazılımıImageJ-Görüntüişleme yazılımı
Inscopix Veri İşleme Yazılımı (IDPS)kalsiyum görüntüleme işleme yazılımı
Insight Duals-232, S/N 2043InSightInsight Spectra X3İki fotonlu görüntüleme lazeri
IsoFlo 250ml %100 inhalasyon ileZoetisWM 42058/4195İzofluran
Kwik-Sil Düşük Toksisiteli Silikon Yapıştırıcı DünyasıHassas Müdahaleler (WPI)KWIK-SILSilikon yapıştırıcı
MICROMOT şebeke adaptörü NG 2/S, Matkap ünitesi 60/EPROXXONileNO 28 515El tipi matkap
nVoke Entegre Görüntüleme ve Optogenetik Sistem paketiInscopix-One-photonGörüntüleme sistemi ve yazılımı
ProView İmplant KitiInscopixProView İmplant KitiKukla mikroskop, stereotaksik kol ve ataşmanı 
ProView Prizma ProbuInscopix1050-002203Mikroprizma lens
Rimadil (50mg/ml)ZoetisVM 42058/4123Carprofen 
Masa kelepçeli mafsallı kol üzerinde Stereotaksi MikroskobuWPIPZMTIII-AAC mikroskop
Süper Bağ Üniversal kit, SUN MedicalPrestige-DentalK058EYapıştırıcı çimento
İki fotonlu kalsiyum görüntü yazılımıSuite2P-İkifotonlu kalsiyum görüntüleme işleme yazılımı
VapouriserVet-Tech-Isofluranvapouriser
Xailin Kayganlaştırıcı Göz Merhemi 5gXailin-NightMLG/28/1551Oftalmik merhem 
su Inscopix-One-fotonlu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  3. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  4. Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
  7. Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3(2010).
  8. Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472(2016).
  9. Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970(2020).
  10. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  11. Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
  12. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  13. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  14. Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
  15. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
  16. Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
  17. Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
  18. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579(2017).
  19. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  20. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678(2014).
  21. Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
  22. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  23. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728(2018).
  24. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  25. Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
  26. Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
  27. Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
  28. Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
  29. Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
  30. Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
  31. Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
  32. Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
  33. Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894(2021).
  34. Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Neural Population ImagingMicroprism ImagingFreely Moving AnimalsHead Fixed AnimalsTwo Photon ImagingOne Photon ImagingVisual CortexCortical Layer ImagingSensory ProcessingChronic Neural Recording

İlgili makaleler