Yöntem makalesi

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi

DOI:

10.3791/65422

⸱

12 Mayıs 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) tarafından indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), inaktive Mycobacterium tuberculosis içeren tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilmiş bir MOG peptid ile bağışıklamayı gerektirir. Mikobakterinin antijenik bileşenleri, T hücrelerini ücretli benzeri reseptörler yoluyla Th1 yanıtını teşvik eden sitokinler üretmeye teşvik etmek için uyarmak için dendritik hücreleri aktive eder. Bu nedenle, antijenik mücadele sırasında mevcut olan mikobakterilerin miktarı ve türleri, EAE'nin gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Bu yöntem makalesi, C57BL/6 farelerde EAE'yi, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis suşu K-10'u içeren modifiye edilmiş tamamlanmamış bir Freund adjuvanını kullanarak indüklemek için alternatif bir protokol sunmaktadır.

Mycobacterium avium kompleksinin bir üyesi olan M. paratuberculosis, ruminantlarda Johne hastalığının etken maddesidir ve multipl skleroz da dahil olmak üzere çeşitli insan T hücresi aracılı bozukluklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, Mycobacterium paratuberculosis ile aşılanan fareler, aynı dozlarda 4 mg / mL'lik M. tuberculosis H37Ra suşunu içeren CFA ile aşılanmış farelerden daha erken başlangıçlı ve daha büyük hastalık şiddeti göstermiştir. Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP) suşu K-10'un antijenik belirleyicileri, efektör faz sırasında, anlamlı derecede daha yüksek sayıda T-lenfosit (CD4 + CD27 +), dendritik hücreler (CD11c + I-A / I-E +) ve monositler (CD11b + CD115 + ile karakterize edilen) güçlü bir Th1 hücresel yanıtını indükleyebilmiştir) dalakta CFA ile aşılanmış farelere kıyasla. Ayrıca, MOG peptidine proliferatif T hücresi yanıtı, M. paratuberculosis ile bağışıklanmış farelerde en yüksek olduğu görülmüştür. Formülasyonda M. paratuberculosis içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş bir ensefalitojenin (örneğin, MOG35-55) kullanılması, EAE'nin indüksiyon fazı sırasında miyelin epitopuna özgü CD4 + T hücrelerini hazırlamak için dendritik hücreleri aktive etmek için alternatif ve doğrulanmış bir yöntem olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan bozukluklarının incelenmesi için yaygın bir modeldir1. EAE'nin birkaç modeli vardır: güçlü adjuvanlarla kombinasyon halinde farklı miyelin peptitleri kullanılarak aktif immünizasyon, miyeline özgü CD4 + lenfositlerin in vitro transferi ile pasif immünizasyon ve spontan EAE2'nin transgenik modelleri. Bu modellerin her biri, EAE'nin başlangıç, efektör fazı veya kronik faz gibi farklı yönlerinin incelenmesine izin veren belirli özelliklere sahiptir. EAE'nin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) modeli, mononükleer inflamatuar infiltrasyon, periferik beyaz cevherde demiyelinizasyon vehastalık zirvesinden sonra iyileşmenin azalması ile karakterize olduğu için kronik nöroinflamasyon ve demiyelinasyonun immün aracılı mekanizmalarını incelemek için iyi bir modeldir.

MOG-EAE, duyarlı farelerin tam Freund adjuvanında (CFA) MOG35-55 peptidi ile bağışıklanması ve ardından boğmaca toksininin intraperitoneal enjeksiyonu ile indüklenir. Bu, kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini arttırır ve çevrede aktive olan miyeline özgü T hücrelerinin, yeniden aktive edilecekleri merkezi sinir sistemine (CNS) ulaşmasını sağlar3. CFA, antijen sunan hücreler tarafından antijen alımını ve humoral ve hücre aracılı yanıtlarla ilişkili sitokinlerin ekspresyonunu artırarak EAE'nin indüksiyonunda anahtar rol oynar4. Bu mekanizma esas olarak, bileşenleri bağışıklık sistemi için güçlü bir uyaran sağlayan yağda emülsifiye edilmiş öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis'in varlığından kaynaklanmaktadır5. Aslında, EAE'nin indüksiyonu, antijenik meydan okuma6 sırasında mevcut olan mikobakteri miktarı ile doğrudan ilişkilidir.

Freund'un tamamlanmamış adjuvan7'sine Mycobacterium butyricum gibi diğer öldürülmüş mikobakterilerin eklenmesi ve adjuvan kombinasyonlarınınetkisi 8, EAE'nin klinik seyrini modüle edebilir ve sonuç olarak sonuçların tekrarlanabilirliğini etkileyebilir. Ruminantlarda Johne hastalığının etiyolojik ajanı olan Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP), antijenik bileşenleri multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu 9 olan hastalarda güçlü bir humoral ve hücre aracılı yanıt ortaya çıkarabildiğinden, insan CNS9'un enflamatuar bozuklukları ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolde, CFA'daki M. tuberculosis'i M. paratuberculosis ile değiştirerek MOG-EAE'yi indüklemek için alternatif ve tekrarlanabilir bir yöntem göstermekteyiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fare deneyleri, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Onay Numarası 290238) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Deneyleri Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Deney hakkında genel yorumlar

  1. Fareleri, hayvan tesisindeki bireysel kafeslerde, 23 ° C ± 2 ° C'de% 50 ve% 10 nem ile% 50 ± 2 ° C'de kontrollü, patojen içermeyen koşullar altında ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın.
  2. Farelere antijen ve CFA içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin ve bunları sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak kullanın.

2. Mikobakteriyel antijenlerin hazırlanması

  1. M. paratuberculosis K-10 suşunu, 37 ° C'de T25 doku kültürü şişelerinde 2 hafta boyunca% 10 OADC (oleik asit, albümin, dekstroz, katalaz)% 0.005 Tween 80 ve 2 mg / L mikobaktin J ile zenginleştirilmiş Middlebrook sıvı ortamı 7H9'da büyütün. Koloni büyümesini görsel inceleme ile düzenli olarak değerlendirin.
    DİKKAT: M. paratuberculosis'i bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) tesisinde kullanın.
  2. Zenginleştirme kültürünü, 500 mL Erlenmeyer şişesini, 1.7 × 105 koloni oluşturan birim (CFU) / mL'lik bir süspansiyonla, 200 mL'lik son hacimde (adım 2.1 ile aynı ortamda) 1 hafta boyunca çalkalayan bir inkübatörde büyütün.
    NOT: Kirletici organizmalar sonuçları etkileyebileceğinden, koloni morfolojisini belirlemek ve M. paratuberculosis için geleneksel polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tespit kitleri ile saflığı doğrulamak için bakteriler Middlebrook 7H10 katı ortamına aşılanmalıdır.
  3. Bakteriyel süspansiyonları 70 ° C'de 5-10 dakika boyunca etkisiz hale getirin ve 10 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj yapın. Tartılan pelet PBS'de iki kez yıkanır, sonikasyonla bozulur ve -20 ° C'de saklanır.
  4. Pelet steril bir kaba aktarın ve kuru buz veya sıvı azotla dondurun. Hemen bir dondurarak kurutma odasına aktarın.
  5. Dondurarak kurutma (vakum altında -50 °C'de 4 saat) M. paratuberculosis , makine kılavuzuna göre.
  6. Liyofilizasyonun sonunda, paslanmaz çelik kabı dondurarak kurutucudan çıkarın ve bir biyo-temizleme tezgahına aktarın. Paslanmaz çelik kabın iç duvarına yapışan kurutulmuş MAP topaklarını yerinden çıkarmak ve mümkün olduğunca ince bir şekilde toz haline getirmek için paslanmaz çelik bir spatula kullanın.
  7. Toz haline getirilmiş hücreleri elektronik bir terazi kullanarak tartın ve manuel olarak 10 mg/mL konsantrasyonda aseptik 10 mL'lik bir şişeye yerleştirin.
    NOT: Hücre yoğunluğu, numunenin litresi başına kuru ağırlık gramı olarak ölçülmüştür. 3 hafta sonra, 1 mg (ıslak ağırlık) bakteri hücresi peleti yaklaşık 2.5 × 108 CFU içerir.

3. MOG 35-55 emülsiyonunun hazırlanması

  1. Bir şişe kurutulmuş M. paratuberculosis'in (10 mg) içeriğini bir harç ve havaneli ince bir toza öğütün ve 10 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için eksik Freund'un adjuvanına 10 mL ekleyin. -4 °C'de saklayın.
  2. Bağışıklamadan önce, stok çözeltisini 4 mg / mL'lik bir son konsantrasyona seyreltin.
  3. Peptid MOG35-55'i ddH2O içinde 2 mg / mL'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin ve -20 ° C'de saklayın.
  4. Bir homojenizatör kullanarak, MOG35-55 çözeltisini (2 mg/mL), adım 3.2'den itibaren 5 mL'lik bir tüpte kalın bir emülsiyon oluşana kadar eşit hacimde adjuvan (4 mg/mL) ile karıştırın. Her 10 sn karıştırmadan sonra, çözeltiyi 20 s boyunca buz üzerine yerleştirin ve tüm çözeltiyi geri kazanmak için tüpü döndürün.
  5. Emülsiyonu 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın, tüm havayı çıkarın ve 27 G'lik bir iğne ekleyin. Emülsiyon artık enjeksiyon için hazırdır.
    NOT. MOG35-55'in viskoz emülsiyonunun bir miktar kaybı hazırlık sırasında meydana geldiğinden, ihtiyaç duyulan miktarın 1.5 katını hazırlamak en iyisidir.

4. Hayvan bağışıklaması

  1. Hayvanlar üzerindeki stresi en aza indirmek için izofluran soluyarak hayvanları uyuşturun.
  2. Emülsiyonu (200 μg / MOG35-55 fare içeren 200 μL) deri altından alt sırta enjekte edin.
  3. Bağışıklamadan sonraki 0. ve 2. günlerde intraperitoneal olarak boğmaca toksini (200 ng / fare içeren 100 μL) uygulayın.
    DİKKAT: Boğmaca toksini bağışıklık sistemi üzerinde çoklu baskılayıcı etkiye sahiptir; Yutulmaktan ve gözlerle ve ciltle temastan kaçının.

5. Klinik değerlendirme

  1. Fareleri kilo ve klinik belirtiler için günlük olarak izleyin. Aşağıdaki puanlama sistemini kullanın: 0 = klinik belirti yok; 1 = sarkık kuyruk; 2 = sağ refleksin bozulması ve arka bacakların zayıflığı; 3 = arka bacakların tam felci; 4 = ön ayakların kısmi felci ile arka bacakların tam felci; 5 = can çekişiyor.
    NOT: Klinik bulguların ilk gözlemi üzerine, hayvanlara suya ve yiyeceğe daha fazla erişim sağlanır. Kemirgen chow yumuşatılır ve nemlendirilir, daha sonra yiyecek haznesinden kafes zeminine yerleştirilir. Susuz kalan hayvanlar söz konusu olduğunda, deri altı sıvı takviyesi uygulanır veya oral gavaj yoluyla bir kemirgen chow bulamacı verilir. Bir fare 3 günden fazla bir süre boyunca bu tür bir yardıma ihtiyaç duyarsa, ötenazi yapılacaktır.
  2. Hayvan ağrısını ve sıkıntısını önlemek veya en aza indirmek için aşağıdaki insan uç noktalarını kullanın: vücut ağırlığı kaybı% 20'den fazla, klinik skor ≥ 4.0, skor 3'te doğru refleksin yokluğu ve hayvan 24 saat boyunca yem veya suya erişemediğinde.
    NOT: Fareler, EAE indüksiyonundan sonraki 30. günde intraperitoneal pentobarbital (≥150 mg / kg) enjeksiyonları ile ötenazi yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL/6 fare grupları (toplam n = 15/grup), M. paratuberculosis içeren bir emülsiyonda MOG35-55 ile veya CFA ile ortak yöntemle aşılandı. Tüm fare grupları, 14-17 günde gözlenen tek bir sakatlık zirvesi ile karakterize akut monofazik bir hastalık gösterdi ve bunu takip eden 10 gün içinde semptomların kısmi iyileşmesi izledi (Şekil 1A). M. paratuberculosis içeren adjuvan ile aşılanan fareler, cinsiyetten bağımsız olarak, bağışıklam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. paratuberculosis10 içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş MOG35-55 peptidi kullanarak C57BL / 6J farelerde şiddetli EAE'yi aktif olarak indüklemek için sağlam bir alternatif protokol gösterdik. EAE'nin bu yöntemle indüklenmesi, CFA ile ortak protokolün neden olduğundan daha ciddi bir hastalığa neden oldu. Bu fark, mikobakterilerin hücre duvarındaki farklı lipid bileşenlerinden kaynaklanıyor olabilir11. Aslında, diğer mikobakterilerin aksine, M. p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Japon Bilimin Teşviki Derneği'nden bir hibeden destek aldı (hibe no. JP 23K14675).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti-fare CD115 antikoruBiolegend, ABDsitoflorimetri için 135505 1: 1.000
anti-fare CD11b antikoruBiolegend, ABDSitoflorimetri için 101215 1: 1.000
anti-fare CD11c antikoruBiolegend, ABDSitoflorimetri için 117313 1: 1.000
anti-fare CD16 / 32 & nbsp; antikorBiolegend, ABD101302 sitoflorimetri 1: 1.000
anti-fare CD4 ve nbsp; antikorBiolegend, ABDsitoflorimetri için 116004 1: 1.000
anti-fare CD8a ve nbsp; antikorBiolegend, ABDSitoflorimetri için 100753 1: 1.000
anti-fare I-A/I-E antikoruBiolegend, ABDSitoflorimetri için 107635 1: 1.000
anti-fare Ly-6C ve nbsp; antikorBiolegend, ABDSitoflorimetri için 128023 1:1.000
BBL Middlebrook OADC ZenginleştirmeThermo Fisher Scientific, ABDMikobakterilerin izolasyonu ve yetiştirilmesi içinBD
211886 C57BL/6J farelerCharles River Laboratuvarı, Japonya3 haftalık, erkek ve dişi
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, ABD42F9155Khücre kültürü için, 37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce
Dondurarak Kurutma makinesiEyela, Tokyo, JaponyaFDU-1200bakteri liyofilizasyonu
için eksik e Freund' s adjuvanDifco Laboratories, MD, USA263810adjuvan
Middlebrook 7H9 BrothDifco Laboratories, MD, USA90003-876Mycobacteria'nın büyümesine yardımcı olur
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, ABDBAA-968sığır kökenli
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra'dan elde edilen bakteriler, DesiccatedBD Biosciences, ABD743-26880-EAadjuvan
Mikobaktin JMüttefik Laboratuvarı, MO, ABDbüyüme destekleyicisi
Miyelin Oligodendrosit Glikolipid (MOG) 35-55AnaSpec, ABDAS-60130-10ensefalotijenik peptit
Ovalbumin (257-264)Sigma-Aldrich, ABDS7951-1MGnegatif kontrol antijeni ve nbsp; proliferatif tahlil için
boğmaca toksin çözeltisiFujifilm Wako, Osaka Japonya168-22471Gram negatif bakterilerden Bordetella pertussi, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırır
Polytron homojenizatör PT 3100Antijeni adjuvan RPMIKinematica
Gibco Life Techologies, ABD11875093Hücre kültürü için
Timidin, [Metil-3< / sup>H], %2 etanol, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, ABDNET027W001MCproliferasyon testi için, kullanım (1 & mu; Ci/kuyu)
Zombi NIR Tamir Edilebilir Canlılık KitiBiolegend, ABD423105  hücre canlılığı için sitoflorimetri
1640 ile L-glutamin ile karıştırmak için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
  5. Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
  6. Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
  7. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
  8. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
  9. Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
  10. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
  11. Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
  12. Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
  13. Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
  14. Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

MOG PeptitTamamlanmam Freund AdjuvanDendritik H cre AktivasyonuTh1 Yan tT Lenfosit ProliferasyonuN roenflamasyon ModeliSitokin retimi

İlgili makaleler