Burada, C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti aktif olarak indüklemek için alternatif bir protokol sunuyoruz, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türü paratüberkülozu içeren tamamlanmamış Freund adjuvanında asılı duran immünojenik epitop miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG)35-55'i kullanıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Otoantijenlerin İmmünojenitesinin Arttırılmasında Mycobacterium Paratuberculosis'in Adjuvan Aktivitesi
Bu makalede
Özet
Özet
Miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) tarafından indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), inaktive Mycobacterium tuberculosis içeren tam Freund adjuvanında (CFA) emülsifiye edilmiş bir MOG peptid ile bağışıklamayı gerektirir. Mikobakterinin antijenik bileşenleri, T hücrelerini ücretli benzeri reseptörler yoluyla Th1 yanıtını teşvik eden sitokinler üretmeye teşvik etmek için uyarmak için dendritik hücreleri aktive eder. Bu nedenle, antijenik mücadele sırasında mevcut olan mikobakterilerin miktarı ve türleri, EAE'nin gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Bu yöntem makalesi, C57BL/6 farelerde EAE'yi, ısıyla öldürülen Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis suşu K-10'u içeren modifiye edilmiş tamamlanmamış bir Freund adjuvanını kullanarak indüklemek için alternatif bir protokol sunmaktadır.
Mycobacterium avium kompleksinin bir üyesi olan M. paratuberculosis, ruminantlarda Johne hastalığının etken maddesidir ve multipl skleroz da dahil olmak üzere çeşitli insan T hücresi aracılı bozukluklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, Mycobacterium paratuberculosis ile aşılanan fareler, aynı dozlarda 4 mg / mL'lik M. tuberculosis H37Ra suşunu içeren CFA ile aşılanmış farelerden daha erken başlangıçlı ve daha büyük hastalık şiddeti göstermiştir. Mycobacterium avium alt türleri paratuberculosis (MAP) suşu K-10'un antijenik belirleyicileri, efektör faz sırasında, anlamlı derecede daha yüksek sayıda T-lenfosit (CD4 + CD27 +), dendritik hücreler (CD11c + I-A / I-E +) ve monositler (CD11b + CD115 + ile karakterize edilen) güçlü bir Th1 hücresel yanıtını indükleyebilmiştir) dalakta CFA ile aşılanmış farelere kıyasla. Ayrıca, MOG peptidine proliferatif T hücresi yanıtı, M. paratuberculosis ile bağışıklanmış farelerde en yüksek olduğu görülmüştür. Formülasyonda M. paratuberculosis içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş bir ensefalitojenin (örneğin, MOG35-55) kullanılması, EAE'nin indüksiyon fazı sırasında miyelin epitopuna özgü CD4 + T hücrelerini hazırlamak için dendritik hücreleri aktive etmek için alternatif ve doğrulanmış bir yöntem olabilir.
Giriş
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan demiyelinizan bozukluklarının incelenmesi için yaygın bir modeldir1. EAE'nin birkaç modeli vardır: güçlü adjuvanlarla kombinasyon halinde farklı miyelin peptitleri kullanılarak aktif immünizasyon, miyeline özgü CD4 + lenfositlerin in vitro transferi ile pasif immünizasyon ve spontan EAE2'nin transgenik modelleri. Bu modellerin her biri, EAE'nin başlangıç, efektör fazı veya kronik faz gibi farklı yönlerinin incelenmesine izin veren belirli özelliklere sahiptir. EAE'nin miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) modeli, mononükleer inflamatuar infiltrasyon, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fare deneyleri, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Onay Numarası 290238) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Deneyleri Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Deney hakkında genel yorumlar
- Fareleri, hayvan tesisindeki bireysel kafeslerde, 23 ° C ± 2 ° C'de% 50 ve% 10 nem ile% 50 ± 2 ° C'de kontrollü, patojen içermeyen koşullar altında ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın.
- Farelere antijen ve CFA içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin ve bunları....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
C57BL/6 fare grupları (toplam n = 15/grup), M. paratuberculosis içeren bir emülsiyonda MOG35-55 ile veya CFA ile ortak yöntemle aşılandı. Tüm fare grupları, 14-17 günde gözlenen tek bir sakatlık zirvesi ile karakterize akut monofazik bir hastalık gösterdi ve bunu takip eden 10 gün içinde semptomların kısmi iyileşmesi izledi (Şekil 1A). M. paratuberculosis içeren adjuvan ile aşılanan fareler, cinsiyetten bağımsız olarak, bağışıklam.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
M. paratuberculosis10 içeren bir adjuvanda emülsifiye edilmiş MOG35-55 peptidi kullanarak C57BL / 6J farelerde şiddetli EAE'yi aktif olarak indüklemek için sağlam bir alternatif protokol gösterdik. EAE'nin bu yöntemle indüklenmesi, CFA ile ortak protokolün neden olduğundan daha ciddi bir hastalığa neden oldu. Bu fark, mikobakterilerin hücre duvarındaki farklı lipid bileşenlerinden kaynaklanıyor olabilir11. Aslında, diğer mikobakterilerin aksine, M. p.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Japon Bilimin Teşviki Derneği'nden bir hibeden destek aldı (hibe no. JP 23K14675).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| anti-fare CD115 antikoru | Biolegend, ABD | sitoflorimetri için 135505 1: 1.000 | |
| anti-fare CD11b antikoru | Biolegend, ABD | Sitoflorimetri için 101215 1: 1.000 | |
| anti-fare CD11c antikoru | Biolegend, ABD | Sitoflorimetri için 117313 1: 1.000 | |
| anti-fare CD16 / 32 & nbsp; antikor | Biolegend, ABD | 101302 | sitoflorimetri 1: 1.000 |
| anti-fare CD4 ve nbsp; antikor | Biolegend, ABD | sitoflorimetri için 116004 1: 1.000 | |
| anti-fare CD8a ve nbsp; antikor | Biolegend, ABD | Sitoflorimetri için 100753 1: 1.000 | |
| anti-fare I-A/I-E antikoru | Biolegend, ABD | Sitoflorimetri için 107635 1: 1.000 | |
| anti-fare Ly-6C ve nbsp; antikor | Biolegend, ABD | Sitoflorimetri için 128023 1:1.000 | |
| BBL Middlebrook OADC Zenginleştirme | Thermo Fisher Scientific, ABD | Mikobakterilerin izolasyonu ve yetiştirilmesi için | BD |
| 211886 C57BL/6J fareler | Charles River Laboratuvarı, Japonya | 3 haftalık, erkek ve dişi | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, ABD | 42F9155K | hücre kültürü için, 37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce |
| Dondurarak Kurutma makinesi | Eyela, Tokyo, Japonya | FDU-1200 | bakteri liyofilizasyonu |
| için eksik e Freund' s adjuvan | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | adjuvan |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | Mycobacteria'nın büyümesine yardımcı olur |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, ABD | BAA-968 | sığır kökenli |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra'dan elde edilen bakteriler, Desiccated | BD Biosciences, ABD | 743-26880-EA | adjuvan |
| Mikobaktin J | Müttefik Laboratuvarı, MO, ABD | büyüme destekleyicisi | |
| Miyelin Oligodendrosit Glikolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, ABD | AS-60130-10 | ensefalotijenik peptit |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, ABD | S7951-1MG | negatif kontrol antijeni ve nbsp; proliferatif tahlil için |
| boğmaca toksin çözeltisi | Fujifilm Wako, Osaka Japonya | 168-22471 | Gram negatif bakterilerden Bordetella pertussi, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırır |
| Polytron homojenizatör PT 3100 | Antijeni adjuvan RPMI | Kinematica | |
| Gibco Life Techologies, ABD | 11875093 | Hücre kültürü için | |
| Timidin, [Metil-3< / sup>H], %2 etanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, ABD | NET027W001MC | proliferasyon testi için, kullanım (1 & mu; Ci/kuyu) |
| Zombi NIR Tamir Edilebilir Canlılık Kiti | Biolegend, ABD | 423105 | hücre canlılığı için sitoflorimetri |
Kaynaklar
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
