Yöntem makalesi

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 Haziran 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunur ve enerji üretiminin çok ötesine geçen temel işlevleri yerine getirir, örneğin demir-kükürt kümelerinin, lipitlerin veya proteinlerin sentezi,Ca2+ tamponlama ve apoptozun indüksiyonu. Benzer şekilde, mitokondriyal disfonksiyon kanser, diyabet ve nörodejenerasyon gibi ciddi insan hastalıklarına neden olur. Bu işlevleri yerine getirmek için mitokondri, iki zardan oluşan zarfları boyunca hücrenin geri kalanıyla iletişim kurmak zorundadır. Bu nedenle, bu iki zar sürekli etkileşim halinde olmak zorundadır. Mitokondriyal iç ve dış zarlar arasındaki proteinli temas bölgeleri bu açıdan gereklidir. Şimdiye kadar, birkaç temas yeri tespit edildi. Burada açıklanan yöntemde, Saccharomyces cerevisiae mitokondri, temas bölgelerini izole etmek ve böylece temas bölgesi proteinleri için uygun adayları belirlemek için kullanılır. Bu yöntemi, mayadan insanlara kadar korunan mitokondriyal iç zardaki ana temas bölgesi oluşturan komplekslerden biri olan mitokondriyal temas bölgesini ve cristae organizasyon sistemi (MICOS) kompleksini tanımlamak için kullandık. Son zamanlarda, Cqd1 ve Por1-Om14 kompleksinden oluşan yeni bir temas bölgesini tanımlamak için bu yöntemi daha da geliştirdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, ökaryotlarda çeşitli farklı işlevleri yerine getirir, en bilineni oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir. Diğer işlevler arasında demir-kükürt kümelerinin üretimi, lipid sentezi ve daha yüksek ökaryotlardaCa2+ sinyali ve apoptoz 1,2,3,4'ün indüksiyonu yer alır. Bu işlevler, karmaşık üst yapılarıyla ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır.

Mitokondriyal üst yapı ilk olarak elektron mikroskobu5 ile tanımlanmıştır. Mitokondrinin iki zardan oluşan oldukça karmaşık organeller olduğu gösterilmiştir: mitokondriyal dış zar ve mitokondriyal iç zar. Böylece, bu membranlar tarafından iki sulu bölme oluşturulur: zarlar arası boşluk ve matris. Mitokondriyal iç zar daha da farklı bölümlere ayrılabilir. İç sınır zarı, dış zara yakın durur ve cristae istilalar oluşturur. Crista bağlantıları, iç sınır zarını ve cristae'yi birbirine bağlar (Şekil 1). Ayrıca, ozmotik olarak küçülmüş mitokondrinin elektron mikrografları, mitokondriyal zarların sıkıca bağlandığı bölgelerin var olduğunu ortaya koymaktadır 6,7. Bu sözde temas bölgeleri, iki zarı kapsayan protein kompleksleri tarafından oluşturulur (Şekil 1). Bu etkileşim bölgelerinin, mitokondriyal dinamiklerin ve kalıtımın düzenlenmesinin yanı sıra sitozol ve matris8 arasındaki metabolitlerin ve sinyallerin transferi için önemleri nedeniyle hücre canlılığı için gerekli olduğu düşünülmektedir.

Mitokondriyal iç zardaki MICOS kompleksi, muhtemelen en iyi karakterize edilen ve en çok yönlü temas bölgesi oluşturan komplekstir. MICOS 2011 yılında mayada tanımlanmıştır ve altı alt birimdenoluşur 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 ve Mic10. Bunlar, 9,10,11 crista kavşaklarına lokalize olan yaklaşık 1.5 MDa'lık bir kompleks oluşturur. Çekirdek alt birimin, Mic10 veya Mic60'ın silinmesi, bu karmaşık 9,11'in yokluğuna yol açar, yani bu iki alt birim MICOS'un kararlılığı için gereklidir. İlginç bir şekilde, MICOS çeşitli mitokondriyal dış zar proteinleri ve kompleksleri ile sadece bir değil, birden fazla temas bölgesi oluşturur: TOM kompleksi 11,12, TOB / SAM kompleksi 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 kompleksi9, Por1 10, OM45 10 ve Miro 17. Bu, MICOS kompleksinin protein ithalatı, fosfolipid metabolizması ve mitokondriyal ultrayapının18 oluşumu gibi çeşitli mitokondriyal süreçlerde yer aldığını güçlü bir şekilde gösterir. MIC10 veya MIC60'ın silinmesiyle indüklenen MICOS kompleksinin yokluğu, neredeyse tamamen düzenli kristadan yoksun anormal bir mitokondriyal üst yapıya yol açtığından, ikinci işlev muhtemelen MICOS'un ana işlevidir. Bunun yerine, iç sınır zarına bağlantısı olmayan iç zar vezikülleri19, 20 biriktirir. Daha da önemlisi, MICOS mayadan insana kadar form ve işlev bakımından korunur21. MICOS alt birimlerindeki mutasyonların ciddi insan hastalıkları ile ilişkisi, daha yüksek ökaryotlar için önemini de vurgulamaktadır22,23. MICOS çok yönlü olmasına rağmen, ek temas siteleri mevcut olmalıdır (yayınlanmamış gözlemlerimize dayanarak). Gerçekten de, mitokondriyal spesifik fosfolipid kardiyolipin27'nin biyosentezinde yer alan mitokondriyal füzyon makineleri Mgm1-Ugo1 / Fzo124,25,26 veya Mdm31-Por1 gibi birkaç başka temas bölgesi tanımlanmıştır. Son zamanlarda, dış membran kompleksi Por1-Om1428 ile oluşturulan yeni bir temas bölgesinin parçası olarak Cqd1'i tanımlamak için bizi MICOS'un tanımlanmasına götüren yöntemi geliştirdik. İlginç bir şekilde, bu temas bölgesi aynı zamanda mitokondriyal membran homeostazı, fosfolipid metabolizması ve koenzim Q28,29'un dağılımı gibi çoklu süreçlerde yer alıyor gibi görünmektedir.

Burada, daha önce tarif edilen mitokondrifraksiyonunun bir varyasyonunu kullandık 9,30,31,32,33. Mitokondrinin ozmotik tedavisi, mitokondriyal dış zarın bozulmasına ve matris boşluğunun büzülmesine yol açar ve iki zarı sadece temas bölgelerinde yakın mesafede bırakır. Bu, yalnızca mitokondriyal dış zardan veya mitokondriyal iç zardan oluşan veziküllerin üretilmesine veya hafif sonikasyon yoluyla her iki zarın temas bölgelerini içermesine izin verir. Mitokondriyal iç zarın çok daha yüksek protein-lipit oranına sahip olması nedeniyle, mitokondriyal iç zar vezikülleri, mitokondriyal dış zar veziküllerine kıyasla daha yüksek bir yoğunluk sergiler. Yoğunluk farkı, sükroz yüzdürme yoğunluğu gradyan santrifüjlemesi yoluyla membran veziküllerini ayırmak için kullanılabilir. Böylece, mitokondriyal dış zar vezikülleri düşük sükroz konsantrasyonlarında birikirken, mitokondriyal iç zar vezikülleri yüksek sükroz konsantrasyonlarında zenginleşir. Temas bölgelerini içeren veziküller, ara sükroz konsantrasyonlarında yoğunlaşır (Şekil 2). Aşağıdaki protokol, daha önce kurduğumuz32 yönteme kıyasla daha az özel ekipman, zaman ve enerji gerektiren bu geliştirilmiş yöntemi ayrıntılı olarak açıklamakta ve olası temas bölgesi proteinlerinin tanımlanması için yararlı bir araç sağlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponlar ve stok çözeltileri

  1. Deiyonize suda 1 M 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) çözeltisi yapın, pH 7.4. 4 °C'de saklayın.
  2. Deiyonize suda, pH 8.0 içinde 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
  3. Deiyonize suda 2.4 M sorbitol hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
  4. Deiyonize suda 2,5 M sükroz hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
  5. İzopropanol içinde 200 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) hazırlayın. −20 °C'de saklayın.
    DİKKAT: PMSF yutulduğunda toksiktir ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
  6. Deiyonize suda r trikloroasetik asit (TCA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
    DİKKAT: TCA solunum yolu tahrişine, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
  7. SM tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS ve 0.6 M sorbitol, pH 7.4.
  8. Şişme tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7.4.
  9. Sükroz gradyan tamponlarını hazırlayın: 20 mM MOPS'ta 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M ve 1,3 M sükroz ve 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
    NOT: Tüm tamponlar 4 °C'de saklanabilir; bununla birlikte, mantar üremesini önlemek için sükroz içeren tamponların -20 °C'de saklanması önerilir. Proteaz inhibitörleri kullanımdan önce taze olarak eklenmelidir.

2. Submitochondrial veziküllerin oluşumu

  1. Ham maya mitokondrisini yerleşik protokollere göre taze olarak izole edin34,35.
    NOT: Bu deney için Saccharomyces cerevisiae'den mitokondri izole edilmiştir. Diğer organellerden yoksun gradyan saf mitokondri üretimi gerekli değildir.
  2. 10 mg taze izole edilmiş mitokondriyi 1.6 mL SM tamponunda (4 °C) pipetleme ile yeniden süspanse edin (Şekil 2, adım 1).
  3. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş 100 mL Erlenmeyer şişesine aktarın.
  4. 20 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 16 mL şişme tamponu ekleyin. Ekleme sırasında buz üzerinde sürekli hafif karıştırarak uygulayın. Bu ozmotik arıtma, matris boşluğuna su alımına neden olur. Mitokondriyal iç zarın şişmesi dış zarı bozacaktır. Bununla birlikte, her iki membran da temas bölgelerinde temas halinde kalacaktır9 (Şekil 2, adım 2).
  5. Numuneleri buz üzerinde 30 dakika boyunca sürekli hafif karıştırarak inkübe edin.
  6. Numunelerdeki sükroz konsantrasyonunu yaklaşık 0,55 M'ye çıkarmak için 5 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 5 mL 2,5 M sükroz çözeltisi ekleyin. Bu ozmotik işlem, matris36'dan bir su akışı ile sonuçlanır. İç zarın büzülmesi, dış zarın artık parçalarına olan mesafesini en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Bu, sonikasyon yoluyla iç ve dış zarların yapay hibrit vezikülleri üretme olasılığını azaltır (Şekil 2, adım 3).
  7. Numuneleri buz üzerinde 15 dakika hafif karıştırarak inkübe edin.
  8. Submitochondrial membran vezikülleri oluşturmak için mitokondriyi sonikasyona tabi tutun (Şekil 2, adım 4).
    1. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş bir rozet hücresine aktarın.
    2. Rozet hücresini bir buz banyosunda soğuturken mitokondriyal süspansiyonu 30 saniye boyunca% 10 genlikte sonikleştirin.
    3. Süspansiyonu bir buz banyosunda 30 saniye dinlendirin.
    4. Adım 2.8.2 ve adım 2.8.3'ü üç kez daha tekrarlayın.
      NOT: Sonikasyon koşulları, kullanılan sonikatöre göre değişecektir. Bireysel makineler için optimizasyon gerekli olacaktır. Çok sert olan sonikasyon, mitokondriyal iç ve dış zarlardan oluşan veziküllerin yapay oluşumuna yol açacaktır.

3. Submitokondriyal veziküllerin ayrılması

  1. Üretilen vezikülleri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile kalan bozulmamış mitokondriden ayırın. Sağlam mitokondri peletlenirken, veziküller süpernatantta kalacaktır.
  2. Vezikül karışımını konsantre edin.
    1. Süpernatanı taze ultrasantrifüj tüplerine aktarın.
    2. 0,8 mm x 120 mm kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibine 0,3 mL 2,5 M sükroz çözeltisinden oluşan bir yastık yükleyin.
    3. 4 °C'de 100 dakika boyunca 118.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
  3. Veziküller, santrifüjlemeden sonra sükroz yastığının üstünde bir disk olarak görünecektir. Süpernatantın yaklaşık% 90'ını atın. Şimdi, konsantre vezikülleri, yukarı ve aşağı pipetleyerek 2,5 M sükroz da dahil olmak üzere kalan tamponda yeniden süspanse ederek hasat edin. Süspansiyonu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın.
  4. Bir politetrafloroetilen çömlekçi kullanarak süspansiyonu en az 10 vuruşla homojenize edin.
  5. Sükroz gradyanını hazırlayın.
    1. Beş adımlı 11 mL'lik bir adım gradyanı için (20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA, pH 7.4'te 1.3 M, 1.13 M, 1.02 M, 0.96 M ve 0.8 M sükroz), her katmanda 2.2 mL sükroz çözeltisi bulunur.
      NOT: Sükroz konsantrasyonlarını ölçmek ve ayarlamak için bir refraktometre önerilir; Ancak, zorunlu değildir. Refraktometreye 10 μL tampon uygulayın ve ilgili kırılma indekslerini tespit edin. Sükroz konsantrasyonunun hesaplanması aşağıdaki gibidir:
      Molaritede sükroz konsantrasyon denklemi; Kırılma indisi ölçüm analizi için diyagram.
      1.3333, suyun kırılma indisini temsil eder. 0.048403, sulu çözeltilerde molar kırılmanın sakaroz konsantrasyonuna doğrusal ölçeklenmesinden elde edilen sükroza özgü bir dönüşüm indeksidir 37.
    2. Santrifüj tüpüne en yüksek sakaroz konsantrasyonunu ekleyin ve tüpü −20 °C'ye koyun. Bir sonrakini uygulamadan önce katmanın tamamen donmasını bekleyin. Son katman eklenene kadar buna göre devam edin ve gradyanları −20 °C'de saklayın.
      NOT: Gradyanların çözülmesine izin vermek için deneyi başlatırken donmuş gradyanları 4 °C'ye aktarmayı unutmayın. Bu yaklaşık 3 saat sürecektir. Buradaki santrifüjleme için 13.2 mL kapasiteli sallanan bir kova rotoru kullanıldı. Farklı bir rotor kullanıldığında, gradyan adım hacimleri buna göre uyarlanmalıdır.
  6. Bir refraktometre kullanarak numunelerin sakaroz konsantrasyonunu ölçün. Bir refraktometreye erişim yoksa, alternatif olarak sükroz konsantrasyonunun 2 M olduğu varsayılabilir. Bu sözde sükroz konsantrasyonu daha sonra bir sonraki adımın temeli olacaktır.
  7. Uygun miktarda 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7,4 ekleyerek sükroz konsantrasyonunu 0,6 M'ye ayarlayın. Sükroz konsantrasyonu ölçülmek yerine 2 M olarak tahmin ediliyorsa, ayarlamadan sonra konsantrasyonun yeterince düşük olup olmadığının test edilmesi önerilir. Bir test tüpünde 200 μL 0.8 M sükrozun üzerine numunenin küçük bir alikotunu (yaklaşık 50 μL) uygulayın. Numune 0.8 M sükrozun üzerinde kalmalıdır.
  8. Numuneleri (yaklaşık 1 mL) sükroz gradyanının üzerine yükleyin (daha sonra başvurmak üzere 'u saklayın). Gradyanın bozulmasını önlemek için dikkatli pipetleme önemlidir (Şekil 2, adım 5).
  9. Vezikülleri 200.000 x g ve 4 °C'de 12 saat santrifüjleyerek ayırın. Mümkünse, gradyanın bozulmasını önlemek için santrifüjü hızlanma ve yavaşlamayı yavaşlatacak şekilde ayarlayın (Şekil 2, adım 6).
    NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
  10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak gradyanı yukarıdan aşağıya 700 μL'lik fraksiyonlar halinde hasat edin. Bu, yeterli bir çözünürlüğe izin veren 17 kesirle sonuçlanacaktır.

4. Submitochondrial veziküllerin analizi

  1. SDS-PAGE numunelerini hazırlamak için her bir fraksiyonu ardışık olarak gerçekleştirilen iki TCA çökeltisine38 tabi tutarak proteinleri konsantre edin.
    1. Tek tek fraksiyonlara 200 μL% 72 TCA ekleyin ve çözelti homojen olana kadar karıştırın. Fraksiyonları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve çökeltilmiş proteinleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın, 500 μL ( TCA çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
    2. Peletleri 1 mL asetonla (-20°C) yıkayın ve 20.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlerin kurumasını bekleyin. Peletleri 60 μL SDS numune tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: İlk TCA çökelmesinden sonra, özellikle yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda büyük miktarda sükroz kalacaktır. Bu, ek TCA yağışı yoluyla ortadan kaldırılacaktır.
  2. SDS-PAGE39 ve immünoblotlama 40,41,42,43 ile her fraksiyonun 20 μL'sini analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal iç ve dış zarları ayırmak nispeten kolaydır. Bununla birlikte, temas yeri içeren veziküllerin oluşturulması ve ayrılması çok daha zordur. Bize göre, iki adım kritik ve esastır: sonikasyon koşulları ve kullanılan gradyan.

Genellikle, doğrusal gradyanların adım gradyanlarına kıyasla daha iyi bir çözünürlüğe sahip olduğu düşünülür. Bununla birlikte, tekrarlanabilir üretimleri sıkıcıdır ve özel ekipman gerektirir. Bu nedenle, tek tek adımlar arasında nispeten küçük farklar olan bir a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal alt fraksiyonlama, oldukça karmaşık birkaç adımdan oluşan karmaşık bir deneydir. Bu nedenle, yerleşik yöntemimizi daha da geliştirmeyi ve bir dereceye kadar basitleştirmeyi amaçladık32. Buradaki zorluklar, genellikle bireysel yapılar olan karmaşık ve son derece özel ekipman gereksinimi ve muazzam zaman ve enerji tüketimiydi. Bu amaçla, doğrusal gradyanı dökmek ve hasat etmek için kullanılan pompaları ve münferit yapıları kaldırmaya çalıştık ve kademeli gradyana geçtik. Daha da önemli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H., 413985647 numaralı proje olan Deutsche Forschungsgemeinschaft'a (DFG) mali destek için teşekkür eder. Yazarlar, Münih Ludwig-Maximilians Üniversitesi'nden Dr. Michael Kiebler'e cömert ve kapsamlı desteği için teşekkür eder. Walter Neupert'e bilimsel katkıları, faydalı tartışmaları ve devam eden ilhamı için minnettarız. J.F., Münih Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ne (LSM) desteği için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
13,2 mL, Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89mmBeckman Instruments, Almanya344059
50 mL, Üstü Açık Kalın Duvar Polikarbonat Üstü Açık Tüp, 29 x 104mmBeckman Instruments, Almanya363647
A-25.50 Sabit Açılı Rotor- Alüminyum, 8 x 50 mL, 25.000 rpm, 75.600 x gBeckman Instruments, Almanya363055
Abbe refraktometreZeiss, Almanyadurduruldu,
herhangi bir Abbe refraktometresi
accu-jet pro Pipet Kontrol CihazıBrandtech, ABDBR26320durduruldu,
herhangi bir pipet kontrolörü yeterli olacaktır
Beher 1000 mLDWK Yaşam Bilimleri, AlmanyaC118.1
Branson  Dijital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonik, ABDFIS15-338-125
Branson Ultrasonik 3mm KONIK MİKRO UÇBranson Ultrasonik, ABD101-148-062
Branson Ultrasonik 200 ve 400 Watt Sonlandırıcılar: Rozet Soğutma HücresiBranson Ultrasonik, ABD15-338-70
Santrifüj Avanti JXN-26Beckman Instruments, AlmanyaB37912
Santrifüj Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Almanya8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-KokteylRoche, İsviçre11697498001
D-SorbitRoth, Almanya6213
EDTA (Etilendiamin-tetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat) Roth, Almanya8043
Erlenmeyer şişesi, 100 mLRoth, AlmanyaX747.1
dereceli pipet, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Almanya1180170
dereceli pipet, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Almanya1180153
buz banyosuneoLab, Almanya  S12651
Manyetik karıştırıcı RCT basicIKA-Werke GmbH, AlmanyaZ645060GB-1EA
MOPS (3- (N-Morfolino) propansülfonik asit)Gerbu, Almanya1081
MyPipetman Select P1000Gilson, ABDFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, ABDFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, ABD
Omnifix 1 mLBraun, Almanya4022495251879
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Serva, Almanya32395.03
STERICAN kanül 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Almanya4022495052414
karıştırma çubuğu, 15 mmVWR, ABD442-0366
SucroseMerck, AlmanyaS8501
SW 41 Ti Sallanan Kovalı RotorBeckman Instruments, Almanya331362
Test tüpleriEppendorf, Almanya3810X
Doku taşlama makineleri, Potter-Elvehjem tipi, 2 mL cam kapVWR, ABD432-0200
Doku taşlama makineleri, Potter-Elvehjem tipi, tırtıklı uçlu 2 mL pistonVWR, ABD432-0212
Trikloroasetik asit ( TCA)Sigma Aldrich, Almanya33731durduruldu,
herhangi bir TCA yeterli olacaktır (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Almanya4855
FP10005S

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal zolasyonMitokondri Alt Vezik llerS kroz GradyanMaya MitokondrileriMICOS KompleksiMembran MimarisiHafif SonikasyonSDS Pagemm n Blotlama

İlgili makaleler