Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitokondri, ökaryotlarda çeşitli farklı işlevleri yerine getirir, en bilineni oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir. Diğer işlevler arasında demir-kükürt kümelerinin üretimi, lipid sentezi ve daha yüksek ökaryotlarda^Ca2+ sinyali ve apoptoz 1,2,3,4'ün indüksiyonu yer alır. Bu işlevler, karmaşık üst yapılarıyla ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır.

Mitokondriyal üst yapı ilk olarak elektron mikroskobu⁵ ile tanımlanmıştır. Mitokondrinin iki zardan oluşan oldukça karmaşık organeller olduğu gösterilmiştir: mitokondriyal dış zar ve mitokondriyal iç zar. Böylece, bu membranlar tarafından iki sulu bölme oluşturulur: zarlar arası boşluk ve matris. Mitokondriyal iç zar daha da farklı bölümlere ayrılabilir. İç sınır zarı, dış zara yakın durur ve cristae istilalar oluşturur. Crista bağlantıları, iç sınır zarını ve cristae'yi birbirine bağlar (Şekil 1). Ayrıca, ozmotik olarak küçülmüş mitokondrinin elektron mikrografları, mitokondriyal zarların sıkıca bağlandığı bölgelerin var olduğunu ortaya koymaktadır ^6,7. Bu sözde temas bölgeleri, iki zarı kapsayan protein kompleksleri tarafından oluşturulur (Şekil 1). Bu etkileşim bölgelerinin, mitokondriyal dinamiklerin ve kalıtımın düzenlenmesinin yanı sıra sitozol ve matris⁸ arasındaki metabolitlerin ve sinyallerin transferi için önemleri nedeniyle hücre canlılığı için gerekli olduğu düşünülmektedir.

Mitokondriyal iç zardaki MICOS kompleksi, muhtemelen en iyi karakterize edilen ve en çok yönlü temas bölgesi oluşturan komplekstir. MICOS 2011 yılında mayada tanımlanmıştır ve altı alt birimden^{oluşur 9,10,1 1}: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 ve ^Mic10. Bunlar, ^9,10,11 crista kavşaklarına lokalize olan yaklaşık ^1.5 MDa'lık bir kompleks oluşturur. Çekirdek alt birimin, Mic10 veya Mic60'ın silinmesi, bu karmaşık ^9,11'in yokluğuna yol açar, yani bu iki alt birim MICOS'un kararlılığı için gereklidir. İlginç bir şekilde, MICOS çeşitli mitokondriyal dış zar proteinleri ve kompleksleri ile sadece bir değil, birden fazla temas bölgesi oluşturur: TOM kompleksi 11,12, TOB / SAM kompleksi 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 kompleksi⁹, Por1 10^, OM45 10 ve Miro ¹⁷. Bu, MICOS kompleksinin protein ithalatı, fosfolipid metabolizması ve mitokondriyal ultrayapının¹⁸ oluşumu gibi çeşitli mitokondriyal süreçlerde yer aldığını güçlü bir şekilde gösterir. MIC10 veya MIC60'ın silinmesiyle indüklenen MICOS kompleksinin yokluğu, neredeyse tamamen düzenli kristadan yoksun anormal bir mitokondriyal üst yapıya yol açtığından, ikinci işlev muhtemelen MICOS'un ana işlevidir. Bunun yerine, iç sınır zarına bağlantısı olmayan iç zar vezikülleri^{19, 20} biriktirir. Daha da önemlisi, MICOS mayadan insana kadar form ve işlev bakımından korunur²¹. MICOS alt birimlerindeki mutasyonların ciddi insan hastalıkları ile ilişkisi, daha yüksek ökaryotlar için önemini de vurgulamaktadır^22,23. MICOS çok yönlü olmasına rağmen, ek temas siteleri mevcut olmalıdır (yayınlanmamış gözlemlerimize dayanarak). Gerçekten de, mitokondriyal spesifik fosfolipid kardiyolipin^27'nin biyosentezinde yer alan mitokondriyal füzyon makineleri Mgm1-Ugo1 / Fzo1^24,25,26 veya Mdm31-Por1 gibi birkaç başka temas bölgesi tanımlanmıştır. Son zamanlarda, dış membran kompleksi Por1-Om14²⁸ ile oluşturulan yeni bir temas bölgesinin parçası olarak Cqd1'i tanımlamak için bizi MICOS'un tanımlanmasına götüren yöntemi geliştirdik. İlginç bir şekilde, bu temas bölgesi aynı zamanda mitokondriyal membran homeostazı, fosfolipid metabolizması ve koenzim Q^28,29'un dağılımı gibi çoklu süreçlerde yer alıyor gibi görünmektedir.

Burada, daha önce tarif edilen mitokondri^{fraksiyonunun} bir varyasyonunu kullandık 9,30,31,32,33. Mitokondrinin ozmotik tedavisi, mitokondriyal dış zarın bozulmasına ve matris boşluğunun büzülmesine yol açar ve iki zarı sadece temas bölgelerinde yakın mesafede bırakır. Bu, yalnızca mitokondriyal dış zardan veya mitokondriyal iç zardan oluşan veziküllerin üretilmesine veya hafif sonikasyon yoluyla her iki zarın temas bölgelerini içermesine izin verir. Mitokondriyal iç zarın çok daha yüksek protein-lipit oranına sahip olması nedeniyle, mitokondriyal iç zar vezikülleri, mitokondriyal dış zar veziküllerine kıyasla daha yüksek bir yoğunluk sergiler. Yoğunluk farkı, sükroz yüzdürme yoğunluğu gradyan santrifüjlemesi yoluyla membran veziküllerini ayırmak için kullanılabilir. Böylece, mitokondriyal dış zar vezikülleri düşük sükroz konsantrasyonlarında birikirken, mitokondriyal iç zar vezikülleri yüksek sükroz konsantrasyonlarında zenginleşir. Temas bölgelerini içeren veziküller, ara sükroz konsantrasyonlarında yoğunlaşır (Şekil 2). Aşağıdaki protokol, daha önce kurduğumuz³² yönteme kıyasla daha az özel ekipman, zaman ve enerji gerektiren bu geliştirilmiş yöntemi ayrıntılı olarak açıklamakta ve olası temas bölgesi proteinlerinin tanımlanması için yararlı bir araç sağlamaktadır.

1. Tamponlar ve stok çözeltileri

1. Deiyonize suda 1 M 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) çözeltisi yapın, pH 7.4. 4 °C'de saklayın.
2. Deiyonize suda, pH 8.0 içinde 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
3. Deiyonize suda 2.4 M sorbitol hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
4. Deiyonize suda 2,5 M sükroz hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
5. İzopropanol içinde 200 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) hazırlayın. −20 °C'de saklayın.
   DİKKAT: PMSF yutulduğunda toksiktir ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
6. Deiyonize suda r trikloroasetik asit (TCA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   DİKKAT: TCA solunum yolu tahrişine, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
7. SM tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS ve 0.6 M sorbitol, pH 7.4.
8. Şişme tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7.4.
9. Sükroz gradyan tamponlarını hazırlayın: 20 mM MOPS'ta 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M ve 1,3 M sükroz ve 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
   NOT: Tüm tamponlar 4 °C'de saklanabilir; bununla birlikte, mantar üremesini önlemek için sükroz içeren tamponların -20 °C'de saklanması önerilir. Proteaz inhibitörleri kullanımdan önce taze olarak eklenmelidir.

2. Submitochondrial veziküllerin oluşumu

1. Ham maya mitokondrisini yerleşik protokollere göre taze olarak izole edin^34,35.
   NOT: Bu deney için Saccharomyces cerevisiae'den mitokondri izole edilmiştir. Diğer organellerden yoksun gradyan saf mitokondri üretimi gerekli değildir.
2. 10 mg taze izole edilmiş mitokondriyi 1.6 mL SM tamponunda (4 °C) pipetleme ile yeniden süspanse edin (Şekil 2, adım 1).
3. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş 100 mL Erlenmeyer şişesine aktarın.
4. 20 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 16 mL şişme tamponu ekleyin. Ekleme sırasında buz üzerinde sürekli hafif karıştırarak uygulayın. Bu ozmotik arıtma, matris boşluğuna su alımına neden olur. Mitokondriyal iç zarın şişmesi dış zarı bozacaktır. Bununla birlikte, her iki membran da temas bölgelerinde temas halinde kalacaktır⁹ (Şekil 2, adım 2).
5. Numuneleri buz üzerinde 30 dakika boyunca sürekli hafif karıştırarak inkübe edin.
6. Numunelerdeki sükroz konsantrasyonunu yaklaşık 0,55 M'ye çıkarmak için 5 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 5 mL 2,5 M sükroz çözeltisi ekleyin. Bu ozmotik işlem, matris^36'dan bir su akışı ile sonuçlanır. İç zarın büzülmesi, dış zarın artık parçalarına olan mesafesini en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Bu, sonikasyon yoluyla iç ve dış zarların yapay hibrit vezikülleri üretme olasılığını azaltır (Şekil 2, adım 3).
7. Numuneleri buz üzerinde 15 dakika hafif karıştırarak inkübe edin.
8. Submitochondrial membran vezikülleri oluşturmak için mitokondriyi sonikasyona tabi tutun (Şekil 2, adım 4).
   1. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş bir rozet hücresine aktarın.
   2. Rozet hücresini bir buz banyosunda soğuturken mitokondriyal süspansiyonu 30 saniye boyunca% 10 genlikte sonikleştirin.
   3. Süspansiyonu bir buz banyosunda 30 saniye dinlendirin.
   4. Adım 2.8.2 ve adım 2.8.3'ü üç kez daha tekrarlayın.
      NOT: Sonikasyon koşulları, kullanılan sonikatöre göre değişecektir. Bireysel makineler için optimizasyon gerekli olacaktır. Çok sert olan sonikasyon, mitokondriyal iç ve dış zarlardan oluşan veziküllerin yapay oluşumuna yol açacaktır.

3. Submitokondriyal veziküllerin ayrılması

1. Üretilen vezikülleri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile kalan bozulmamış mitokondriden ayırın. Sağlam mitokondri peletlenirken, veziküller süpernatantta kalacaktır.
2. Vezikül karışımını konsantre edin.
   1. Süpernatanı taze ultrasantrifüj tüplerine aktarın.
   2. 0,8 mm x 120 mm kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibine 0,3 mL 2,5 M sükroz çözeltisinden oluşan bir yastık yükleyin.
   3. 4 °C'de 100 dakika boyunca 118.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
3. Veziküller, santrifüjlemeden sonra sükroz yastığının üstünde bir disk olarak görünecektir. Süpernatantın yaklaşık% 90'ını atın. Şimdi, konsantre vezikülleri, yukarı ve aşağı pipetleyerek 2,5 M sükroz da dahil olmak üzere kalan tamponda yeniden süspanse ederek hasat edin. Süspansiyonu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın.
4. Bir politetrafloroetilen çömlekçi kullanarak süspansiyonu en az 10 vuruşla homojenize edin.
5. Sükroz gradyanını hazırlayın.
   1. Beş adımlı 11 mL'lik bir adım gradyanı için (20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA, pH 7.4'te 1.3 M, 1.13 M, 1.02 M, 0.96 M ve 0.8 M sükroz), her katmanda 2.2 mL sükroz çözeltisi bulunur.
      NOT: Sükroz konsantrasyonlarını ölçmek ve ayarlamak için bir refraktometre önerilir; Ancak, zorunlu değildir. Refraktometreye 10 μL tampon uygulayın ve ilgili kırılma indekslerini tespit edin. Sükroz konsantrasyonunun hesaplanması aşağıdaki gibidir:
      
      1.3333, suyun kırılma indisini temsil eder. 0.048403, sulu çözeltilerde molar kırılmanın sakaroz konsantrasyonuna doğrusal ölçeklenmesinden elde edilen sükroza özgü bir dönüşüm indeksidir ³⁷.
   2. Santrifüj tüpüne en yüksek sakaroz konsantrasyonunu ekleyin ve tüpü −20 °C'ye koyun. Bir sonrakini uygulamadan önce katmanın tamamen donmasını bekleyin. Son katman eklenene kadar buna göre devam edin ve gradyanları −20 °C'de saklayın.
      NOT: Gradyanların çözülmesine izin vermek için deneyi başlatırken donmuş gradyanları 4 °C'ye aktarmayı unutmayın. Bu yaklaşık 3 saat sürecektir. Buradaki santrifüjleme için 13.2 mL kapasiteli sallanan bir kova rotoru kullanıldı. Farklı bir rotor kullanıldığında, gradyan adım hacimleri buna göre uyarlanmalıdır.
6. Bir refraktometre kullanarak numunelerin sakaroz konsantrasyonunu ölçün. Bir refraktometreye erişim yoksa, alternatif olarak sükroz konsantrasyonunun 2 M olduğu varsayılabilir. Bu sözde sükroz konsantrasyonu daha sonra bir sonraki adımın temeli olacaktır.
7. Uygun miktarda 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7,4 ekleyerek sükroz konsantrasyonunu 0,6 M'ye ayarlayın. Sükroz konsantrasyonu ölçülmek yerine 2 M olarak tahmin ediliyorsa, ayarlamadan sonra konsantrasyonun yeterince düşük olup olmadığının test edilmesi önerilir. Bir test tüpünde 200 μL 0.8 M sükrozun üzerine numunenin küçük bir alikotunu (yaklaşık 50 μL) uygulayın. Numune 0.8 M sükrozun üzerinde kalmalıdır.
8. Numuneleri (yaklaşık 1 mL) sükroz gradyanının üzerine yükleyin (daha sonra başvurmak üzere 'u saklayın). Gradyanın bozulmasını önlemek için dikkatli pipetleme önemlidir (Şekil 2, adım 5).
9. Vezikülleri 200.000 x g ve 4 °C'de 12 saat santrifüjleyerek ayırın. Mümkünse, gradyanın bozulmasını önlemek için santrifüjü hızlanma ve yavaşlamayı yavaşlatacak şekilde ayarlayın (Şekil 2, adım 6).
   NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak gradyanı yukarıdan aşağıya 700 μL'lik fraksiyonlar halinde hasat edin. Bu, yeterli bir çözünürlüğe izin veren 17 kesirle sonuçlanacaktır.

4. Submitochondrial veziküllerin analizi

1. SDS-PAGE numunelerini hazırlamak için her bir fraksiyonu ardışık olarak gerçekleştirilen iki TCA çökeltisine³⁸ tabi tutarak proteinleri konsantre edin.
   1. Tek tek fraksiyonlara 200 μL% 72 TCA ekleyin ve çözelti homojen olana kadar karıştırın. Fraksiyonları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve çökeltilmiş proteinleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın, 500 μL ( TCA çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
   2. Peletleri 1 mL asetonla (-20°C) yıkayın ve 20.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlerin kurumasını bekleyin. Peletleri 60 μL SDS numune tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: İlk TCA çökelmesinden sonra, özellikle yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda büyük miktarda sükroz kalacaktır. Bu, ek TCA yağışı yoluyla ortadan kaldırılacaktır.
2. SDS-PAGE³⁹ ve immünoblotlama 40,41,42,43 ile her fraksiyonun ²⁰ μL'sini analiz edin.

Mitokondriyal iç ve dış zarları ayırmak nispeten kolaydır. Bununla birlikte, temas yeri içeren veziküllerin oluşturulması ve ayrılması çok daha zordur. Bize göre, iki adım kritik ve esastır: sonikasyon koşulları ve kullanılan gradyan.

Genellikle, doğrusal gradyanların adım gradyanlarına kıyasla daha iyi bir çözünürlüğe sahip olduğu düşünülür. Bununla birlikte, tekrarlanabilir üretimleri sıkıcıdır ve özel ekipman gerektirir. Bu nedenle, tek tek adımlar arasında nispeten küçük farklar olan bir adım gradyanı oluşturmak için bir yöntem oluşturduk (bkz. adım 3.5). Adım gradyanının santrifüjleme üzerine dengeleneceğini ve bunun neredeyse doğrusal bir gradyan ile sonuçlanacağını tahmin ettik. Çarpıcı bir şekilde, bir refraktometre kullanılarak santrifüjlemeden sonra tek tek fraksiyonların sükroz konsantrasyonlarının belirlenmesi, adım gradyanının gerçekten de 200.000 x g'da 12 saatlik santrifüjlemeden sonra neredeyse doğrusal hale geldiğini ortaya koydu (Şekil 3).

Hafif sonikasyonun önemi bu temsili sonuçlarda belirgindir. Hafif sonikasyon koşullarında (Şekil 4A), mitokondriyal dış membran işaretleyicisi Tom40, erken düşük yoğunluklu fraksiyonlarda (Fraksiyon No. 4) zenginleştirildi ve daha sonrakilerde neredeyse yoktu. Mitokondriyal iç zar belirteci Tim17, yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda konsantre edildi (Fraksiyon No. 17). Buna karşılık, temas bölgesi proteini Mic60, ara sükroz konsantrasyonunun fraksiyonlarında (Fraksiyon No. 12-14) birikmiştir, bu da çeşitli membran veziküllerinin başarılı bir şekilde üretildiğini ve ardından ayrıldığını gösterir. Buna karşılık, daha sert sonikasyon koşullarıyla, mitokondriyal dış zar işaretleyicisi Tom40, gradyanın daha düşük fraksiyonlarında tespit edilebilir (Fraksiyon No. 14 ve Fraksiyon No. 17, Şekil 4B). Ek olarak, orta yoğunluktaki fraksiyonlarda önemli miktarda Tim17 vardı (Fraksiyon No. 13 ve Fraksiyon No. 14, Şekil 4B). Dış ve iç zar belirteçlerinin ara yoğunluk fraksiyonlarında spesifik olmayan birikimi, aday proteinlerin tanımlanmasını engelleyen karışık zarların yapay oluşumunu gösterir.

Şekil 1: Mitokondriyal üst yapının şematik gösterimi. Farklı bölmeleri, zarları ve protein konumlarını göstermek için bir mitokondrinin şematik bir temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temas bölgesi proteinlerini izole etmek için mitokondriyal fraksiyonlamanın iş akışı. Protokolde açıklanan sürece şematik bir genel bakış. (1) yeni izole edilmiş mitokondri (2) ozmotik olarak şişmiş (3) ve sonra küçülmüştür. (4) Büzülmüş mitokondri, submitochondrial veziküller oluşturmak için hafif sonikasyona itiraz edildi. (5) Vezikül karışımı konsantre edildi ve bir sükroz basamak gradyanına yüklendi. (6) Santrifüjleme yoluyla mitokondriyal dış zar vezikülleri düşük bir sükroz konsantrasyonunda, mitokondriyal iç zar vezikülleri yüksek bir sükroz konsantrasyonunda ve temas bölgesi içeren veziküller bir ara sükroz konsantrasyonunda zenginleştirildi. Kısaltmalar: MIM, mitokondriyal iç zar; MOM, mitokondriyal dış zar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Santrifüjleme ile doğrusal bir gradyan oluşturulması. İki aşamalı gradyan (1.3 M, 1.13 M, daha sonra 1.02 M, 0.96 M ve 0.8 M, 20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA, pH 7.4) paralel olarak hazırlandı ve 20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA'da 1 mL 0.6 M sükroz, pH 7.4, her iki gradyan üzerine yüklendi. Gradyanlar, 12 saat boyunca 200.000 x g ve 4 ° C'de santrifüjlemeye tabi tutuldu ve her biri 17 fraksiyon halinde hasat edildi. Yöntemin tekrarlanabilirliği, bir refraktometre kullanılarak tek tek gradyanların tek fraksiyonlarının sükroz konsantrasyonunun belirlenmesiyle test edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İyi tanımlanmış bir ultrasonik nabız ile temas bölgesi proteinlerinin izolasyonu. (A,B) Taze izole edilmiş maya mitokondrileri ozmotik tedaviye tabi tutuldu ve sonikasyona maruz bırakıldı. Üretilen veziküller, sükroz yüzdürme yoğunluğu gradyan santrifüjlemesi kullanılarak ayrıldı. Gradyan fraksiyonlandı ve çeşitli fraksiyonlardaki proteinler TCA çökeltisine tabi tutuldu. Mitokondriyal dış membran (Tom40), mitokondriyal iç membran (Tim17) ve temas bölgeleri (Mic60) için işaretleyici proteinlerin dağılımı, belirtilen antikorlar kullanılarak immünoblotlama ile analiz edildi. (A) Hafif sonikasyon (4 x 30 s,% 10 genlik), dış zar proteinlerinin (düşük yoğunluklu fraksiyonlar) ve iç zar proteinlerinin (yüksek yoğunluklu fraksiyonlar) net bir şekilde ayrılmasına neden oldu. Ek olarak, temas bölgesi proteini Mic60, orta yoğunluk fraksiyonlarında başarılı bir şekilde zenginleştirildi. (B) Daha sert sonikasyon (4 x 30 s,% 20 genlik) hibrid veziküllerin oluşmasına neden oldu ve bu nedenle temas bölgelerinin net bir şekilde ayrılmasına izin vermedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.