Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Biyopsi Kaynaklı Böbrek Hücrelerinin Metabolik Fenotipinin Tanımlanması

637 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Bu makalede

Özet

Bu protokol, biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerinin metabolik profillemesini yapmak için benzersiz bir yöntemi tanımlar. Sunulan yaklaşım, sağlıklı yetişkin erkek domuzlarda optimize edilmiştir ve böbrek allogreft canlılığının gerçek zamanlı değerlendirmesini geliştirme potansiyeline sahiptir. Bu yöntem aynı zamanda çoklu metabolizma temelli böbrek hastalıklarında yeni biyolojinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir.

Özet

Böbrek nakli, son dönem böbrek hastalığı için en uygun tedavi yöntemidir; Bununla birlikte, nakledilen böbrekler genellikle erken kaybedilir ve nakilden 10 yıl sonra %50'ye varan greft kaybı olur. Erken greft kaybının en önemli nedenlerinden biri, iskemi-reperfüzyon yaralanması (IRI) olarak bilinen, transplantasyon sırasında greftin maruz kaldığı yaralanmadır. Transplantasyon sonrası ilk hafta diyalize ihtiyaç duyulması olarak tanımlanan gecikmiş greft fonksiyonu (DGF), akut böbrek hasarının (ABH) fonksiyonel ve histolojik özelliklerini gösteren ciddi IRI'nin bir belirtisidir. ABH'yi yönlendiren mekanizmalar belirsizliğini korurken, biriken kanıtlar allogreftteki metabolik fonksiyonun AKI'ye aracılık ettiğini ve DGF'nin nedeni olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, IRI'nin metabolik temellerinin deşifre edilmesi ve izlenmesi, ABH'yi teşhis etme ve önleme kapasitemizi geliştirecektir. Bu makale, iğne biyopsisinden türetilmiş böbrek hücresi süspansiyonlarında mitokondriyal solunum (oksijen tüketim oranı aracılığıyla), glikoliz (hücre dışı asitleşme hızı) ve hücre içi ATP seviyelerini değerlendirmek için benzersiz bir yöntemi açıklamaktadır. Metodoloji, sağlıklı yetişkin erkek domuzlarda optimize edilmiş ve bir domuz oto-transplantasyon modelinde doğrulanmıştır. Sunulan yaklaşım, klinikte böbrek allogreft canlılığının gerçek zamanlı değerlendirmesini geliştirme potansiyeline sahiptir. Hasta kaynaklı biyopsilerde metabolizmanın profillenmesi, diğer metabolizma temelli böbrek hastalıklarında da yeni biyolojiyi ortaya çıkarabilir.

Giriş

Böbrek nakli, son dönem böbrek hastalığı için en uygun tedavi yöntemidir 1,2,3,4; Bununla birlikte, nakledilen böbrekler genellikle erken kaybedilir ve nakilden 10 yıl sonra %50'ye varan greft kaybı olur5. Etkilenen hastalar morbidite ve mortaliteyi artırmıştır ve sağlık sistemleri üzerinde önemli bir ekonomik yük oluşturmaktadır6. Erken greft kaybının önemli bir nedeni, iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) olarak bilinen, transplantasyon sırasında greftin maruz kaldığı yaralanmadır. IRI, azalan kan akışının neden olduğu kaçınılmaz bir yaralanmadır ve bunu reperfüzyon7 takip eder. İskemi, mitokondriyal solunum zincirinde ters elektron akışını yönlendiren ve reperfüzyondan erken sonra süperoksit üretimine ve ardından yaralanmaya yol açan doku süksinat birikimi ile karakterizedir8. Nakledilen organlarda IRI, primer fonksiyon bozukluğu, gecikmiş greft fonksiyonu (DGF), reddedilme ve düşük greft sonuçları riskini artırır 8,9. Nakilsonrası ilk hafta diyalize ihtiyaç olarak tanımlanan DGF 9, şiddetli IRI10'un bir tezahürüdür. Histolojik olarak, IRI ile ilişkili DGF, akut tübüler nekroz (ATN) ve mikrovasküler sistemde yaralanma ile kendini gösterir. İşlevsel olarak, allogreft11'de akut böbrek hasarının (ABH) özellikleri olan glomerüler filtrasyon hızında (GFR) ve idrar çıkışında bir azalma vardır. Önemine rağmen, şu anda iskemi-reperfüzyon ile ilişkili nakil sonrası ABH için herhangi bir tedavi yoktur. Tedavi eksikliği, hastalık mekanizmalarının tam olarak anlaşılmamasından ve yaralanmanın geri dönüşümlü olabileceği kritik zaman noktalarında greft disfonksiyonu riski en yüksek olan hastaları belirlemek için belirteçlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır12.

Biriken kanıtlar, allogreftteki değişmiş enerji metabolizmasının AKI'ye aracılık ettiğini ve DGF 13,14,15'i destekleyebileceğini düşündürmektedir. Böbrek hücreleri iki ana mekanizma ile enerji üretir: mitokondriyal solunum ve glikoliz16. IRI'de reperfüzyon mitokondriyal disfonksiyonile sonuçlanır 17. Sonuç olarak, glikoliz ana enerji kaynağı haline gelir 13,18,19,20. IRI'deki metabolik değişim, tübüler ve mikrovasküler endotel hücre ölümünü teşvik ederek ABH 21,22,23,24'e yol açar. Önceki bir çalışmada, ATN, greft13,18'deki IRI ile uyumlu olarak, glikolitik enzimlerin artan ekspresyonu ve mitokondriyal proteinlerin25 değişen seviyeleri ile ilişkilendirildi. Ayrıca, bir domuz böbreği oto-transplantasyon modelinde, iskemi ve ardından soğuk hava deposu, böbrek mitokondriyal protein seviyelerinin azalmasına ve laktat atılımının artmasına neden olmuştur26. Toplamda, bu bulgular, allogreftteki bazal metabolik özellikler allogreft disfonksiyonunun öngörücüsü olabileceğinden, nakilden önce bile böbrek allogreftlerinin metabolik fenotipinin izlenmesinin klinik önemini sağlamlaştırmaktadır27.

Allogreft reddi ve kaybı ile ilgili kısa dönem riskin klinik tahmin modelleri geliştirilmiştir28,29. Bununla birlikte, bu modeller hassasiyetten yoksundur ve greft30,31,32'nin moleküler özelliklerini dikkate almaz. Son çalışmalar, allogreft disfonksiyonu ve reddi gibi alt greft sonuçlarıyla ilişkili doku düzeyinde moleküler paternlerin tanımlanması yoluyla bu karşılanmamış ihtiyacı ele almayı amaçlamıştır 13,14,15,25,33,34. Bu çalışmalar, 33,34,35 geni, protein25,26 ve metabolit seviyesi 13,14'teki kararlı durum moleküler ölçümlerine dayanır ve allogreftin metabolik fenotipinin eksik bir resmini bırakır. Bilgideki bu boşluk, kısmen, belirli bir zamanda böbrek kaynaklı örneklerin metabolik fonksiyonunu ve enerji durumunu ölçememekten kaynaklanmaktadır. Biyopsi ile türetilmiş böbrek hücrelerinin metabolik fenotipini belirlemek için standart bir protokolün geliştirilmesi ve potansiyel olarak hasta örneklerinin çalışmasına çevrilmesi gerekmektedir. Bu makale, biyopsi kaynaklı böbrek hücresi süspansiyonlarında mitokondriyal solunum (oksijen tüketim oranı aracılığıyla), glikoliz (hücre dışı asitleşme oranı) ve hücre içi ATP seviyelerini değerlendirmek için benzersiz bir iş akışını açıklamaktadır. Metodoloji, sağlıklı yetişkin erkek domuzlardan alınan böbrek biyopsi çekirdekleri kullanılarak optimize edilmiştir. Gelecekteki klinik uygulamayı kolaylaştırmak için, biyopsi çekirdekleri, renal greft örneklemesinin standart klinik protokollerindeolduğu gibi 18 G'lik bir iğne kullanılarak elde edildi 36,37. Son olarak, protokol uygulamasının deneysel koşulları ayırt etmedeki faydası, bir domuz oto-transplantasyon modelinde doğrulanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol Toronto Genel Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Hayvan Kullanımı Protokolü numarası: 3652). Hayvanlara, Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı Kılavuzu, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), Ontario, Kanada'ya uygun olarak bakıldı. Bu çalışmada, her biri yaklaşık 30 kg ağırlığında beş adet 3 aylık erkek Yorkshire domuzu kullanıldı. Bu metodoloji için protokol aşağıdaki adımlara bölünmüştür: (1) Tek böbrek biyopsi çekirdeklerinin hücre süspansiyonlarına ayrılması; (2) Biyopsi ile elde edilen böbrek hücrelerinin metabolik profilinin çıkarılması; ve (3) Biyopsi ile elde edilen böbrek hücrelerinde ATP içeriğinin ölçülmesi. Metabolik fonksiyon veya ATP içeriği ölçümleri için toplanan tüm biyopsi örnekleri, bir biyogüvenlik kabininde alındıktan sonraki 3 saat içinde ayrıştırıldı. Metodolojinin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tek böbrek biyopsi çekirdeklerinin hücre süspansiyonlarına ayrışması

  1. Koaksiyel iğne (yani, bir dış kılavuz iğne ve bir iç biyopsi iğnesi) tabanca sistemi38 kullanarak renal korteksten üç biyopsi çekirdeği doku toplayın. Klinik çeviri için 18 G biyopsi iğne tabancası kullanılması önerilir39.
    NOT: Böbrek korteksi biyopsileri yaparken biyopsi iğne tabancasının açısı (~ 45 ° C) ve delinme derinliği (~ 20 mm) ile tutarlı olun.
  2. Her biyopsi çekirdeğini buz üzerinde 2 mL RPMI 1640 içeren 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice yerleştirin.
    1. Biyopsi dokusunu buz üzerine yerleştirilmiş 6 cm'lik bir Petri kabı üzerinde neşter kullanarak küçük parçalara (≤2 mm uzunluğunda) ayırın. Ultra ince ince uçlu kavisli cımbız kullanarak, her biyopsiden alınan doku parçalarını 1 mL ayrışma ortamı içeren farklı bir 1,5 mL tüpe yerleştirin.
      NOT: Ayrışma ortamı, 0.1 mg/mL DNaz I, 10 mg/mL kollajenaz ve Bacillus polymyxa'dan 2990 birim/mL nötr proteaz içeren RPMI 1640 ortamından oluşur. Bu ortam bileşimi kullanılarak insan böbrek biyopsilerinin ayrıştırılmasının, hücre canlılığını en üst düzeye çıkardığı ve nadir ve kırılgan hücre popülasyonlarının temsilini koruduğu kanıtlanmıştır40.
  3. Aralıklı çalkalama ile 37 ° C'de (ısıtma bloğu) 30 dakika boyunca ayrışmanın gerçekleşmesine izin verin (tüplerin her 5 dakikada bir girdaplanması önerilir).
  4. Ayrışmadan sonra, hücre süspansiyonlarını 35 μm hücre süzgeci geçmeli kapaklı tüplerden süzün.
  5. Süzgeci 1:1 hacimce %100 fetal sığır serumu (FBS) ile durulayın.
  6. Biyopsiden türetilmiş üç böbrek hücresi süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
  7. Hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dk, 4 °C) ile pelet yapın ve %10 FBS içeren 1 mL RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Bu hücre süspansiyonu normalde 0.8-1.2 × 106 hücre verir.

2. Biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerinin metabolik profillemesi

NOT: Metabolik profil oluşturma adımı, bir metabolik fonksiyon analizöründe glikoliz (ECAR) ve oksijen tüketim oranı (OCR) ölçümünü ve ayrıca ticari bir kit kullanarak hücre içi ATP seviyelerini entegre eder.

  1. Kartuş yardımcı plaka hidrasyonu ve kalibrasyonu
    1. Numune alımından bir gün önce, metabolik fonksiyon analizörünün kartuş yardımcı plakasının her bir oyuğuna 200 μL ddH2Oekleyin.
    2. Kartuş yardımcı plakasını gece boyunca 37 °C'de CO2 içermeyen bir inkübatörde inkübe edin.
    3. Numunenin alındığı gün, bir vakum sistemine bağlı bir Pasteur pipetikullanarak aspirasyon yoluyla ddH 2O'yu çıkarın ve kartuş yardımcı plakasının her bir oyuğuna 200 μL kalibrant çözeltisi (pH = 7.4) ekleyin.
    4. Kartuş yardımcı plakasını CO2 içermeyen bir inkübatörde gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. Hücre kaplaması ve metabolik fonksiyon ölçümleri için tahlil ortamı ve stresör bileşiklerin hazırlanması
    1. 96 oyuklu bir metabolik fonksiyon tahlil plakasının her bir oyuğuna% 10 FBS ile 100 μL RPMI ekleyin.
    2. Küçük bir alikotu (ör., 10 μL) hücre süspansiyonunun (adım 1'de elde edilir) farklı bir tüpte ayırın ve hücreleri bir tripan mavisi dışlama canlılık boyası kullanarak boyayın.
    3. Bir sayma odası kullanarak, orijinal süspansiyondaki canlı hücrelerin (tripan mavisi negatif)41 konsantrasyonunu belirleyin.
    4. Metabolik fonksiyon tahlil plakasının çalışma kuyucuklarının her birindeki hücreleri, 1.0 x 105 canlı hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Bu hücre numarası optimizasyondan sonra belirlendi (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).
      NOT: Metabolik fonksiyon tahlil plakasının dört köşesinden herhangi birine hücre tohumlamayın, çünkü bunlar boşluk olarak kullanılır.
    5. Metabolik fonksiyon tahlil plakasını gece boyunca (~ 16 saat) 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe ederek hücrelerin yapışmasına izin verin.
    6. Ertesi gün, mikroskop altında hücrelerin minimum% 70 -% 80 arasında bir birleşimde olduğunu onaylayın (metabolik fonksiyon parametrelerinin optimal olarak belirlenmesi için sağlıklı bir hücre tek tabakası önemlidir).
    7. 37 ° C'de en az 15 dakika boyunca fenol kırmızısı içermeyen bazal ortamdan bir alikot (40-50 mL) çözün.
    8. 33.915 mL önceden çözülmüş bazal ortama 2 mM glutamin (350 μL), 1 mM piruvat (350 μL) ve 5.55 mM glikoz (385 μL) ekleyerek 35 mL tahlil ortamı hazırlayın.
    9. Tek veya çok kanallı bir pipet kullanarak, RPMI ortamını metabolik fonksiyon tahlil plakasının her bir çalışma kuyusundan nazikçe çıkarın. Ardından, hücreleri yıkamak için 100 μL bazal ortam ekleyin.
    10. Bazal ortamı nazikçe çıkarın ve hücresiz kuyucuklar da dahil olmak üzere her oyuğa 150 μL tahlil ortamı ekleyin.
      NOT: Kuyuların tahlil ortamı olmadan bırakılması, plaka ortamındaki nem koşullarını etkileyebilir ve metabolik fonksiyonun tutarsız ölçümlerine yol açabilir (Ek Şekil 1).
    11. Metabolik fonksiyon tahlil plakasını CO2 içermeyen bir inkübatöre ~ 1 saat boyunca 37 ° C'de yerleştirin (iklimlendirme adımı). Kartuş yardımcı plakasını (daha önce kalibant solüsyonunda inkübe edilmiş) biyogüvenlik kabinine geri götürün.
    12. İklimlendirme sırasında, tahlil ortamında aşağıdaki dört stresör bileşik çözeltisini hazırlayın: 7 μM oligomisin (7x, nihai konsantrasyon için 1 μM oligomisin); 2.4 μM Karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) (8x, nihai konsantrasyon 0.3 μM FCCP için); 450 mM 2-deoksi-glikoz (2-DG) (9x, nihai konsantrasyon için 50 mM 2-DG); 10 μM Rotenon ve 10 μM Antimisin A (Rot + AA) (10x, nihai konsantrasyon için 1 μM Rot + 1 μM AA).
      NOT: Oligomisin, ATP sentazın aktivitesini inhibe eder ve bu nedenle elektron taşıma zincirini (ETC) keser. Bu, OCR'yi ve ATP sentaz güdümlü protonların mitokondriye akışını azaltır. Sonuç olarak, glikoliz, ATP üretiminin ana kaynağı haline gelir42. FCCP, protonları çekerek (pozitif yük) ve mitokondriye sürekli bir proton akışını indükleyerek oksidatif fosforilasyonun bir birleştiricisi olarak işlev gören bir siyanür ilacıdır (negatif yük), bu da ATP sentaz aktivitesinden bağımsız olarak ETC tarafından oksijen tüketimini sağlar43. 2-DG, 2-hidroksil grubunun hidrojen ile değiştirildiği ve rekabetçi bir glikoliz44 inhibitörü olarak işlev gördüğü sentetik bir yapısal glikoz analoğudur. Rot ve AA, elektron taşıma zincirinin kompleks I ve III'ünün inhibitör ilaçlarıdır,sırasıyla 45. Her bir ilacın metabolik fonksiyon testinin farklı aşamalarında enjekte edilmesinin etkileri Ek Şekil 2'de gösterilmiştir.
    13. Hücresiz kuyucuklar da dahil olmak üzere, kartuş yardımcı plakasının her bir oyuğunun üstündeki ilgili porta her bir ilacın 25μL'sini yükleyin. İlaçları aşağıdaki sıraya göre yükleyin: 7x oligomisin (port A), 8x FCCP (port B), 9x 2-DG (port C), 10x Rot + AA (port D).
    14. Metabolik fonksiyon testini ayarlamak için gerekli olana kadar kartuş yardımcı plakasını CO2 içermeyen inkübatörde inkübe edin.
  3. Biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerinde oksijen tüketimi ve glikolitik oranların belirlenmesi
    1. Metabolik fonksiyon analizörünün açık olduğunu ve bir aksesuar bilgisayardaki kontrolör yazılımına bağlı olduğunu doğrulayın.
    2. Yazılımı başlatın.
    3. düğmesine tıklayın Şablon > Boş.
    4. İlk sekmede, düğmesine tıklayın Enjeksiyon stratejisi. Dört enjeksiyon portuna karşılık gelen A, B, C veya D harfleriyle her bir düğmeye tıklayın. Her bir porttan enjekte edilecek ilacın adını yazın: oligomisin (port A), FCCP (port B), 2-DG (port C), Rot + AA (port D).
    5. İkinci sekmede, tüm deneysel koşulları tanımlayın. Yeni bir koşul eklemek için Koşul ekle düğmesine tıklayın. Yazılım, her koşula otomatik olarak bir renk atayacaktır. Plaka haritası düğmesine tıklayın ve buna göre renklendirilecek olan her bir kuyucuğa ilgili deney koşulunu atayın.
      NOT: Dört köşe kuyusu, arka plan sinyalini çıkarmak için kullanıldığından, boş (siyah renk) olarak atanmış olarak kalmalıdır.
    6. Üçüncü sekmede, Enjeksiyon düğmesine dört kez tıklayın, böylece dört enjeksiyon (A, B, C ve D bağlantı noktaları) diziye eklenecektir. Test, varsayılan enjeksiyon sırası (A, B, C, D), ölçüm sayısı (3 bazal ölçüm + her enjeksiyondan sonra 3 ölçüm) ve ölçümler arasındaki süre (3 dakika) kullanılarak çalıştırılabilir.
    7. Dördüncü sekmede, kutuları temel çalışma bilgileriyle doldurun ve Çalıştır'a tıklayın. Tepsi açılacak ve yazılım kullanıcıdan kartuş yardımcı plakasını takmasını isteyecektir. Plakayı tepsiye yerleştirmeden önce yeşil kapağı çıkardığınızdan emin olun.
    8. Kalibrasyondan sonra (~ 15 dakika), tepsi tekrar açılacak ve yazılım kullanıcıdan kartuş yardımcı plakasını çıkarmasını ve metabolik fonksiyon tahlil plakasını tepsiye yerleştirmesini isteyecektir. Yine, plakayı tepsiye monte etmeden önce plaka kapağını çıkarın. Kartuş yardımcı plakası atılabilir.
    9. Tahlil yaklaşık 2 saat içinde tamamlanacaktır. Bu süreden sonra, ilgili '.asyr' dosyasını kaydedin. ECAR ve OCR eğrilerini incelemek için .asyr dosyalarını hesaplamalı olarak analiz edin. Verileri tercih edilen formata aktarın.
  4. Metabolik fonksiyon verilerinin normalizasyonu için DNA içeriğinin ölçülmesi
    1. Belirtilen hücre proliferasyon test kitini kullanarak metabolik fonksiyon testinden sonra her bir kuyucuktaki hücrelerdeki DNA miktarını belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 20x hücre lizis tamponunu deiyonize suda seyrelterek gerekli hacimde 1x hücre lizis tamponu hazırlayın.
    3. Standart bir eğri hazırlamak için, 0 ng/mL, 12.5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 400 ng/mL, 800 ng/mL aralığındaki konsantrasyonlara hücre lizis tamponunda seri olarak seyreltilmiş 100 μL bakteriyofaj λ DNA standardı numunesi (hücre proliferasyon test kitinde bulunur) hazırlayın. Her seyreltmeyi 96 oyuklu siyah bir mikroplakanın farklı bir kuyucuğuna yükleyin.
    4. 400x boya reaktifini 1x hücre lizis tamponunda seyrelterek 1x boya bağlama solüsyonu hazırlayın. Her standart eğri kuyusu ve metabolik fonksiyon tahlili çalışması için iyi 100 μL gerekecektir.
    5. 100μL 1x boya solüsyonunu zaten standartları içeren ilk sütuna dağıtın. NOT: Bu noktaya kadar olan işlem, metabolik fonksiyon tahlil çalışmasının bitiminden 30 dakika önce başlatılabilir.
    6. Tek veya çok kanallı bir pipet kullanarak tahlil ortamını metabolik fonksiyon tahlil plakasından çıkarın.
    7. Çok kanallı bir pipet ile, metabolik fonksiyon tahlil plakasının her bir çalışma kuyucuğuna 100 μL 1x boya bağlama çözeltisi ekleyin. Hücreleri parçalamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve içindekileri siyah plakaya aktarın.
    8. Mikroplakayı ışıktan koruyun ve 37 °C'de 2-5 dakika inkübe edin.
    9. 480 nm'de uyarma ve 520 nm'de emisyon algılama özelliğine sahip bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak her bir numunenin floresan yoğunluğunu ölçün.

3. Biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerinde ATP içeriğinin ölçülmesi

NOT: Belirtilen ATP tespit reaktifi ve rekombinant ATP (rATP) standardını kullanarak biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerindeki ATP miktarını ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Donmuşsa, ATP algılama reaktifini gece boyunca 4 °C'de çözün.
  2. Biyopsi kaynaklı hücre süspansiyonlarının elde edilmesinin ve hücre sayımının ardından, %10 FBS'li 100 μL RPMI 1640 ortamı içeren beyaz 96 oyuklu bir mikroplakanın her bir oyuğuna 1.0 x 104 canlı hücre/kuyu yerleştirin. Ertesi gün bir rATP standart eğrisi yüklemek için kullanılacağı için mikroplakanın ilk sütununu boş bırakın.
  3. Mikroplakayı gece boyunca %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.
  4. Ertesi gün, ATP algılama reaktifini oda sıcaklığında önceden ısıtın.
  5. rATP standart eğrisini oluşturun. PBS'de aşağıdaki konsantrasyonlara seri olarak seyreltilmiş 100 μL rATP standardı numuneleri hazırlayın: 0 nM, 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Her rATP standart örneğinden 50 μL'yi mikroplakanın ilk sütununa yükleyin.
  7. %10 FBS içeren RPMI 1640 ortamını, tek veya çok kanallı bir pipet kullanarak her bir mikroplaka çalışma kuyucuğundan çıkarın.
  8. Her çalışmayı 100 μL PBS (37 ° C'lik bir su banyosunda önceden ısıtılmış) ile iyice yıkayın.
  9. PBS'yi çıkarın ve her çalışma kuyusuna 50μL yeni PBS ekleyin.
  10. Hem standart hem de çalışma kuyucuklarına 50 μL ATP algılama reaktifi ekleyin.
  11. Karıştırın, 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin ve ardından RT'de 10 dakika inkübe edin.
  12. Bir mikroplaka okuyucuda lüminesansı okuyun ve kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İş akışı, sağlıklı 3 aylık erkek Yorkshire domuzlarından alınan biyopsi kaynaklı böbrek hücrelerinde test edildi. Doku ayrışması ve hücre kaplaması protokolü yukarıda belirtildiği gibi takip edildi. Hücrelerin 16 saat boyunca yapışmasına izin verildikten sonra, OCR ve ECAR, sırasıyla mitokondriyal solunum ve glikoliz belirteçleri olarak bir metabolik fonksiyon analizörü kullanılarak biyopsiden türetilen domuz böbrek hücrelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

İlk deney, biyopsi kaynaklı böbrek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, biyopsilerden elde edilen böbrek hücrelerinin metabolik fonksiyonunu değerlendirmek için benzersiz bir yöntemi açıklamaktadır. Taze çekirdek böbrek biyopsilerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bir protokol, metabolik fonksiyon ve hücre içi ATP seviyelerinin analizi ile birleştirildi. Glikoliz, ECAR ölçümü ile ve mitokondriyal solunum, OCR ölçümü ile değerlendirilir. Metodolojiyi optimize etmek için porin böbrek biyopsileri kullanıldı.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Ortak yazarların hiçbirinin ifşa etmesi gereken rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

AK, Üniversite Sağlık Ağı Vakfı tarafından desteklenmiştir (ödüller 579067450776, 579072310776 ve 579068260776). SC-F, Böbrek Araştırma Bilimcisi Çekirdek Eğitim ve Ulusal Eğitim (KRESCENT) programı (2019KPPDF637713 ve 24KNIA-1291062) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-Deoksi-D-glukozSigmaD6134Rekabetçi glikoliz inhibitörü
5 mL Yuvarlak Alt Polistiren
Test Tüpü, Hücre Süzgeci Geçmeli		Kapaklı Falcon352235Ayrışma tüpleri
Antimisin A  Streptomyces  sp.SigmaA8674Solunum zincirinin kompleks III inhibitörü
AOF BP ProteazVitaCyte003-1000Ayrışma enzimi
Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) < br / > fenilhidrazon (FCCP)SigmaC2920Oksidatif fosforilasyon
ayırıcı CellTiter-Glo 2.0 Testi, 100mLPromegaG9242Hücre içi ATP ölçümü
Kollajenaz MAVitaCyte001-2030Ayrışma enzimi
CyQUANT Hücre Proliferasyon Testi, kültürdeki hücreler içinInvitrogenC7026Hücre içi DNA
D-GLIKOZ ölçümü, Susuz, Reaktif SınıfıBioshopGLU501Metabolik substrat
DNaz IKök hücre07469Ayrışma enzimi
Fetal Sığır Serumu, Premium,
ABD Menşeli, Isı ile Etkisiz, 500 mL		Wisent080-450Ayrışma ortamı takviyesi
L-Glutamin-200 mM (100x) sıvı (100 mL)Gibco25030081Metabolik substrat
Oligomisin ASigma75351ATP sentaz PBS inhibitörü
, -/-, 500 mLWisent311-010-CLHücre yıkama
rATP,  10 mM,  0?5 mLPromegaP1132Hücre içi ATP
RotenoneSigmaR8875Solunum zincirinin kompleks I inhibitörü
RPMI 1640Gibco11875119Ayrışma ortamı
Denizatı Dalga Kontrol Yazılımı 2.6AgilentN/A Metabolikfonksiyon ölçümlerinin kurulumu
Denizatı Dalgası Masaüstü Yazılımı 2.6BilgeN/AMetabolik fonksiyon verilerinin analizi
Denizatı XF baz ortamı,  fenol kırmızısı olmadan, 500 mLAgilent103335-100Metabolik fonksiyon ölçümü
Denizatı XFe96 FluxPak  (20 plaka, 18 kartuş,
ve 500 mL kalibrant solüsyonu)		Agilent102416-100Metabolik fonksiyon ölçümü
Denizatı XFe96 metabolik fonksiyon analizörüAgilent101991-100Metabolik fonksiyon ölçümü
Sodyum Piruvat Çözeltisi 100 mM (100X), sıvı 100 mLGibco11360070Metabolik substrat
ölçümü

Kaynaklar

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Böbrek Nakliİskemi Reperfüzyon HasarıGecikmiş Greft FonksiyonuAkut Böbrek HasarıMitokondriyal RespirasyonOksijen Tüketim HızıGlikoliz DeğerlendirmesiHücre İçi ATP Seviyeleri

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.