Bu makalenin amacı, kuduza özgü IgG ve IgM antikorlarının saptanmasında kuduz indirekt floresan antikor testinin kullanımını incelemektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kuduz IgG ve IgM Antikorlarının Kuduz İndirekt Floresan Antikor Testi Kullanılarak Saptanması
Bu makalede
Özet
Özet
Kuduz dolaylı floresan antikoru (IFA) testi, serum veya beyin omurilik sıvısında kuduza özgü çeşitli antikor izotiplerini saptamak için geliştirilmiştir. Bu test hızlı sonuçlar sağlar ve birkaç farklı senaryoda kuduz antikorlarını tespit etmek için kullanılabilir. Kuduz IFA testi, kuduz gelişen bir hastada bağışıklık tepkisini değerlendirmek için antikorların hızlı ve erken tespiti için özellikle yararlıdır. Antemortem kuduz teşhisi için diğer yöntemler öncelikli olsa da, bu test antikor tespiti yoluyla yakın zamanda kuduz virüsü maruziyetini göstermek için kullanılabilir. IFA testi, virüs nötralize edici bir antikor (VNA) titresi sağlamaz, ancak maruziyet öncesi profilaksi (PrEP) yanıtı, pozitif veya negatif antikor varlığı ile değerlendirilebilir. Bu test çeşitli durumlarda kullanılabilir ve bir dizi farklı hedef için sonuç sağlayabilir. Bu çalışmada, PrEP alan bireylerden birkaç eşleştirilmiş serum örneği kullandık ve IFA testini kullanarak zaman içinde kuduz antikoru varlığını gösterdik.
Giriş
Kuduz dolaylı floresan antikoru (IFA) testi, serum veya beyin omurilik sıvısında kuduza özgü çeşitli antikor izotiplerini tespit etmek için kullanılır. Bir antemortem kuduz hastasını izlemek için mevcut olan bir dizi testten biridir. Bir hastanın kuduz enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için antikorların erken tespiti için özellikle yararlıdır. Diğer testler, vaka öyküsü ve hastanın aşı durumu ile birlikte kullanıldığında, IFA testi kuduz virüsüne veya bir aşıya maruz kalmanın belirlenmesine yardımcı olabilir1. IFA testi IgM ve/veya IgG'yi ölçtüğü için, spesifik antikorun değerleri, antijen1'e maruz kalmaktan yaklaşık bir zaman dilimini gösterebilir. Bu test, listelenen uygulamalarda veya henüz keşfedilmemiş diğer uygulamalarda yararlı olabilir.
Birkaç kuduz serolojik tahlili mevcuttur. Hızlı floresan odak inhibisyon testi (RFFIT), floresan antikor virüs nötralizasyonu (FAVN) testi veya bunların modifikasyonları, kuduz virüsü nötralize edici antikorları (RVNA'lar) ölçmek için birincil yöntemlerdir1. Ancak bu testler IgM ve IgG antikorlarını ayırt etmez. Kuduz immün yanıtının izlenmesinde antikor izotipinin ayırt edilmesi önemli olduğunda, kuduz IFA ve kuduz enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) testleri kullanılır, ancak RVNA'ları ölçmezler. IFA ve ELISA testleri, bir numunede kuduza özgü antikorların varlığını belirlemek için kullanılabilse de, bunların nasıl yürütüldüğü konusunda bazı farklılıklar vardır. IFA testi, antijen substratı olarak hücre kültürü yapılmış bir canlı virüs kullanırken, kuduz tespiti için tipik bir ELISA, viral proteinlerden bir veya daha fazlasını kullanır. Kuduz virüsünün kültürlenebildiği bir laboratuvar ortamında, ELISA için bireysel viral proteinleri satın almak veya yetiştirmek yerine IFA testi daha kolay yapılabilir. Hangisinin seçileceği belirlenirken testin amacı ve herhangi bir kuduz serolojik testinin sonuçlarından elde edilen bilgiler dikkate alınmalıdır2.
IgM ilk yanıt veren kişidir, yaklaşık 28. günde sınıf geçişi gözlenene kadar artar, bu noktada IgG baskın dolaşımdaki antikorhaline gelir 3. Bu nedenle, IgM, kuduz virüsüne veya aşılamaya maruz kaldıktan sonra yalnızca sınırlı bir süre için beklenir. Hem serum hem de beyin omurilik sıvısının (BOS) test edilmesi, maruziyetin antikorların sadece serumlarda görüleceği aşılama yoluyla mı yoksa BOS1'de potansiyel olarak antikorları gösterecek viral bir enfeksiyondan mı olduğunu gösterebilir.
Kuduz antikorlarının maruziyet öncesi profilaksiden (PrEP) sonra birkaç yıl devam ettiği tespit edilmiştir4. IFA testi, aşılama veya maruziyeti takiben farklı zaman noktalarında bunu göstermek için yararlı bir araç olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki protokol, New York Eyaleti Sağlık Bakanlığı Wadsworth Tahlil Geliştirme Merkezi, protokol onay numarası #03-019 tarafından insan örneklerinin etik kullanımı için onaylanmıştır.
1. Güvenlik
- Kişisel koruyucu ekipman (KKD), minimum göz koruması (gözlük veya yüz siperi), cerrahi maske ve lateks olmayan eldivenler kullanın.
- Personelin kuduz aşısı olduğundan ve son 6 ay içinde ≥0,5 IU/mL'lik bir titre gösterildiğinden emin olun.
2. Antijen lamı hazırlama
NOT: Tüm virüs, BOS ve serum manipülasyonlarını evrensel önlemler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirin.
- 20 mL fare nöroblastomu veya BHK-21 hücrelerini, Eagle'ın% 10 fetal sığır serumu (EGM) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortamında 3.0 x 105 hücre / mL konsantrasyona hazırlayın ve kullanana kadar soğuk tutun.
- CVS-11 virüsünü, EGM'de mililitre başına 1.0 x 106.5 % 50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) çalışma seyreltmesine seyrelterek hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar soğuk tutun.
NOT: TCID50 , daha önce yayınlanan Reed ve Muench yöntemi ile belirlenir5. - Bir nem slayt odasını ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı iyi mikroskop slaytlarını %70 etanol ile temizleyin ve BSC'de havada kurumaya bırakın.
- Prosedür boyunca nemin sabit kalmasını sağlamak için slayt haznesindeki emici kağıt şeritlerine damıtılmış su (dH2O) ekleyin.
- Bir kalem kullanarak, kullanılacak her slaydı lot numarası, tarih, hücre tipi ve depolama için gerekli diğer tanımlayıcı bilgilerle etiketleyin ve slayt odasına yerleştirin.
NOT: Çoğu işaretleyici, kalem veya etiket, gelecekteki aseton sabitleme adımına dayanmayacaktır (adım 2.9). - Tekrarlayan bir pipet ile mikroskop slaytları üzerindeki her bir oyuğa 50 μL virüs seyreltmesi uygulayın. Ardından, her bir oyuğa 50 μL hücre seyreltmesi uygulayın ve pipet ucunu zaten kuyuda bulunan virüsle kirletmemeye dikkat edin.
- Nem kaydırma haznesini kapatın ve 34-36 °C'deki nemli inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra hücre enfektivitesini değerlendirin.
NOT: 2.8-2.12 arasındaki adımları yalnızca bir slaytta gerçekleştirin. - Slaytı nem odasından çıkarın ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Slaytı fosfat tamponlu salin (PBS) dolgulu bir Coplin kavanozunda 2 dakika yıkayın, ardından slaytın kurumasını bekleyin.
- Slaytı Coplin kavanozuna yerleştirin ve yanıcı malzemeler için onaylanmış -20 °C'lik bir dondurucuda en az 1 saat soğuk asetonda sabitleyin. Tüm aseton dökme ve havayla kurutma prosedürlerini çeker ocakta gerçekleştirin.
- Asetonun yanıp sönmesine izin verin ve kuruması için kaydırın. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan kuduz doğrudan floresan antikor (DFA) konjugatını slaydın kuyucuklarına uygulayın ve 34-36 °C nemli inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Slaytı PBS'nin Coplin kavanozlarında her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytı havayla kurutun.
- 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ve %20 gliserol tutucu içeren bir lamel monte edin ve enfektivitesi değerlendirmek için 200x büyütmede bir floresan mikroskop kullanarak slaydı okuyun. Hücreler yaklaşık% 50 enfekte değilse, istenen enfektiviteye ulaşılana kadar ertesi gün 2.7-2.12 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Hücre enfektivitesi, slayt kuyusundaki negatif hücrelerin kuduz pozitif hücrelere oranının görsel olarak değerlendirilmesine dayalı olarak yaklaşıktır. Negatif hücreler kırmızı renkte görünürken, pozitif hücreler yeşil floresan boyama gösterir. - Kalan slaytları inkübatörden ve nem odasından çıkarın. Süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice aspire edin, ardından slaytları 1-2 dakika boyunca PBS'li bir Coplin kavanozuna/kavanozlarına yerleştirin. Slaytları yaklaşık 30 dakika havayla kurutun. Slaytları kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
3. Numune hazırlama
- Test için hasta serumu veya BOS numunesi dilüsyonlarını hazırlayın. PBS'de% 0.05 Evans mavisi ile seyreltilmiş uygun bir çalışma konsantrasyonu için gerekli eşleniği hazırlayın.
NOT: Uygulamadan önce florofor bütünlüğünü korumak için konjugatı karanlıkta tutun
4. IFA prosedürü
- Her tahlil için gerekli sayıda hazırlanmış antijen lamını çıkarın ve slaytların buzunun çözülmesine ve tamamen kurumasına izin verin.
- Slaytları bir Coplin kavanozuna/kavanozlarına yerleştirin ve slaytları yanıcı malzemeler için onaylanmış -20 °C dondurucuda 2 saat ila gece boyunca soğuk asetonda sabitleyin. Slaytları asetondan çıkarın ve kurumaya bırakın.
- Nemi korumak için slaytları dH2O-ıslatılmış emici şeritlerle BSC'nin içindeki bir nem odası kutusuna yerleştirin. Önceden belirlenmiş kuyucuğa her numune seyreltmesinden, kontrol numunesinden veya PBS'den 50 μL uygulayın.
NOT: Her slaytta uygun sayıda hasta numune kuyusu, pozitif kontrol, negatif kontrol ve PBS hücre kontrol kuyusu bulunmalıdır. - Kapalı nem kaydırma odasını 37 °C, %5CO2 nemli inkübatöre yerleştirin. Slaytları 30 dakika inkübe edin, ardından nem slayt haznesini inkübatörden çıkarın ve bir BSC'ye yerleştirin.
- Süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice aspire etmek için bir aspiratör ucu kullanın ve hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Her oyuğa bir damla PBS uygulamak için steril bir damlalıklı pipet kullanın.
- Dikkatli aspirasyonu tekrarlayın, ardından her slaydı PBS dolu bir Coplin kavanozuna koyun ve toplam 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Slaytları nem odası kutusuna geri yerleştirin ve her bir oyuğa 50 μL uygun anti-insan antikor konjugatı uygulayın. 4.4 ile 4.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Slaytların kurumasını bekleyin, montaj ortamıyla bir lamel monte edin ve slaytları floresan mikroskop altında okuyun.
5. Slayt analizi
- Onaylanmış yüksek anti-kuduz antikor titresine sahip pozitif kontrol numunelerine kıyasla boyama desenine ve floresan yoğunluğuna dayalı dereceli numuneler.
- Numuneleri negatif, 1+, 2+, 3+ ve 4+ ölçeğinde derecelendirin, negatif sonuç floresan lekelenme göstermez ve 4+, pozitif kontrol numunelerine benzer bir boyama deseni ile parlak yeşil elma rengi floresansı temsil eder1.
NOT: Yeşil elma rengi yalnızca FITC etiketli antikorlar için geçerlidir; Renk, florofor seçimine bağlı olarak değişir. - Numunelere, numunenin 1-2+ derece gösterdiği seyreltme faktörü ile temsil edilen bir bitiş noktası değeri atayın. İlk tahlilde bitiş noktasına ulaşılmazsa numuneleri daha yüksek bir seyreltme faktöründe test edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tüm serum örnekleri PrEP'i takiben hastalardan yaklaşık olarak aynı zaman dilimlerinde toplandı. Numuneler aşağıdaki zaman noktalarında beş farklı hastadan test edildi: son kuduz aşısı aşılamasından 2 hafta sonra, kuduz aşısı serisinden 6 ay sonra ve kuduz aşısı serisinden 18 ay sonra. Her serum örneği seri olarak seyreltildi ve protokol adımları 5.2 ve 5.3'te tarif edildiği gibi hem IgM hem de IgG varlığı için derecelendirildi. Atanan antikor değeri, numunenin 1-2+ son nokta derecesine ulaştığı seyreltme faktörünü temsi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IFA testi, bir etiketleme bölgesinin kuduza özgü antikorları görselleştirmesine izin veren bir antijen-antikor kompleksinden yararlanır. Nöroblastom veya BHK hücreleri, çok kuyulu PTFE kaplı mikroskop lamları üzerine ekilir ve kuduz virüsü laboratuvar suşu CVS-11 ile aşılanır. Tek tabaka birleştiğinde ve hücreler yaklaşık% 50'lik istenen enfektiviteye ulaştığında, slaytlar kullanıma hazır olana kadar saklanır6.
Hasta serumu veya BOS, enfekte hücre tek tabakasına uygulan...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu projeyi desteklediği için New York Eyaleti Sağlık Bakanlığı Wadsworth Merkezi'ne minnettarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 25x55mm cam kapak kaymaları | Herhangi bir | ||
| Aseton | Herhangi bir | ||
| Anti-İnsan IgG Etiketli Eşlenik | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-İnsan IgM Etiketli Konjuge | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirasyonlu pipet ucu | Herhangi bir | ||
| BHK-21 Hücresi | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Seyreltici | MBL BION | DIL-9993 | |
| Hücre Kültürü suyu | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Kavanozları | Herhangi Bir | ||
| Fetal Sığır Serumu | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| FITC filtreli floresan mikroskop | Herhangi bir | ||
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inaktivasyon reaktifi | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG İnaktivasyon Reaktifi |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Temel Medya Kartalı – Earle ile s tuzları, L-glutamin ve esansiyel olmayan amino asitler, sodyum bikarbonat olmadan | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Fare Nöroblastom Hücreleri | ATCC | CCL-131 | |
| Çok kuyulu PTFE kaplama cam slaytlar | Herhangi bir | ||
| PBS | Herhangi bir | pH 7.6 | |
| Penisilin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Kuduz Doğrudan Floresan Antikor Konjugatı | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100 veya RU5500 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodyum Klorür kristalleri | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Steril damlalık | Herhangi | ||
| Streptomisin sülfat tuzu | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma önceden ayarlanmış kristaller pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Triptoz Fosfat Suyu | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin karışımı | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Kaynaklar
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
