Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65460

⸱

17 Kasım 2023

 , 
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae'den doğal kromatin bağlamında ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu saflaştırmak için bölgeye özgü rekombinasyona dayalı lokusa özgü bir kromatin izolasyon yöntemi sunar.

Özet

Ökaryotik kromatinin temel organizasyon birimi, bir histon oktamerinin etrafına ~1.7 kez sarılmış DNA'yı içeren nükleozom çekirdek parçacığıdır (NCP). Kromatin, NCP'lerin ve transkripsiyon faktörleri, kromatin yeniden şekillenmesi ve modifiye edici enzimler dahil olmak üzere çok sayıda başka protein kompleksinin varlığı olarak tanımlanır. Bu protein-DNA etkileşimlerinin, hücre döngüsünün farklı aşamalarında spesifik genomik lokuslar düzeyinde nasıl düzenlendiği hala belirsizdir. Bunun başlıca nedeni, bu tür dinamik etkileşimlerin hassas ölçümlerini elde etmeyi zorlaştıran mevcut teknik sınırlamalardır. Burada, doğal kromatin durumunda ilgilenilen tek kopyalı bir gen lokusunu izole etmek için bölgeye özgü rekombinasyonu verimli bir tek adımlı afinite saflaştırma protokolü ile birleştiren geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, hedef lokusun genomik kromatin üzerinde sağlam bir şekilde zenginleştirilmesine izin vererek, bu tekniği protein etkileşimlerini tarafsız ve sistematik bir şekilde, örneğin kütle spektrometrisi ile tanımlamak ve ölçmek için etkili bir strateji haline getirir. Bu tür bileşimsel analizlere ek olarak, bu yöntemle saflaştırılan doğal kromatin, muhtemelen nükleozom konumlandırma ve histon modifikasyonları ile ilgili in vivo durumu yansıtır ve bu nedenle, mayadaki hemen hemen her genomik lokustan türetilen kromatinin daha ileri yapısal ve biyokimyasal analizlerine uygundur.

Giriş

Ökaryotik genomların kromatine dinamik organizasyonu, DNA'yı çekirdeğin sınırlarına sığacak şekilde sıkıştırırken, gen ekspresyonu için yeterli dinamikleri ve düzenleyici faktörler için erişilebilirliği sağlar. Kısmen, bu çok yönlülüğe, histon oktamer1'in etrafına ~1.7 kez sarılmış 147 bp DNA'ya sahip bir çekirdek parçacığı içeren kromatinin temel birimi olan nükleozom aracılık eder. Nükleozom, N ve C terminal histon kuyruklarında çok sayıda histon varyantı ve posttranslasyonel modifikasyon (PTM'ler) ile bileşimine göre oldukça dinamik bir yapıdır. Ayrıca, ökaryotik kromatin, transkripsiyon faktörleri, DNA ve RNA işleme makineleri, mimari proteinler, kromatinin yeniden şekillenmesi ve modifikasyonunda yer alan enzimler ve kromatin ile ilişkili RNA molekülleri gibi çok sayıda başka temel bileşenle etkileşime girer. Transkripsiyon, replikasyon ve onarımda yer alan bu önemli makinelerin tümü, bu işlemler için doğal substrat görevi gören kromatine erişim gerektirir. Sonuç olarak, bu DNA işlemlerinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, bu makinelerin birleştiği ve biyolojik reaksiyonları kolaylaştırdığı spesifik genomik bölgelerdeki kromatin yapısındaki kolektif değişikliklerin kesin bir tanımını gerektirir.

Genetik ve protein-protein etkileşimi çalışmaları yoluyla çok sayıda kromatin faktörünün tanımlanmasına rağmen, belirli genomik bölgelerde kromatin etkileşimlerinin doğrudan, tarafsız ve kapsamlı analizlerinin yapılması önemli bir engel olarak kalmıştır 2,3. Başlangıçta, genomun yalnızca yüksek oranda bol bölgeleri (yani, tekrarlayan lokuslar) veya çok kopyalı plazmitler, ilişkili proteinlerinkütle spektrometrik tanımlaması için yeterli miktarda ve saflıkta izole edilebilirdi 4,5,6,7. Yakalama problarının kromatinize DNA'ya doğrudan hibridizasyonuna, CRISPR-dCas9 sistemi kullanılarak yakınlık biyotinilasyonuna veya diziye özgü adaptör proteinlerinin ilgilenilen lokusa bağlanmasına dayanan bir dizi yeni yaklaşım, maya ve memeli genomlarından tek kopya lokusların proteomunu çözmeye başlamıştır 8,9,10. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler, protein-DNA etkileşimlerini stabilize etmek için formaldehit çapraz bağlama ve sonraki saflaştırma için kromatini çözündürmek için sonikasyon gerektirir. Birlikte, her iki manipülasyon da saflaştırılmış kromatinin müteakip yapısal ve fonksiyonel çalışmaları olasılığını dışlar.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, daha önce maya 11,12'den hedeflenen kromozomal alanları çıkarmak için bölgeye özgü rekombinasyon kullanan bir metodoloji tasarladık. Özünde, ilgilenilen genomik bölge, Zygosaccharomyces rouxi'den bölgeye özgü R-rekombinaz için tanıma bölgeleri (RS) ile çevrilidir ve aynı zamanda aynı bölgedeki prokaryotik transkripsiyonel baskılayıcı LexA proteini (LexA) için üç DNA bağlanma bölgesinden oluşan bir grup içerir. Maya hücreleri, R-rekombinazın eşzamanlı ekspresyonu için bir ekspresyon kaseti ve bir tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketine kaynaşmış bir LexA proteini içerir. R-rekombinazın indüksiyonundan sonra, enzim hedeflenen bölgeyi kromozomdan dairesel bir kromatin alanı şeklinde verimli bir şekilde çıkarır. Bu alan, LexA DNA bağlanma bölgelerine ve ayrıca bir afinite desteğine bağlanan LexA-TAP adaptör proteini aracılığıyla saflaştırılabilir. Bu yöntem son zamanlarda maya kromozomu III13'ün seçilmiş replikasyon kökenlerini içeren farklı kromatin alanlarını izole etmek için kullanılmıştır.

Bu ex vivo yaklaşımın en büyük avantajlarından biri, izole edilmiş malzemenin fonksiyonel analizlerine izin vermesidir. Örneğin, bu yöntemle saflaştırılan replikasyon orijin alanları, doğal in vivo montajlı kromatin şablonlarından bir test tüpünde orijin ateşlemesinin verimliliğini değerlendirmek için in vitro replikasyon testlerine tabi tutulabilir. Sonuç olarak, izole edilmiş materyalin biyokimyasal ve fonksiyonel karakterizasyonu, doğal kromatin şablonu ile birlikte saflaştırılmış proteinler kullanılarak nükleer işlemlerin yeniden oluşturulmasına izin verebilir. Özetle, bu metodoloji, belirli bir kromozomal işlem geçiren belirli bir genomik bölgenin kolektif bileşimsel ve yapısal kromatin değişikliklerini takip etmek mümkün olacağından, kromatin araştırmalarında heyecan verici bir yol açar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Kullanılan çözümlerin, arabelleklerin ve ortamların listesi için Tablo 1'e bakın.

1. Rekombinant maya suşu yapısı

  1. Rekombinasyona yetkin bir maya suşu oluşturmak için, SbfI ile sindirilmiş plazmid K238'i, ilgilenilen lokusta entegre LexA bağlanma bölgeleri ve RS rekombinasyon bölgeleri olan bir maya suşuna dönüştürün13,14.
    NOT: Dönüştürülmüş SbfI kısıtlama fragmanı, ekspresyon kasetinin homolog rekombinasyon ile genomik entegrasyonu için maya kromozomu I'in homolog dizileri ile birlikte LexA-TAP füzyon proteini ve R-rekombinazın yapısal ekspresyonu için gerekli ekspresyon kasetini içerir (Şekil 1).
  2. Bir kontrol suşu oluşturmak için, entegre RS ve LexA bağlanma bölgelerinden yoksun bir izojenik maya suşu alın ve rekombinasyona yetkin suş için kullanılanla aynı koşullar altında SbfI ile sindirilmiş K238 plazmidi ile dönüştürün.
  3. SCD-LEU agar plakaları14 üzerindeki LEU2 seçim işaretleyicisine dayalı olarak yetkili maya hücrelerini seçin.

2. IgG antikorlarının epoksi ile aktive edilmiş manyetik boncuklara bağlanması

NOT: IgG antikorlarını epoksi ile aktive edilen manyetik boncuklara aşağıdaki yayınlanmış protokol11'e göre eşleştirin.

  1. 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL% 50 asetonda (300 mg ~5.1 ×10 10 boncuğa karşılık gelir) 300 mg epoksi ile aktive edilmiş boncukları askıya alın. Bir girdap karıştırıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın.
  2. Boncukları içeren tüpü 820 × g ve 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  3. Boncukları 3x 20 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7.4) ile yıkayın. Her yıkama adımından sonra süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi santrifüjleme ile çıkarın.
  4. Boncukları 16 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) süspanse edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir hibridizasyon fırınında hafifçe döndürün.
  5. Tavşan IgG'lerini (100 mg) 7 mLdH2O(son konsantrasyon: 14 mg / mL) içinde çözün.
  6. Süspansiyonu netleştirmek için IgG süspansiyonunu 13.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  7. 3.5 mL süpernatanı (50 mg tavşan IgG'sine karşılık gelir) yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
  8. IgG çözeltisini 9.85 mL 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 7.4) ile seyreltin, ardından hafifçe karıştırma altında 0.1 M sodyum fosfat (pH 7.4) içinde damla damla 6.65 mL 3 M amonyum sülfat ekleyin.
    NOT: Çözeltiye hızlı bir şekilde amonyum sülfat eklemekten kaçının, çünkü yüksek yerel tuz konsantrasyonu tavşan IgG'lerinin çökelmesine neden olur.
  9. IgG çözeltisini 820 × g ve 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı manyetik boncuk süspansiyonuna ekleyin.
  10. Tüpü gece boyunca veya en az 18 saat boyunca 30 °C'de bir hibridizasyon fırınında hafifçe döndürerek inkübe edin.
  11. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
  12. Boncukları 20 mL 100 mM glisin-HCl (pH 2.5) ile yıkayın. IgG polipeptitlerinin denatürasyonunu önlemek için çözeltiyi adım 2.2'de açıklandığı gibi hızla çıkarın.
  13. Boncukları bir kez 20 mL 10 mM Tris-HCl (pH 8.8) ile yıkayın. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi aspire edin.
  14. Kalıntı reaktif epoksi gruplarını etkisiz hale getirmek için hafif rotasyon altında 5-10 dakika boyunca 20 mL 0.1M trietilamin çözeltisi ekleyin. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
  15. Boncukları 4x 20 mL PBS (pH 7.4) ile 5 dakika boyunca hafifçe döndürerek yıkayın. Her yıkama adımından sonra süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
  16. Boncukları 2x 20 mL PBS (pH 7.4) ile% 0.5 Triton X-100 (a / h) ile her biri 5 dakika ve 15 dakika boyunca bir hibridizasyon fırınında hafif rotasyon altında yıkayın. Süpernatanı adım 2.2'de açıklandığı gibi çıkarın.
  17. Boncukları,% 0.02 sodyum azid (a / h) ile 16 mL PBS (pH 7.4) nihai hacminde askıya alın. Kullanana kadar 4 °C'de 1 mL alikot olarak saklayın.

3. Maya hücre kültürü ve hasadı

  1. YPD plakalarından kontrol ve rekombinasyona yetkin maya suşlarını 5 mL YPR ortamında aşılayın ve gece boyunca 30 °C ve 200 rpm'de inkübe edin.
  2. Bu kültürün 2 mL'sini 100 mL YPR ortamına aşılayın ve gece boyunca 30 °C ve 200 rpm'de inkübe edin.
  3. Her suş için, iki 5 L Erlenmeyer şişesinin her birine (her suş için toplam 4 L kültür ortamı, iki şişeye bölünmüş) 1.800 mL otoklavlanmış YP ortamı ve 200 mL otoklavlanmış rafinoz çözeltisi (% 20 a/h) dağıtın.
  4. Büyüyen maya hücrelerini OD600 0.2'de kendi ortamlarında aşılayın ve adım 3.1'de açıklandığı gibi yaklaşık 6 saat boyunca veya hücreler istenen OD600 / 1.0'a ulaşana kadar inkübe edin. Hücrelerin herhangi bir kontaminasyondan arınmış normal büyümesini sağlamak için OD'yi 2 saat aralıklarla kontrol edin.
  5. Bölgeye özgü rekombinasyonu indüklemek için 200 mL galaktoz ( a/h) ekleyin.
  6. G1 fazındaki hücreleri tutuklamak için 110 μL (50 ng / mL) YMFA (galaktoz ile aynı anda, adım 3.5) ekleyin ve 2 saat inkübe edin.
    NOT: YMFA'nın hücrelere eklenmesi, deneysel koşullara ve ele alınacak biyolojik soruya bağlıdır. Kesin olarak, bu deney için, lisanslı replikasyon kökenlerine sahip homojen bir hücre popülasyonu elde etmek için hücreler G1 fazında durdurulur; Bu süreçte, replikatif kompleks, S fazında DNA replikasyonunun başlamasından önce G1 fazındaki orijinlere bağlanır.
  7. Hücre süspansiyonunu 1 L'lik santrifüj kovalarına aktarın ve 6.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletlerini toplam 10-15 mL dH2O hacminde yeniden süspanse edin.
  8. 25 mL'lik bir şırıngayı bir Luer tapası ile kapatın ve suyla dolu 50 mL'lik konik bir tüpün içine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu şırınga düzeneğine aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.397 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  9. Luer tapasını şırıngadan çıkarın ve hücre "spagetti" oluşturmak için hücreleri sıvı nitrojene ekstrüde edin.
    NOT: 4 L kültür ortamının kullanılması, 7-10 g'lık bir ıslak nihai hücre peletleri sağlar.
  10. Dondurulmuş hücreli spagettiyi 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve daha fazla kullanana kadar −80 °C'de saklayın.

4. Kromatin lokusu saflaştırması

NOT: Bu lokusa özgü kromatin saflaştırma protokolünde yer alan adımların şematik bir özeti için Şekil 2'ye bakın.

  1. Ticari bir kahve öğütücüsünü, kahve öğütücüyü her seferinde 30 saniye boyunca 2 kez kuvvetlice sallayarak 30-50 g kuru buz öğüterek soğutun. Soğuduktan sonra kuru buz tozunu atın.
  2. Önceden soğutulmuş kahve değirmeninde 3 g donmuş maya hücreli spagettiyi ~30-50 g kuru buzla karıştırın.
  3. Öğütme sırasında maya hücresi tozunun kaybını önlemek için kapak ile öğütücü arasındaki bağlantıyı parafilm ile kapatın.
  4. Maya hücresi-kuru buz karışımını, her tur arasında 30 sn aralıklarla her seferinde 10 sn boyunca 10 kez öğütün (toplam süre tahmini: ~10 dakika). Kuru buz ve hücre tozunun kahve öğütücünün duvarlarına yapışmasını önlemek için, öğütme sırasında kahve öğütücünün kenarlarına sürekli olarak vurun.
  5. Elde edilen maya hücresi kuru buz tozunu temiz ve kuru bir spatula kullanarak plastik bir behere aktarın.
  6. Kuru buzu buharlaştırmak için beherleri oda sıcaklığında tutun.
  7. Kuru buz buharlaştıktan sonra, maya hücresi tozuna 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri (750 μL/g maya hücresi) içeren 2,25 mL MB tamponu ekleyin.
  8. Hücrelerin tamponla tamamen süspansiyonunu sağlamak için hücre-tampon karışımını kuvvetlice pipetleyin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  9. Elde edilen hücre süspansiyonundan (ham hücre ekstraktları [CCE]) DNA (%0.1) ve protein (%0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
  10. Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı 2 mL reaksiyon tüplerine aktarın ve hücre kalıntılarını ham hücre lizatından ayırmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 21.130 × g'da santrifüjleyin.
  11. Tüm tüplerdeki süpernatanları 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
  12. DNA (% 0.1) ve protein analizi (% 0.05) için süpernatanttan (giriş [IN]) örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
  13. 500 μL IgG'ye bağlı manyetik boncuk bulamacını (her maya suşu için), 20 rpm'de 4 °C'de 4 °C'de her biri 5 dakika boyunca 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 500 μL soğuk MB tamponu ile 2x yıkayarak dengeleyin. Her yıkama adımından sonra manyetik bir raf kullanarak süpernatanı boncuklardan atın.
  14. IgG'ye bağlı manyetik boncukları, 20 rpm'de rotasyonda 4 ° C'de 1 saat boyunca 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 500 μL soğuk MB tamponunda inkübe edin. Süpernatanı manyetik bir raf kullanarak boncuklardan atın.
  15. Dengelenmiş manyetik boncuk bulamacını hücre lizatı ile karıştırın ve 4 ° C'de 2 saat boyunca 20 rpm'de rotasyonla inkübe edin.
  16. Manyetik boncuk hücreli lizat süspansiyonunun tamamını düşük bağlayıcı reaksiyon tüplerine aktarın.
  17. Şimdi ilgilenilen kromatin halkalarını taşıyan manyetik boncukları, manyetik bir raf kullanarak hücre lizatından ayırın.
  18. Her tüpten kalan akışı (FT) 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
  19. Manyetik boncukları her tüpten 300 μL soğuk MB tamponuna süspanse edin ve boncukları bir reaksiyon tüpünde toplayın. 20 rpm'de 4 ° C'de 4 ° C'de 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 750 μL soğuk MB tamponu ile her biri 5x'i 10 dakika boyunca yıkayın. Son yıkamayı proteaz ve fosfataz inhibitörleri olmadan 750 μL soğuk MB tamponu ile gerçekleştirin.
  20. Boncukları proteaz ve fosfataz inhibitörleri olmadan 40 μL soğuk MB tamponunda askıya alın.
    NOT: Elüatın nihai hacmi, beklenen aşağı akış uygulamasına göre ayarlanabilir. TEV elüsyonu genellikle 100-300 μL aralığında verimli bir şekilde çalışır.

5. TEV proteaz aracılı elüsyon

  1. LexA-CBP kromatin halka komplekslerini boncuklardan serbest bırakmak için, boncukları bir termomikserde 2 ° C ve 6 rpm'de gece boyunca 4 μL 450x His etiketli rekombinant TEV proteaz ile inkübe edin.
  2. Manyetik bir raf kullanarak boncukları son elüattan ayırın. Bölünmüş kromatin halkaları içeren elüatı yeni bir 1.5 mL reaksiyon tüpüne aktarın.
  3. Kalan boncukları son elüattan ayırmak için tüpleri tekrar manyetik bir rafta tutun.
  4. Boncukları (TB) 750 μL soğuk AC tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
  5. Son elüattan (TE), DNA (% 0.5) ve protein (% 0.25) analizi için örnekler alın. Daha fazla işleme kadar −20 °C'de saklayın (bölüm 7'de açıklanmıştır).
    NOT: Nihai elüatın düşük hacmi nedeniyle, analiz sırasında protein ve DNA içeriğinin daha iyi bir temsilini elde etmek için DNA ve protein analizi için toplanan numunelerin yüzdesi arttırılır.

6. Denatürasyon elüsyonu

  1. Boncukları 2 kez 750 μL soğuk AC tamponunda 20 rpm'de 4 °C'de her seferinde 4 dakika boyunca yıkayın.
  2. Kalan bağlı LexA-kromatin komplekslerini çıkarmak için, boncuklara 500 μL 0.5MNH4OHekleyerek denatürasyon elüsyonu gerçekleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  3. Manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın ve elüatı düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpüne aktarın.
  4. Elüattaki maksimum kromatin lokuslarını geri kazanmak için boncukları adım 6.2'deki gibi tekrar inkübe edin.
  5. Manyetik bir raf kullanarak boncukları süspansiyondan ayırın ve elde edilen elüatı adım 6.3'teki elüatı içeren aynı tüpte toplayın.
  6. Boncukları (DB) 750 μLdH2O'dayeniden süspanse edin ve DNA (% 0.1) ve protein (% 0.05) analizi için örnekler alın.
  7. Son elüattan (DE), DNA (% 0.5) ve protein (% 0.25) analizi için örnekler alın.

7. DNA ve protein analizi

  1. DNA analizi
    1. Numune hazırlama
      1. DNA örneklerine 100 μL IRN tamponu ekleyin ve hacmidH2Oile 200 μL'lik bir nihai hacme yükseltin.
      2. 1 ng K071 spike-in plazmit DNA'sı ekleyin.
      3. 1 μL RNAse A (10 mg/mL) ekleyin ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      4. 5 μL proteinaz K (10 mg/mL) ve 10 μL SDS ( ) ekleyin ve 56 °C'de 1 saat inkübe edin.
      5. 200 μL fenol/kloroform/izopropil alkol (25:24:1) ekleyin ve her seferinde 10 saniye boyunca 2 kez iyice girdaplayın.
      6. Organik ve sulu fazları ayırmak için numuneleri 21.130 × g'da 7 dakika santrifüjleyin.
      7. Süpernatanı 1.5 μL glikojen (5 mg/mL) ve 2.5x 0 etanol içeren yeni 1.5 mL'lik tüplere aktarın.
      8. DNA'yı çökeltmek için tüpleri en az 2 saat ve en fazla gece boyunca −20 ° C'de inkübe edin.
      9. 21.130 × g'da, 4 °C'de 45 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
      10. DNA peletini yeniden süspanse etmeden 150 μL p etanol ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 °C'de 21.130 × g'da tekrar santrifüjleyin.
      11. DNA peletlerini oda sıcaklığında 10-15 dakika kurutun ve 40 μLdH2Oiçinde yeniden süspanse edin.
      12. Adım 7.1.1.11'de izole edilen DNA'yı HpaI restriksiyon endonükleazı ile doğrusallaştırmak için restriksiyon enzimi sindirimi gerçekleştirin. 50 μL'lik bir reaksiyon karışımı için, 40 μL izole DNA + 2 μL HpaI enzimi + 5 μL restriksiyon enzimi tamponu + 3 μLdH2Ogece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    2. qPCR analizi
      1. Restriksiyonla sindirilen DNA'yı 1:5 oranında seyreltin (40 μL dH2O'da 7.1.1.12 adımından elde edilen restriksiyonla sindirilmiş DNA'nın 10μL'si).
      2. ARS316 bölgesi, PDC1 ve spike-in plazmit DNA için tasarlanmış primer çiftleri kullanın.
      3. Tablo 2'de verilen programı kullanarak qPCR'yi çalıştırın.
      4. qPCR sonuçlarını, hedef olarak ARS316 bölgesini ve spike-in plazmit DNA'sını ve referans lokus olarak PDC1'i (veya başka herhangi bir gen veya genomik bölgeyi) kullanarak nispi miktar tayini ile analiz edin.
      5. ARS316 ve PDC1 primer nispi niceleme değerlerini her numune için alınan fraksiyon hacminin yüzdesine göre normalleştirerek PDC1 üzerinden ARS316 lokusu geri kazanım yüzdesini değerlendirin. Örneğin, akış için% 0.1'i 1,000 faktörü ve TEV elüatı için% 0.5'i 200 faktörü ile çarpın.
      6. ARS316 ve PDC1 geri kazanım yüzdelerini, spike-in plazmit DNA nispi kantifikasyon değerleri ile normalleştirin.
      7. Denklem (1) kullanılarak elde edilen bağıl niceleme hedefi/referans değerlerini değerlendirerek ARS316 lokusunun toplam kromatin üzerindeki zenginleşmesini değerlendirin.
        figure-protocol-1(1)
    3. Güney leke analizi
      1. 20 μL restriksiyon enzimi ile sindirilmiş DNA örneğine 5 μL jel yükleme boyası ekleyin.
      2. Numuneleri ~3 saat boyunca 110 V'ta %1'lik bir agaroz jel içinde çalıştırın.
      3. Jeli bir tepsiye aktarın ve 20 dakika hafifçe çalkalayarak depurinasyon solüsyonuna batırın.
      4. JelidH2Oile durulayın ve çalkalayarak 15 dakika boyunca denatürasyon solüsyonuna batırın. Denatürasyon çözeltisini atın.
      5. Jeli hafifçe çalkalayarak 15 dakika denatürasyon solüsyonuna batırın.
      6. Jeli dH2O ile durulayın ve her seferinde 15 dakika boyunca 2 kez transfer tamponu ile hafifçe çalkalayarak yıkayın.
      7. Bir tepsiyi 1-1,5 L transfer tamponu ile doldurun ve sabit bir platform üzerine yerleştirin.
      8. Uzun bir Whatman kağıdı parçası kesin ve kağıdın iki ucu transfer tamponuna batırılacak şekilde platforma yerleştirin.
      9. Jelin boyutuna eşit bir şerit pozitif naylon membran ve dört şerit Whatman kağıdı kesin.
      10. Platformdaki transfer tamponuna batırılmış iki parça Whatman kağıdı yerleştirin.
      11. Jeli yüzü aşağı bakacak şekilde Whatman kağıt parçalarının üzerine yerleştirin.
      12. Jelin üzerine, pozitif naylon zarı yerleştirin, ardından kalan iki parça Whatman kağıdını transfer tamponuna batırın. Yığını transfer tamponu ile ıslak tuttuğunuzdan emin olun.
      13. Sıkışan hava kabarcıklarını bir cam çubuk kullanarak yuvarlayarak çıkarın.
      14. Birleştirilmiş yığının üzerine bir yığın kağıt havlu ve ardından 0,5 kg'lık bir nesne (örneğin bir cam şişe) yerleştirin.
      15. Düzeneği gece boyunca oda sıcaklığında transfer için bırakın.
      16. Transferden sonra, membranı toplam 1.200 J/cm2 enerji çıkışı ile UV çapraz bağlayın.
      17. ARS316 lokusunun tespiti için, referans DNA etiketleme sistemi kullanılarak sentezlenen radyoaktif probları kullanarak güney leke hibridizasyonu.
        NOT: Aksi belirtilmedikçe bundan sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
      18. Düşük bağlayıcı bir reaksiyon tüpünde, 25-40 ng PCR fragmanını (prob) 19 μLdH2Oiçinde seyreltin ve 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hemen buz üzerinde soğutun.
      19. Tüpe 500 μM dCTP, 500 μM dGTP ve 500 μM dTTP'nin her birine 1 μL ekleyin.
      20. Kit ile birlikte verilen rastgele nükleotid heksamerleri içeren tampondan 20 μL ekleyin.
      21. Tüpe 5 μL radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleotid [α-32P] dATP ekleyin. Radyoaktif olarak etiketlenmiş materyali içeren tüm adımları radyoaktivite onaylı bir koruyucu ortam altında gerçekleştirin.
      22. 1 μL Klenow fragmanı ekleyin ve tek sarmallı DNA sentezi için bir termomikser üzerinde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
      23. Reaksiyonu durdurmak için 5 μL durdurma tamponu ekleyin.
      24. Depolama arabelleğini çıkarmak için bir boyut dışlama sütununu 1.500 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu yeni bir tüpe yerleştirin.
      25. Dahil edilmemiş radyoaktif nükleotidleri çıkarmak için prob karışımını kolondan geçirin. Probu toplamak için 1.500 × g'da 30 saniye santrifüjleyin.
      26. Probun membrana spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için 150 μL somon sperm DNA'sı (1:100) ekleyin.
      27. Çift sarmallı DNA'yı denatüre etmek için prob karışımını 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      28. Buz üzerinde birkaç saniye dondurun ve kapakta yoğunlaşan su damlacıklarını azaltmak için 500 × g'da birkaç saniye santrifüjleyin.
      29. Güney leke zarını hibridizasyon tamponu ile 5-10 dakika boyunca rotasyonla kısaca yıkayın.
      30. Membranı hibridizasyon tamponu ile 55 ° C'de 1 saat rotasyonla önceden hibridleyin. Hibridizasyon tamponunu atın.
      31. Hazırlanan prob ile birlikte membrana 15 mL taze hibridizasyon tamponu (55 °C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. Membranı gece boyunca 55 °C'de döndürerek inkübe edin.
      32. Rotasyonla 55 °C'de 0,3x SSC, %0,1 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
      33. Rotasyonlu 55 °C'de 0,1x SSC, %0,1 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
      34. Rotasyonlu 55 °C'de 0,1x SSC, %1,5 SDS ile her biri 15 dakika boyunca 2x hibridizasyon sonrası yıkama gerçekleştirin.
      35. Membranı hibridizasyon tüpünden çıkarın ve film üzerindeki radyoaktif izleri elde etmek için membranı 3 güne kadar bir fosfor görüntüleyici ekranına maruz bırakın.
      36. Bir fosfor görüntüleme lazer tarama sistemi kullanarak filmin görüntülerini elde edin.
  2. Protein analizi
    1. Numune hazırlama
      1. 1 μL β-merkaptoetanol, PAGE LDS numune tamponu (1x) ve dH2O ekleyerek tüm protein örneklerini nihai hacimlerine (ham hücre ekstraktı, giriş, akış, boncuklar ve elüat numuneleri için sırasıyla 200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL ve 20 μL) ayarlayın.
      2. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika denatüre edin.
    2. Batı lekesi analizi
      NOT: Standart protokolleri15,16 kullanarak SDS-PAGE ve batı lekeleme gerçekleştirin.
      1. 1.5 mm'lik bir SDS-PAGE jelin her bir oyuğuna her bir numuneden 15 μL yükleyin.
      2. 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon ile PAP (1: 2.000) ve LexA (1: 1.000) antikorlarını kullanarak lekenin immün boyamasını gerçekleştirin. % 5 kuru süt / PBST çözeltisi ile seyreltin.
        NOT: PAP analizinden sonra, leke, ikinci LexA antikoru ile immün boyamadan önce hafif bir sıyırma protokolü17 kullanılarak sıyrılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

~ 1.4 kb ARS316 kromatin alanının saflaştırılmasına, yapısal olarak eksprese edilen LexA-TAP adaptör proteini aracılık etti. Negatif bir kontrol olarak hizmet etmek için, LexA-TAP'ı eksprese eden ancak entegre RS ve LexA bağlanma bölgeleri içermeyen izojenik bir suş kullanarak saflaştırmalar gerçekleştirdik. Şekil 3 , ARS316 lokusunu hedef alan hem kontrol hem de rekombinasyon yetkin bir suş üzerinde gerçekleştirilen standart bir saflaştırma deneyinden elde edilen DNA analiz sonucunu gösterm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Belirli bir hedef genomik bölgenin faktörlerinin ve kromatin manzarasının tanımlanması, kromatin araştırmalarında büyük bir zorluk oluşturmaya devam etmektedir18. Bu protokol, maya kromozomlarından farklı kromatin alanlarını spesifik olarak çıkarmak ve saflaştırmak için etkili bir sistemi tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla, bu tek aşamalı saflaştırmanın saflığı ve verimi, lokusa özgü kromatin saflaştırma yöntemlerinin birçok sınırlamasının üstesinden gelir, böylece diğer ilgisiz genomik bölgelere kıya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

S.H. laboratuvarındaki çalışmalar, SFB1064 (proje kimliği 213249687), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç Hibesi 852798 Çatışma Çözümü) ve Helmholtz Gesellschaft aracılığıyla DFG tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > maya suşları< / güçlü > <
güçlü > Kontrol Suşu: < / güçlü> MATa; ura3 ve Delta; 0; leu2 ve Delta; 0; onun3Δ 1; met15 ve Delta; 0; çubuk1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRBölüm 1, referanslar 13 ve 14
Rekombinasyon Suşuna bakın: MATa; ura3 ve Delta; 0; leu2 ve Delta; 0; onun3Δ 1; met15 ve Delta; 0; çubuk1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRBölüm 1, referans 13 ve 14
Plasmid
K238 plazmidBölüm 1'e bakın, referans 13
'ye bakın Depolama: -20 derecede saklayın; C
K071 Spike-in plazmit DNABölüm 7.1, referans 13
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Reaktifler< / güçlü >
AsetonCarl Roth5025<> Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Amonyum asetat (NH < alt > 4 < / > Ac)Sigma AldrichA7262Bölüm 6 ve 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Amonyum çözeltisi (NH < alt > 4< / alt >OH) %25Merck Millipore533003Bölüm 6
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Amonyum sülfatSanta CruzSc-29085Bölüm 2
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Bacto agarBD (VWR)90000-760Bölüm 3
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Bacto peptoneBD (VWR)211820Bölüm 3
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
β-MerkaptoetanolSigma Aldrich07604Bölüm 7.2
Depolama: 4 derecede saklayın; C
Kemilüminesan substrat kitiThermoFisher34580Bölüm 7.2
Depolama: 4 derecede saklayın; C
Di-Sodyum Hidrojen fosfat dodekahidratMerck1.06579.1000Bölüm 2 ve 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Ditiyotreitol (DTT)ThermoFisher15508013Bölüm 4
Depolama: 4 derecede saklayın; C
EtanolMerck100983Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma AldrichEDBölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Galaktoz (%20 (a/h) stok)Sigma AldrichG0625-1KG  /  5KGBölüm 3
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Jel boya yükleme (6x)BioLabsB7024ABölüm 7.1
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
GlusoseSigma-AldrichG8270Bölüm
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
GlycineCarlRoth.0079.4Bölüm 2
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Glikojen (5 mg / mL)InvitrogenAM9510Bölüm 7.1 < br / > Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Hidroklorik asit (HCl)PanReac AppliChem182109.1211Bölüm 2, 4 ve 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Magnezyum Asetat (MgAc)Bernd Kraft15274.2600/C035Bölüm 4
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Magnezyum klorür (MgCl2)Sigma AldrichM8266Bölüm 6
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Nu PAGE LDS numune tamponu (4x)Invitrogen2399549Bölüm 7.2
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Fenol/Kloroform/İzoamil alkol (25:24:1 v/v)İnvitrojen15593-031Bölüm 7.1
Depolama: 4 derecede saklayın; C
Potasyum klorür (KCl)SigmaP9541Bölüm 4
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Radyoaktif olarak etiketli &alfa;-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)Hartmann AnalitikSRP-203Bölüm 7.1
Depolama: 4 derecede saklayın; C
RadPrime etiketleme sistemiThermoFisher18428-011Bölüm 7.1
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Rafinoz (%20 (a/h) stok)SERVA34140.03Bölüm 3
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum klorür (NaCl)MerckK53710504142Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum sitrat (Na3C6H5O7)Sigma-Aldrich71402Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma AldrichS5881Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum n-dodesil sülfat (SDS) (%5 stok (a/h))Alfa AesarA11183Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum fosfat monobazikSigma-Aldrich71496Bölüm 2 ve 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Sodyum  azideSanta Cruz  Biyoteknolojisc-208393Bölüm 2
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
  TrietilaminSigma Aldrich90340Bölüm 2
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Tris baseChem CruzSC-3715BBölüm 2 ve 4
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Triton X-100Sigma AldrichX100Bölüm 2 ve 4
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Tween-20Bernd Kraft18014332Bölüm 4
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Maya özütüBD (VWR)212720Bölüm 3
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
Maya çiftleşme faktörü alfa (1 & mikro; g/mL stok )  BiomolY2016.5Bölüm 3
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Maya Sentetik Bırakma ortamı LEUCINESigma AldrichY1376Bölüm 1'e bakın, referans 14
Enzimler
HpaI kısıtlama enzimi (5.000 U/mL)NEBR0105SBölüm 7.1
Depolama: -20 derecede saklayın; C
Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100x)ThermoFisher Scientific78446Bölüm 4
Depolama: 4 &° Depolayın; C
Proteinaz K (10 mg/mL)SERVA33756Bölüm 7.1
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisherEN0531Bölüm 7.1
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
TEV proteaz (10000 U/&mikro; L)NEBP8112SBölüm 5
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
< güçlü > Malzemeler< / güçlü >
BcMag Epoksi ile Aktive Edilmiş Manyetik BoncukBiyoklon A.Ş.FC-102Bölüm 2
Depolama: 4 &°C'de saklayın; C
Kuru buzBölüm 4
Düşük bağlayıcı santrifüj tüpleri 2.0 mLEppendorf22431102Bölüm 4
Microspin  G-25 SütunlarıCytiva27-5325-01Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
ParafilmMerck P7793Bölüm 4
Pozitif naylon membranBiozol11MEMP0001Bölüm 7.1
Depolama: Oda sıcaklığında saklayın
PVDF transfer membranıImmobilon-Merck Kırlangıç IPVH00010Bölüm 7.2
Depolama: Odada saklayın sıcaklık
SDS-PAGE jel% 4-12 bis-tris (15 kuyu, 1.5 mm)İnvitrojenve nbsp; NP0336BOXBölüm 7.2
Depolama: 4 &°C'de saklayın; C
Şırınga (25 mL) luer bağlantılıHenke Sass Wolf4200-000V0Bölüm 3
Whatman kağıdı (Sınıf 3MM CHR Selüloz Batı Kurutma Kağıt Levhası)Cytiva3030-917Bölüm 7.1 < br / > Depolama: Oda sıcaklığında
saklayın < güçlü > Antikorlar< / güçlü >
Anti-LexA, tavşan poliklonal IgG, DNA bağlanma bölgesi antikoruMerck Millipore06-719Bölüm 7.2
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L), Yaban turpu peroksidaz konjugatıInvitrogenG21234Bölüm 7.2 < br / > Depolama: -20 ° C'de saklayın;
TAP etiketli proteinlerin tespiti için tavşanda üretilen C Peroksidaz Anti-Peroksidaz (PAP) antikoruSigma AldrichP1291-500ULBölüm 7.2
Depolama: -20 ° C'de saklayın; C
Tavşan IgG antikorlarıSigmaI5006-100MGBölüm 2
Depolama: 4 derecede saklayın; C
< güçlü>Primerler (10 & mikro; M)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCTBölüm 7.1
K071 Spike-in plazmit DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACATBölüm 7.1
<şablon olarak maya genomik DNA'sından güçlü>PCR fragmanı   ARS316 amplifikasyonu için (güney blot için): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                                                                  rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAATBölüm 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGTBölüm 7.1
Equipment
Kahve değirmeniGastroback42601Bölüm 4
Dewar şişesiNAL GENE4150-2000Bölüm 3
DynaMag TM-2 manyetik rafInvitrogen12321DBölüm 4, 5 ve 6
Hibridizasyon fırınıHybaid Mini10Ri418Bölüm 2
MikrosantrifüjEppendorf5424RBölüm 4 ve 7.1
UV çapraz bağlayıcıAnalizi95-0174-02Bölüm 7.1

Kaynaklar

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674(2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111(2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N kleozom ekirdek Par acProtein DNA Etkile imleriAfinite Safla t rmasManyetik Boncuk zolasyonuNatif KromatinHiston ModifikasyonlarDNA Replikasyon Ba lang Noktalar
Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.