Method Article

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

DOI:

10.3791/65463

⸱

June 23rd, 2023

 , 
1University of Toronto Mississauga

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ile çalışmak, büyümeyi, plazmid dönüşümünü, koloni PCR'sini, floresan muhabir protein ölçümünü ve sınırlı plazmid mini hazırlığını detaylandırmak için protokollerin yanı sıra yaygın sorunları ve sorun gidermeyi sunuyoruz. Bu protokoller, DSM20016'daki muhabir proteinlerinin ölçülmesine veya muhabir dahil değilse koloni PCR ile doğrulanmasına izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lactobacillus , birçoğu gastrointestinal sistem içindeki sentetik biyolojik çabalar için bir şasi olarak kullanılma potansiyeline sahip kommensal suşlar olan 261 türden oluşan inanılmaz derecede büyük, çeşitli bir bakteri cinsiydi. Cins içinde gözlenen geniş fenotipik ve genotipik varyasyon, yakın zamanda yeniden sınıflandırılmasına ve 23 yeni cinsin tanıtılmasına yol açmıştır.

Eski cins içindeki varyasyonların genişliği nedeniyle, bir üyede gösterilen protokoller diğer üyelerle ilan edildiği gibi çalışmayabilir. Belirli suşların tam olarak nasıl manipüle edileceğine dair merkezi bilgi eksikliği, genellikle diğer bakteri ailelerinden uyarlanan bir dizi geçici yaklaşıma yol açmıştır. Bu, hangi bilgilerin seçtikleri suş için geçerli olup olmadığını bilmeyen alanda başlayan araştırmacılar için sorunları karmaşıklaştırabilir.

Bu yazıda, özellikle Limosilactobacillus reuteri suşu tanımı F275'te (diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) başarı gösteren bir dizi protokolü, sorun giderme önerileri ve karşılaşılabilecek yaygın sorunlarla birlikte merkezileştirmeyi amaçlıyoruz. Bu protokoller, L. reuteri DSM20016 ile çalışma deneyimi çok az olan veya hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının bir plazmidi dönüştürmesini, dönüşümü doğrulamasını ve bir muhabir proteini aracılığıyla bir plaka okuyucusundaki sistem geri bildirimini ölçmesini sağlamalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lactobacillus cinsi tarihsel olarak gram-pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaeroblar veya öncelikle laktik asit1 üretmek için şekerleri parçalayan mikroaerofiller olarak sınıflandırılmıştır. Bu gevşek kriterler, Lactobacillus'un fenotipik ve genotipik olarak son derece çeşitli bir cins olmasına yol açtı. Bu geniş kategorizasyon, cinsin yeniden sınıflandırılmasına neden oldu ve 2020'de 23 yeni cins tanıtıldı2.

Eski, daha geniş cins, genellikle tüketim için güvenli (GRAS) olarak kabul edilen başlıca kommensal ve probiyotik türleri içeriyordu3. Lactobacillaceae ailesi, çeşitli suşların tüketimi yoluyla verilen birçok sağlık yararı nedeniyle halkın 'iyi bakteri' olma algısını sürdürmektedir 4,5,6,7. Gastrointestinal sistem8'de gezinme kolaylığı ve halkın kabulü, Lactobacillaceae suşlarını yutulabilir tıbbi, terapötik veya tanısal uygulamalar için şasi organizmaları kadar güçlü adaylar olarak konumlandırmak için birleşir.

Lactobacillaceae familyasında bulunan çok çeşitli özellikler, fiili model-organizma suşunun olmadığı bir duruma yol açmıştır; Araştırma grupları, kendi özel amaçlarıyla en alakalı özelliklere sahip türleri seçme eğilimindedir. (Örneğin, süt fermantasyon laboratuvarları L. lactis'i seçebilir; bitkisel fermantasyon çalışmaları L. plantarum'u seçebilir; probiyotikler üzerine yapılan araştırmalar L. acidophilus'a odaklanabilir; vb.)

Türler arasındaki bu aynı geniş özellik yelpazesi, Lactobacillaceae familyasının bir alt kümesi için iyi çalışabilecek, ancak diğerlerinde verimli bir şekilde çalışmak (veya belki de hiç çalışmamak) için optimizasyon gerektiren protokollerin ve prosedürlerin birikmesine yol açmıştır9. Aile üyeleri arasında ve hatta aynı türün üyeleri arasında bile optimizasyon ihtiyacı, yabancı araştırmacıların çabalarını boşa çıkarabilir. Makalelerin yöntemler bölümlerinde yayınlanan protokoller, parçalanmış, merkezi olmayan protokol koleksiyonlarına yol açan kendi modifikasyonlarını da içerebilir10.

L. reuteri, memeli, kuş11 ve balık12 gastrointestinal (GI) kanallarında tutarlı bir şekilde bulunan yaygın bir omurgalı kommensal olarak kabul edilir. L. reuteri alt suşları genellikle, mukus adezyon proteini adaptasyonu yoluyla, spesifik yerli konakçıları daha kalıcı olarak kolonize etmek için genetik olarak uzmanlaşmıştır 8,11,13. GI yolu Limosilactobacillus türleri, doğal konakçılarının dışındaki konakçılarda izole edilebilir, ancak geçici bir doğaya doğru daha fazla eğilimlidir8.

İnsan-konakçı uzmanlığı nedeniyle, L. reuteri DSM20016 kendisini insan GI kanalının herhangi bir noktasında tanısal veya terapötik uygulamalar için bir şasi olarak çok iyi konumlandırır ve gerinim DSM20016, daha geçici suşlara kıyasla müdahaleler için daha uzun süreli bir etki penceresi sağlayabilir.

Bu yazıda, Limosilactobacillus reuteri'de (suş tanımı: F275; diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) etkinliği kanıtlanmış bir dizi protokolün yanı sıra, moleküler ve sistem biyolojisi uygulamalarına yardımcı olmak için diğer kaynaklardan gelen suş hakkında merkezi bilgileri özetledik. Burada ortaya konan prosedürler, L. reuteri kültürüne daha önce hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının, elektroyetkin stoklar oluşturmasına, dönüştürülmüş kolonileri seçmesine, koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR ) yoluyla dönüşümü doğrulamasına ve floresan muhabir proteinleri aracılığıyla tasarlanmış sistem tepkisini ölçmesine olanak sağlamalıdır.

İlgili protokollerin L. reuteri'de (suş: ATCC-PTA-6475)14 CRISPR-Cas9 yardımlı ssDNA genom recombineringini ve çoklu L. reuteri'de CRSIPR-Cas9 nickaz destekli genom düzenlemesini kapsadığını not ettik. reuteri, Lactobacillaceae familyası lekeleri 15,16; ancak bunlar, burada odak noktamız olan L. reuteri DSM20016 suşu ele almamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. L. reuteri DSM20016 elektrokompetan hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu, Rattanachaikunsopon ve ark. tarafından bilgilendirilen santrifüjleme hızları ile Berthier ve ark.17 tarafından hazırlanan bir protokole dayanmaktadır.18.

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, L. reuteri'yi gliserol stoğundan 6 mL deMan Rogosa Sharpe (MRS) suyuna aşılayın. Statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
  2. Ertesi sabah, gece kültürünün 4 mL'sini 200 mL MRS suyuna (1:50 seyreltme) aşılayın.
  3. 600 nm optik yoğunluk değeri (OD600) 0.5-0.85'e ulaşana kadar statik bir 37 ° C inkübatörde aerobik olarak büyümesine izin verin; Bu yaklaşık 2-3 saat sürmelidir.
  4. Yeterli bir OD600 değerine ulaşılır ulaşılmaz, ortamı 50 mL santrifüj tüplerine boşaltın ve tüpleri dengelerken buzun üzerine yerleştirin.
  5. Önceden soğutulmuş, 4 °C santrifüjde 5.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  6. Süpernatanı atın, her bir pelet 50 mL önceden soğutulmuş (0 °C ila 4 °C) ddH2O'da tekrar askıya alın ve önceki adımla aynı ayarlarla tekrar santrifüj yapın. Hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
  7. 1.6. adımı yineleyin.
  8. Her bir pelet 25 mL ddH2O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın. 10 dakika boyunca 4 °C'de 5.000 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve hücreleri tekrar buzun üzerine koyun.
  9. Tüm peletleri aynı 2 mL ddH2O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın.
  10. Önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerinde 50 μL ila 100 μL porsiyonlara aliquot; Daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

2. L. reuteri'nin elektroporasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlarda mümkün olduğunca pipetlemeden kaçının. Antibiyotik seçiminin yeterli olmasını sağlamak için plazmid eklenmemiş bir kontrol elektroporasyonunun dahil edilmesi önerilir.

  1. Tüm elektroyetkin L. reuteri aliquot'u alın ve buz üzerinde çözün.
  2. 5 μL ila 10 μL plazmidi (nihai plazmid konsantrasyonu >6 nM) çözülmüş aliquot'a yavaşça karıştırın ve pipetlemeyi mümkün olduğunca önleyin.
  3. Buz soğutmalı, 1 mm boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın.
  4. 1,25 kV, 400 Ω ve 25 μF'de elektroporat.
  5. 1 mL oda sıcaklığında (RT) MRS suyu ekleyin ve küveti bir veya iki kez ters çevirerek karıştırın.
  6. İyileşmeyi sağlamak için küvetleri 2,5-3 saat boyunca 37 ° C'de statik bir inkübatöre yerleştirin.
  7. Tüm miktarı uygun seçimle birden fazla MRS agar plakasına plakalayın.
  8. Tabakları, küçük yanan bir mum ("çay ışığı") ve anaerobik atmosfer oluşturan bir poşet ile tamamen hava geçirmez bir kabın içine yerleştirin.
  9. 37 ° C'de 2-3 gün boyunca veya görünür koloniler bulunana kadar büyütün.

3. Aside dayanıklı floresan muhabir proteini mCherry2'nin ölçümü

  1. Ölçüm için gerekli kolonileri seçin ve kuyu başına 1,5 mL filtre sterilize (otoklavlanmamış) MRS suyu ve uygun bir seçim antibiyotiği içeren 96 delikli bir depolama mikroplakasına aşılayın.
  2. Gece boyunca 24 saat boyunca 37 ° C'de titremeden aerobik olarak inkübe edin.
    NOT: Bu depolama mikroplakası, bölüm 4'te (koloni PCR) kullanılmak üzere saklanmalıdır.
  3. L. reuteri , durağan fazdayken medyadan çökelecektir; pipetleme yoluyla gecelik kültürü yeniden askıya alın.
  4. 200 μL'yi düz, şeffaf tabanlı, 96 delikli bir plakaya aktarın, plakayı bir plaka okuyucuya aktarın ve mCherry2'nin (uyarma [Ex]: 589 nm; emisyon [Em]: 610 nm) veya diğer ilgili muhabirlerin OD ve floresansını ölçün.

4. Koloni PCR ile plazmid alımının doğrulanması

  1. Bölüm 3'teki 96 delikli depolama mikroplakasından, 5 μL'yi bir PCR tüpüne aktarın.
    NOT: >5 dakika geçtiyse, L. reuteri'yi ikinci kez askıya almak gerekebilir.
  2. Portatif bir tezgah üstü mikrosantrifüjde, pelet görülebilene kadar aşağı doğru döndürün (2.000 x g'de kabaca 2 dakika), süpernatanı atın ve peleti 20 μL'lik 20 mM NaOH'da yeniden askıya alın.
  3. 95 ° C'de 5 dakika kaynatın, vorteks yapın ve kaynatmayı ikinci kez tekrarlayın.
  4. Numuneleri hemen soğutun; Şablon bozulması ve PCR inhibisyonu olasılığını azaltmak için aşağıdaki adımlarda örnekleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutmaya çalışın.
  5. Hücre enkazı peletlenene kadar 2 dakika boyunca 2.000 x g'de taşınabilir bir tezgah üstü mikrosantrifüjde döndürün, ardından süpernatantın 1 μL'sini alın ve 99 μL buz gibi soğuk DNaz ve RNaz içermeyen ddH2O'ya (100x seyreltme) seyreltin.
  6. Plazmid-spesifik primerler kullanarak standart bir PCR reaksiyonunda şablon DNA olarak 100x seyreltmeyi kullanın. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
  7. Numuneleri buz üzerinde geri koyun ve 1x konsantrasyonda uygun bir yükleme boyası ekleyin.
  8. TAE tamponunda (tris-asetat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) 30 dakika boyunca 110 V'ta% 1 agaroz jeli içinde çalıştırın. Gerekirse görüntü.

5. L. reuteri için mini hazırlık protokolü, ardından plazmid varlığını doğrulamak için PCR

NOT: Protokol, Malzeme Tablosunda listelenen mini hazırlık kiti ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

  1. L. reuteri'yi uygun bir antibiyotik içeren 10 mL MRS suyuna aşılayın ve statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
  2. Önceden soğutulmuş 4 °C santrifüjde 10 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj.
  3. Pelet, sonraki adımlara müdahale edebilecek asitliği ortadan kaldırmak için 2 mL standart P1 tamponunda (kit ile birlikte verilir) yıkayın, daha önce tarif edildiği gibi aynı ayarla santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  4. Bakteri hücrelerini lize etmek için peleti 10 mg/mL lizozim ve 100 U/mL mutanolizin içeren 250 μL modifiye P1 tamponunda tekrar askıya alın. 37 ° C'de 1-2 saat inkübe edin.
  5. 250 μL tampon P2 ekleyin, dört ila altı kez ters çevirerek karıştırın ve RT'de 5 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
  6. 350 μL tampon N3 (kit ile birlikte verilir) ekleyin ve karıştırmak için hemen dört ila altı kez yavaşça ters çevirin.
  7. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
  8. Bir spin kolonuna mümkün olduğunca fazla süpernatant aktarın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
  9. Sıkma kolonunu 500 μL tampon PB (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
  10. Sıkma kolonunu 750 μL tampon PE (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Kalan tamponları gidermek için akışı atın ve 60 sn boyunca santrifüj yapın.
  11. Sıkma sütununu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Spin kolonunun filtresine 20-30 μL DNAse- ve RNAse-freeddH2O uygulayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapmadan önce 1-2 dakika bekletin.
  12. Plazmid-spesifik primerler (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) kullanarak standart bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin, eluate şablon DNA'yı sağlar. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan PCR ayarları şunlardır: 5 dakika boyunca 98 °C, (30 s için 98 °C, 30 s için 55 °C, 45 s için 72 °C) 30 döngü, 2 dakika boyunca 72 °C, 4 °C tutma. Parametreler, kullanılan polimeraz, parça uzunluğu ve bu protokolü kullanan herhangi bir kişi tarafından kullanılan kesin primerlere büyük ölçüde bağlıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dönüşüm verimlilikleri
L. reuteri, diğer Lactobacillaceae19,20 için gözlemlendiği gibi dcm-/dam- metillenmemiş plazmid gerektirmez (bkz. Şekil 1). L. reuteri DSM20016'nin 8.5 kb plazmid pTRKH3_mCherry2'nin 10 μL'si (replikasyonun pAMβ1 teta kökeni) ile elektroporasyonu, plazmid metilasyon durumundan bağımsız olarak, kabaca 80 koloni oluşturan birimin (CFU) / μg'nin ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L. reuteri DSM20016'nin dönüşümü için en kritik adım, dönüşümler kaplandıktan sonra anaerobik büyüme koşullarının oluşturulmasıdır; Aerobik koşullarda kazanılan koloniler sadece çok nadirdir ve MRS suyunda aşılandığında genellikle büyüyemez. Koloni büyümesi olasılığını en üst düzeye çıkarmak için tüm geri kazanım hacminin kaplanması da uygulanmalıdır. Bu iki kritik adımda bile, dönüşüm verimliliği hala deneyler üzerinde bir sınırlamadır, çünkü beklenen koloniler dönüşümler sırasında plaka başına bir veya iki kad...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L. reuteri ATCC PTA 6475 ile çalışma konusundaki rehberliği burada açıklanan yöntemler için bir temel oluşturan Prof. J.P. van Pijkeren (Wisconsin-Madison Üniversitesi) tarafından sağlanan değerli tavsiyeleri çok takdir ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA MerdiveniNEBN3200L
1mL Spektrofotometre küvetleriThomas Scientific1145J12
Agaroz BioShopAGR001
Allegra X-15R (soğutmalı santrifüj)Beckman Allegra N/A Artıküretimde değil
AnaeroGen 2.5 L PoşetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 elektroporasyon sistemiVWR58017-984
Santrifüj tüpleri (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA jeli x6 yükleme boyasıNEBB7024S
Elektroporasyon küvetiFisherbrandFB101
EritromisinMillipore SigmaE5389-5G
Jel elektroporasyon banyosu / dockVWR76314-748
Gliserol ve nbsp;BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Enstitüsü DSMZDSM20016Suş tanımı F275
LizozimBioShopLYS702.5
Mikrosantrifüj tüpleri (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kiti (Qiagen)Qiagen27106slpGFP, kurucu, kodon optimize edilmiş, mCherry2 muhabiri ile değiştirildi Protein 
MRS Et Suyu (Susuz)Thermo ScientificCM0359B
MutanolizinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetEppendorf3123000047
P1000 PipetEppendorf3123000063
P2.5 PipetEppendorf3123000012
P20 PipetEppendorf3123000039
P200 PipetEppendorf3123000055
PCR tüpleriFroggaBioSTF-A120S
Kişisel tezgah üstü mikrosantrifüjGenlantisE200100
Petri kaplarıVWR25384-088
PTC-150 Termal DöngüleyiciMJ ResearchN/AArtık üretimde değil
pTRKH3_slpGFP (değiştirilmiş)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpektrofotometreTermo Scientific840-281700
Depolama mikroplakasıFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Tampon 50xThermo ScientificB49
VorteksVWR58816-121Artık üretimde değil
VWR 1500E kuluçka makinesiVWRN/AArtık üretimde değil

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856(2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131(2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259(2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669(2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923(2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141(2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138(2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Limosilactobacillus ReuteriElectroporation ProtocolTransformation ConfirmationSynthetic Biology ChassisPlasmid TransformationGut Commensal BacteriaReporter Protein AssayGastrointestinal TractPlate Reader MeasurementTherapeutic Delivery

Related Articles