Method Article

Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması

DOI:

10.3791/65466

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Senkronize zaman serisi deneylerini analiz etmenin bir zorluğu, deneylerin genellikle senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan kurtarma uzunluğunda farklılık göstermesidir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler toplu olarak analiz edilemez veya kolayca karşılaştırılamaz. Burada, faza özgü karşılaştırmalara izin vermek için deneyleri hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünün araştırılması, genellikle, hücreler hücre döngüsünü geçerken bir zaman serisindeki çeşitli parametreleri ölçmek için hücre popülasyonlarının senkronize edilmesine bağlıdır. Bununla birlikte, benzer koşullar altında bile, tekrarlanan deneyler, senkronizasyondan kurtulmak ve hücre döngüsünü geçmek için gereken sürede farklılıklar gösterir, böylece her zaman noktasında doğrudan karşılaştırmaları önler. Deneyler arasında dinamik ölçümleri karşılaştırma sorunu, mutant popülasyonlarda veya senkron iyileşme süresini ve / veya hücre döngüsü periyodunu etkileyen alternatif büyüme koşullarında daha da kötüleşmektedir.

Daha önce, senkronize hücre popülasyonlarının senkronizasyondan nasıl salındığını ve hücre döngüsü boyunca nasıl ilerlediğini izleyen Hücre Döngüsü Senkron Kaybını Karakterize Etme (CLOCCS) adlı parametrik bir matematiksel model yayınladık. Modelden öğrenilen parametreler daha sonra deneysel zaman noktalarını senkronize zaman serisi deneylerinden normalleştirilmiş bir zaman ölçeğine (yaşam çizgisi noktaları) dönüştürmek için kullanılabilir. Yaşam çizgisi ölçeği, deneyin başlangıcından itibaren dakika cinsinden geçen süreyi temsil etmek yerine, senkronizasyondan hücre döngüsü girişine ve ardından hücre döngüsünün aşamalarına ilerlemeyi temsil eder. Yaşam çizgisi noktaları, senkronize edilmiş popülasyondaki ortalama hücrenin fazına karşılık geldiğinden, bu normalleştirilmiş zaman ölçeği, değişen periyotlara ve iyileşme sürelerine sahip olanlar da dahil olmak üzere deneyler arasında doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Ayrıca, model, farklı türler (örneğin, Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe) arasındaki hücre döngüsü deneylerini hizalamak için kullanılmıştır, böylece evrimsel benzerlikleri ve farklılıkları ortaya çıkarabilecek hücre döngüsü ölçümlerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsü boyunca ilerlerken senkronize hücre popülasyonları üzerinde yapılan zaman serisi ölçümleri, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden mekanizmaları araştırmak için standart bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8 . Senkron / serbest bırakma zaman serisi deneyleri arasında karşılaştırmalar yapabilme yeteneği, bu dinamik süreçleri anlamamız için hayati öneme sahiptir. Bulguları doğrulamak için yinelenen deneylerin kullanılması, sonuçların tekrarlanabilirliğine olan güveni artırabilir. Ayrıca, çevresel koşullar, mutantlar ve hatta türler arasındaki karşılaştırmalar, hücre döngüsü düzenlemesine ilişkin birçok yeni anlayışı ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, senkronizasyondan ve hücre döngüsü ilerlemesinin hızından kurtulmadaki deneyler arası değişkenlik, replikalar arasında veya değiştirilmiş hücre döngüsü zamanlamasına sahip deneyler arasında zaman noktasından zaman noktasına karşılaştırmalar yapma yeteneğini bozar. Bu zorluklar nedeniyle, replikalar genellikle tam zamanlı serilere dahil edilmez (örneğin, Spellman ve ark.4). Tüm zaman serileri için çoğaltmalar toplandığında, veriler toplu olarak analiz edilemez, bunun yerine analiz için tek bir çoğaltma kullanılır ve diğer çoğaltmalar genellikle ek rakamlara indirgenir (örneğin, Orlando ve ark.8). Ayrıca, farklı iyileşme veya hücre döngüsü ilerleme özelliklerine sahip deneyler arasında karşılaştırmalar yapmak zordur. İlgilenilen bir olay ile bir hücre döngüsü dönüm noktası (örneğin, tomurcuk ortaya çıkışı, S-fazı girişi veya anafaz başlangıcı) arasındaki daha küçük aralıkların ölçümleri, bu dönüm noktası olayları 1,2,3,9,10,11,12 izlenirse hataları azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, ince ama önemli farklılıklar bu geçici yöntemler kullanılarak tespit edilemeyebilir veya gizlenebilir. Son olarak, tek hücreli analizler, senkronizasyona veya hizalamaya13 güvenmeden hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmeye izin verir, ancak tek hücreli çalışmalarda büyük ölçekli ölçümler zor ve maliyetli olabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, senkronize popülasyonlarda yapılan zaman serisi ölçümlerinin analizine yardımcı olmak için Hücre Döngüsü Senkron Kaybının Karakterize Edilmesi (CLOCCS) modelini geliştirdik14,15. CLOCCS, senkronize hücrelerin hücre döngüsü aşamaları boyunca dağılımını, senkronizasyondan serbest bırakıldıkça ve hücre döngüsü boyunca ilerledikçe tanımlayan esnek bir matematiksel modeldir. Dallanma süreci çerçevesi, modelin, S. cerevisiae'de gözlemlendiği gibi, bölünmeden sonra anne ve kız hücrelerinin asimetrik niteliklerini hesaba katmasını sağlarken, S. pombe gibi fisyonla bölünen organizmalar için hala yararlıdır. Model, hücre döngüsü fazını belirtmek için çeşitli ölçüm türleri kümesinden girdiler alabilir. Zaman içinde tomurcuklanan hücrelerin yüzdesinin ölçümlerini içeren tomurcuklanan hücre döngüsü faz verilerini alabilir ve tomurcuklanmamış G1 fazı14,15'in dışındaki hücre sayısının tahmin edilmesine izin verir. Model ayrıca DNA içeriğini ölçen akış sitometrik verilerini de alabilir, böylece G1'den S'ye, S'den G2'ye ve M'den G115'e dönüm noktası geçişlerinin değerlendirilmesini sağlar. Floresan morfolojik belirteçler, hücre döngüsü fazını tanımlamak için de kullanılabilir. Miyozin halkalarının, çekirdeklerin ve iğ kutup gövdelerinin (SPB'ler) floresan etiketlemesi, hücre döngüsü fazını belirlemek için kullanılabilir ve bunlar CLOCCS model11'e dahil edilmiştir; ancak, bu ölçümler bu protokolde açıklanmayacaktır. Ek olarak, septasyon indeksi S. pombe14'ten gelen verileri modellemek için bir girdi olarak kullanılmıştır. Böylece, model çeşitli organizmalarda hücre döngüsü analizleri için kullanılabilir ve daha da genişletilebilir.

CLOCCS, giriş verilerinden çoklu parametrelerin (örneğin, tomurcuklanma yüzdesi, DNA içeriği) tam Bayes çıkarımına izin veren parametrik bir modeldir. Bu parametreler, senkronizasyondan kurtarma süresini, hücre döngüsü periyodunun uzunluğunu (anne ve yavru hücreler için ayrı ayrı tahmin edilir) ve hücrelerin her zaman noktasındaki ortalama hücre döngüsü konumunu içerir. Bu parametreler, popülasyondaki ortalama hücrenin davranışını temsil eder ve araştırmacının her zaman noktasını bir yaşam çizgisi noktası olarak ifade edilen bir hücre döngüsü konumuna haritalamasını sağlar. Yaşam çizgisi noktalarına dönüşüm, CLOCCS parametreleri lambda (λ) ve mu0 (μ0)14,15'e bağlıdır. λ parametresi, ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresine karşılık gelir. Bununla birlikte, anne-kız gecikmesi14,15 nedeniyle, bu hem anne hem de kız hücrelerini içeren tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodu değildir. CLOCCS ayrıca anne-kız gecikmesine karşılık gelen delta (δ) parametresini çıkarır ve böylece tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodunun hesaplanmasına izin verir. Son olarak, her deneme hücre döngüsü eşitlemesinden serbest bırakıldıktan sonra başladığından, eşitleme yönteminden kurtarmak için gereken süre0 μ CLOCCS parametresiyle temsil edilir. CLOCCS, giriş hücresi döngüsü faz verilerine bir model sığdırır ve daha sonra rastgele bir yürüyüş Markov zinciri Monte Carlo algoritması14,15 kullanarak bu parametreleri çıkarır. Birden fazla deneyi ortak bir hücre döngüsü yaşam çizgisi zaman ölçeğine eşleyerek, iyileşme süresinin veya hücre döngüsü dönemlerinin aynı olmadığı çoğaltmalar veya deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalar yapılabilir 8,14,15.

Senkronize popülasyonlar14,15,16,17 zaman serisi boyunca bir oranda senkronizasyonu kaybettiğinden, senkronizasyon kaybı oranındaki değişkenlik deneyler arasında nicel karşılaştırmaları da engelleyebilir. Popülasyonların yerini ve dağılımlarındaki varyansı tanımlayarak, CLOCCS senkronize kayıp oranlarındaki farklılıkları açıklar. Bu güçlü araç, deneyler arasında spesifik ve ayrıntılı karşılaştırmalara izin verir, böylece sadece replikalar arasında değil, aynı zamanda çevresel koşullar, mutantlar ve hatta önemli ölçüde farklı hücre döngüsü zamanlamasına sahip türler arasında da doğrudan ilgili karşılaştırmalar yapma yeteneği sağlar14,15.

Bu makalede, senkronizasyon/sürüm zaman serisi deneylerinden gelen verileri sığdırarak parametreleri tahmin etmek, verileri ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine eşlemek ve ardından çoğaltmalar veya deneyler arasında ilgili karşılaştırmalar yapmak için CLOCCS'yi kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yaşam çizgisi hizalaması, bu deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalara izin verir, bu da kopyaların toplanmasına ve karşılaştırılmasına ve farklı kurtarma zamanlamaları ve hücre döngüsü dönemlerine sahip deneyler arasında daha alakalı karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre döngüsü aşaması ve deneysel verilerin toplanması

  1. İstenilen senkronizasyon yöntemini kullanarak hücreleri hücre döngüsüne göre senkronize edin (örneğin, Leman ve ark.18'de tarif edildiği gibi santrifüj elütriasyonu veya Rosebrock 19'da tarif edildiği gibi çiftleşme feromon arresti; hem Leman hem de ark.18 ve Rosebrock 19 da senkronizasyondan serbest bırakma yöntemlerini içerir). Zaman serisi boyunca örneklemeye başlayın, zaman serisinin en az iki tam hücre döngüsü periyodu uzunluğunda olduğundan emin olun ve en uygun şekilde, hücre döngüsü başına en az 10 örnek toplayın. Her zaman noktasında, aşağıda açıklandığı gibi, hücre döngüsü faz verileri (tomurcuklanma veya akış sitometrisi) için bir örnek ve deneysel veriler için bir örnek toplayın.
  2. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü faz verileri olarak kullanıyorsanız, CLOCCS hizalaması için tomurcuklanma hakkında veri toplayın.
    1. Zaman serisi boyunca örnek. Her zaman noktası için, hücreleri toplayın ve Leman ve ark.18'de açıklandığı gibi, 200 μL soniklenmiş hücre kültürünü 200 μL fiksatif çözelti ile karıştırarak sabitleyin.
    2. Standart tomurcuklanma için, 40x hedefi ve bir hemositometre ile iletilen bir ışık mikroskobu kullanarak zaman noktası başına en az 200 hücre sayın. Hücre örneğini adım 1.2.1'den hemositometreye ekleyin ve yoğunluk saymayı engelliyorsa seyreltin. Her zaman noktasında tomurcuklanmış ve tomurcuklanmamış hücrelerin sayısını kaydedin. Tomurcuklanan hücrelerin yüzdesini hesaplayın ve tomurcuklanan bir eğrideki her zaman noktası için çizim yapın.
      NOT: Hücre döngüsü faz bilgilerini belirtmek için başka yöntemler de mevcuttur, ancak bunlar bu protokolde açıklanmamıştır. Diğer yöntemler CLOCCS benioku ve önceki bir çalışmadaaçıklanmıştır 11.
  3. Hücre döngüsü faz verileri olarak akış-sitometrik DNA içeriği verilerini kullanıyorsanız, akış-sitometrik CLOCCS hizalaması için akış sitometrisi DNA boyama verilerini toplayın.
    1. Zaman serisi boyunca örnek. Her zaman noktası için hücreleri toplayın ve Haase ve Reed20'de açıklandığı gibi düzeltin.
    2. DNA'yı lekeleyin ve standart akış sitometrik analizini kullanarak analiz edin. S. cerevisiae için önerilen bir boyama protokolü Haase ve Reed20'de açıklanmıştır.
  4. İlişkili omikleri veya ilgili deneysel verileri toplayın. Standart transkriptomik veriler için, Leman ve ark.18 ve Kelliher ve ark.21,22'de açıklandığı gibi toplayın. Aşağı akış hizalamasına izin vermek için verilerin hücre döngüsü faz verilerini içeren zaman noktalarıyla ilişkilendirildiğinden emin olun. En iyi hizalama için, deneysel veriler içeren her zaman noktasının kendisiyle ilişkili faz verilerine de sahip olduğundan emin olun.
    NOT: Deneysel veriler birçok biçimde olabilir. Geleneksel olarak, zaman serisi transkriptomik deneylerini hizalamak için açıklanan hizalama yöntemini kullanırız. Bununla birlikte, zaman noktalarıyla ilişkili her türlü veri hizalanabilir (yani, proteomik22).

2. Gerekli yazılımı yükleme

NOT: Bu bölümde Conda, Java 19 ve Git'in zaten yüklü olduğu varsayılmaktadır (Malzeme Tablosu).

  1. Terminale aşağıdaki komutu girerek CLOCCS_alignment deposunu indirin:
    git klonu git klonu https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. CLOCCS_alignment deposunun klonlandığı klasördeki terminale aşağıdaki komutu girerek conda_req.yml dosyasını kullanarak bir Conda ortamı oluşturun:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Deneyleri parametrelendirmek için CLOCCS kullanma

  1. CLOCCS_alignment deposundaki CLOCCS klasöründeki cloccs_v2023.jar dosyasına çift tıklayın ve grafik kullanıcı arabiriminin açılmasını bekleyin. Bu ekran, CLOCCS çalıştırması için giriş seçeneklerine izin verir ve çalıştırıldıktan sonra sonuçları görüntüler.
  2. Genel ayarları girin.
    1. İlişkili metin giriş kutularına yazarak Sim Anneal, Burn In ve Iterations'ı ayarlayın. Sim Anneal (simüle tavlama) iyi başlangıç parametre değerlerini tanımlar, Burn In arka modları arar ve son aşama tüm posterior çıkarımların çizilmesine izin verir. Daha yüksek değerler çalışma süresini artırır, ancak doğruluğu da artırır.
    2. Sıcaklığı Celsius cinsinden belirterek deneysel koşulları ve Sıcaklık etiketli metin kutusunu ve Synchro açılır menüsünü kullanarak senkronizasyon yöntemini girin. Yöntem, sırasıyla.
    3. İsteğe bağlı olarak, Gelişmiş Ayarlar menüsünde gelişmiş ayarları yapılandırın. Gelişmiş ayarlar, parametrelerin her biri için öncüllerin ayarlanmasına izin verir ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      NOT: Gelişmiş ayarlarla ilgili daha fazla bilgi CLOCCS_alignment deposunun CLOCCS klasöründeki benioku.txt bölümünde bulunabilir.
  3. Tomurcuklanan verilerle kullanmak için ayarları girin.
    1. Model Türü açılır menüsünden uygun seçimi yapın. Varsayılan seçenek Bud, tomurcuklanan maya için standart tomurcuklanma bilgileri içindir.
      NOT: Açılır menüde daha gelişmiş başka seçenekler de mevcuttur: Bölünme olmadan birden fazla tomurcuklanma döngüsüne giren mutantlar için tomurcuklanma bilgileri için Mutant, tomurcuklanma bilgileri ve ek iğ kutup gövdesi ve miyozin halkası bilgileri için BudSSLSMR ve tomurcuklanma bilgileri ve ek bölme ve tomurcuk boynu çekirdekleri bilgileri için BudNucDivNeck. Bu gelişmiş seçenekler CLOCCS benioku ve önceki çalışma11,14,15'te açıklanmıştır.
    2. Metin giriş kutularına yazarak veya Dosya Seç düğmesini tıklatarak bir dosya yükleyerek Veri İçe Aktarma panelini kullanarak verileri içe aktarın. İlk sütun zaman noktalarını belirtir. Kalan iki sütun tomurcuklanan verileri belirtir ve aşağıdaki seçeneklerden herhangi birini alabilir: tomurcuklanmamış hücrelerin sayısı (Tomurcuk Yok), tomurcuklanan hücrelerin sayısı (Tomurcuk) veya toplam hücre sayısı (Toplam).
  4. Akış sitometrik verileriyle kullanılacak ayarları girin. Her deneme için adım 3.3 veya adım 3.4'ü çalıştırın.
    NOT: Akış sitometrik verileri ve tomurcuklanma verileri birlikte kullanılabilir. Daha önce bunları birlikte çalıştırmayı15 olarak tanımlamış olsak da, bu araç için bağımsız olarak çalıştırılmaları ve daha sonra karşılaştırılmaları gerekir.
    1. Ek Dosya 1'deki (CLOCCS_alignment deposunda CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt olarak da bulunur) yönergeleri izleyerek .fcs dosyalarını akış sitometrisi için doğru CLOCCS giriş biçimine dönüştürün.
    2. Model Türü açılır menüsünden Akış seçimini seçin.
    3. Veri İçe Aktarma panelini kullanarak verileri içe aktarın. Dosya Seç'e tıklayın ve adım 3.4.1'de oluşturulan dosyayı seçin.
    4. Bir akış sitometrik CLOCCS'nin uyduğu zaman noktalarını, Takma Zamanları kutusundaki zaman noktalarını seçerek çizilmelidir.
  5. Tomurcuklanma veya akış sitometrisi için tüm girişler seçildikten sonra, Uygula düğmesine tıklayın ve ardından ekranın üst kısmındaki Örnek düğmesine tıklayın.
  6. Tahmin Edilen Uyumlar sekmesini seçerek tomurcuklanan eğriyi veya akış sitometrisi grafiklerini tahmin edilen uyumlarla görüntüleyin. Bu sekme varsayılan olarak önceki adımdan hemen sonra açılır.
  7. Parametre Histogramları sekmesini ve ardından aşağıdaki seçeneklerden ilgilendiğiniz parametreye karşılık gelen alt sekmeyi seçerek her parametre için parametre histogramlarını görüntüleyin: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, vb.
  8. Posterior Skor sekmesini seçerek posterior skor grafiğini görüntüleyin.
  9. Ayarları görüntüleyin ve Ayarlar sekmesini seçerek bunları daha da değiştirin; Günlük sekmesini seçerek önceki çalıştırmaların günlüğünü görüntüleyin.
  10. Arka Parametreler sekmesini seçerek CLOCCS parametrelerini sığdırmadan alın. Ortaya çıkan tablo aşağıdaki biçime sahip olacaktır: her satır bir parametreden oluşur ve son satır posteriordur. Sütunlar, ortalama için tahmin edilen parametreden, %2,5 daha düşük güven aralığından, %97,5 üst güven aralığından ve kabul oranından oluşur.
    1. Her deney için hizalama için kullanılan parametreleri kaydedin: senkronizasyondan kurtarma süresi (μ0) ve ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresi (λ).
    2. Ana hücre periyodunun (λ) ve kızı hücre periyodunun (λ + δ) ortalamasını hesaplayarak hücre döngüsü periyodunu hesaplayın, burada δ kıza özgü gecikmedir.
      NOT: Bölüm 3'ü, karşılaştırmalara dahil edilecek tüm deneylerle birlikte tekrarlayın.

4. Python dönüştürme işlevlerini ve CLOCCS parametrelerini kullanarak zaman noktalarının yaşam çizgisi noktalarına dönüştürülmesi

NOT: Zaman noktaları ve yaşam çizgisi noktaları arasındaki dönüşüm için iki dönüştürme formülü21 gerekir. Dönüştürme ve veri görselleştirme için bir Python uygulaması CLOCCS_alignment deposunda mevcuttur ve aşağıda açıklanmıştır.

  1. Terminale aşağıdaki komutu girerek Conda ortamını etkinleştirin: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Terminale aşağıdaki komutu yazarak etkileşimli bir Python not defteri açın: jupyter not defteri
  3. İstediğiniz klasörde yeni bir Python not defteri oluşturun.
    NOT: Standart kullanımı göstermek için örnek bir not defteri eklenmiştir ve CLOCCS_ hizalama deposundaki Alignment/JOVE_example.ipynb içinde bulunabilir.
  4. İlk hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak hizalama işlevlerini içeren Python dosyasını içe aktarın:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Hizalama/yardımcı programlar.py
    1. path_to_repo için CLOCCS_alignment deposunun yolunu değiştirin.
  5. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü aşaması verileri olarak kullanıyorsanız, yeni bir hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak her zaman noktasında tomurcuklanma yüzdesini içeren bir veri çerçevesini içeri aktarın:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep ="\t" öğesini kaldırın
  6. Tomurcuklanan verileri hücre döngüsü fazı verileri olarak kullanıyorsanız, aşağıdaki işlevi yeni bir hücreye girerek tomurcuklanan verileri bir yaşam çizgisi noktası zaman ölçeğine hizalayın:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, zaman noktaları, param_mu0, param_lambda)
    1. Zaman noktaları için, budding_df veri çerçevesinin dizini olacak zaman noktalarının bir listesini değiştirin.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, deney için bölüm 3'te çalıştırılan tomurcuklanan CLOCCS çalışmasından öğrenilen parametreleri değiştirin.
  7. Akış sitometri verilerini kullanıyorsanız, aşağıdaki komutu yeni bir hücrede çalıştırarak akış sitometri verilerini alın:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. flow_input_folder için, akış sitometrisi .fcs dosyalarını içeren klasörün uygun yolunu değiştirin.
  8. Akış sitometrisi verilerini kullanıyorsanız, aşağıdaki komutu yeni bir hücreye yazarak her deneme için zaman noktaları ve yaşam çizgisi noktaları arasında bir dönüşüm tablosu oluşturun:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(zaman noktaları, param_mu0, param_lambda)
    1. Zaman noktaları için, akış sitometrisi verilerindeki zaman noktalarının bir listesini değiştirin.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, deney için bölüm 3'te çalıştırılan akış sitometrisi CLOCCS'den öğrenilen parametreleri değiştirin.
  9. Yeni bir hücrede aşağıdaki komutu çalıştırarak deneysel verileri içeren veri çerçevesini not defterine alın:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep ="\t" öğesini kaldırın.
      NOT: Bu, herhangi bir tablo verisi için yapılabilir. Deneysel veriler, veri çerçevesinin sütunları veya dizini olarak zaman noktalarına sahip olmalıdır. Örnek veriler CLOCCS_alignment deposunda bulunabilir.
  10. Aşağıdaki işlevi yeni bir hücreye girerek deneysel verileri bir yaşam çizgisi noktası zaman ölçeğine hizalayın:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, zaman noktaları, param_mu0, param_lambda, interpolat, lowerll, upperll)
    1. Zaman noktaları için, dizin olarak zaman noktalarının bir listesini veya önceki adımdaki deneysel data_df sütunlarını kullanın.
    2. param_mu0 ve param_lambda için, bölüm 3'te CLOCCS'den elde edilen değerleri değiştirin.
      NOT: Parametreler, kabul edilen hücre döngüsü fazı veri türlerinden herhangi birinde gerçekleştirilen herhangi bir CLOCCS çalıştırmasından gelebilir.
    3. İsteğe bağlı olarak, True veya False ile interpolate yapın veya boş bırakın (varsayılan değer False'tur).
      NOT: False olarak ayarlandığında, veriler enterpolasyona tabi tutulmaz. Doğru olarak ayarlandığında, yaşam çizgisi noktaları, yaşam çizgisi noktaları arasındaki değerleri doldurmak için yuvarlanır ve enterpolasyona tabi tutulur, böylece yaşam çizgisi noktaları aralığında tamsayı başına bir nokta olur. Bu, veri kümeleri arasında daha iyi karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
    4. İsteğe bağlı olarak, lowerll ve upperll değerlerini None veya tamsayı değerleriyle değiştirin.
      NOT: Hiçbiri olarak ayarlandığında, enterpolasyondan sonraki tüm yaşam çizgisi noktaları korunur. Tamsayılar sağlandığında, bu durum verileri keser, böylece yaşam çizgisi noktaları alt seviyeden üst seviyeye kadar değişir. Bu, farklı bir alt veya üst alt ile veri kümeleri arasında karşılaştırmaya olanak tanır.
  11. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu girerek yaşam çizgisi hizalanmış veri kümesini indirin: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. 4.5-4.11 arasındaki adımları, karşılaştırmalara dahil edilecek tüm deneylerle birlikte tekrarlayın.

5. Tomurcuklanma eğrileri ile akış sitometri verilerinin karşılaştırılması

  1. Aşağıdaki komutu yeni bir hücreye girerek Python yardımcı programları işlevini kullanarak hizalamadan önce tomurcuklanan eğrileri çizin:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, başlık = str_title)
    1. list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3] için çizim yapmak üzere istenen tüm tomurcuklanan eğrilerin veri çerçevelerini içeren bir listeyi değiştirin.
    2. İsterseniz göstergenin [Deneme 1, Deneme 2, Mutant] etiketlerinin bir listesini leg_list yerine koyun. Değilse, Hiçbiri'ni hariç tutun veya yerine koyun.
    3. str_type yerine zaman koyun.
    4. İsterseniz str_title için Karşılaştırma Tomurcuklanan Eğriler dize başlığını değiştirin. Değilse, Hiçbiri yerine koyun veya hariç tutun.
  2. Adım 5.1'deki talimatları izleyerek Python yardımcı programları işlevini kullanarak hizalamadan sonra tomurcuklanan eğrileri çizin, ancak list_of_budding_curves yerine hizalanmış tomurcuklanma eğrilerinin bir listesiyle ve zaman yerine point_type için yaşam çizgisi ile.
  3. Akış sitometrisi verilerini çizmek için, adım 4.8'de oluşturulan dönüştürücüyü kullanarak .fcs dosyalarından ilişkili verileri karşılık gelen yaşam çizgisi noktalarında çizin.
  4. Dönüştürücü tablosunu kullanarak yaşam çizgisi noktalarını hücre döngüsü aşamasına dönüştürün (Tablo 1).
    NOT: Bu, adım 5.1'deki yönergeler izlenerek de çizilebilir, ancak zaman yerine point_type için faz ile.

6. Deneysel verilerin karşılaştırılması

  1. Çizgi grafiklerde çizilecek gen listesini, literatür bilgilerine veya araştırma için ilgilenilen genlere dayanarak belirleyin.
  2. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu yazarak orijinal, hizalanmış veya hizalanmış ve enterpolasyonlu veri çerçevesi üzerinde çizgi grafik karşılaştırmaları gerçekleştirmek için Python yardımcı programları dosyasında sağlanan plot_linegraph_comparison kullanın:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
    1. list_of_dfs için karşılaştırılacak deneylerin veri çerçevelerinin bir listesini değiştirin.
      NOT: Veri çerçeveleri hizalanmamış veya hizalanmış olabilir; ancak, karşılık gelen point_type adım 6.2.4'te girilmelidir.
    2. Her veri çerçevesinin başlık listesini, list_for_legend için veri çerçeveleri listesiyle aynı sırada değiştirin.
    3. Genlist için çizilecek gen adlarının bir listesini (veri çerçevelerinin dizinine dahil edilmesi gereken) değiştirin.
    4. Puan türünü str_type yerine koyun. Adım 6.2.1'de hizalanmış veri çerçeveleri için yaşam çizgisi (varsayılan, yaşam çizgisi noktası ölçeğidir) veya faz (hücre döngüsü fazı yaşam çizgisi ölçeği) veya adım 6.2.1'de hizalanmamış veri çerçeveleri için zaman kullanın.
    5. str_title yerine isteğe bağlı bir dize başlığı koyun.
  3. En iyi periyodik genleri belirlemek için literatürü veya algoritmaları kullanarak ısı haritasına dahil edilecek gen listesini belirleyin.
    NOT: Uygun ısı haritası karşılaştırmaları için, veriler adım 6.2'de hizalanmalı, enterpolasyonlu ve zaman ölçeği ayarlanmalıdır; Her deneme için aynı başlangıç ve bitiş yaşam çizgisi değerine sahip olmalıdır.
    1. En iyi periyodik genleri belirlemek için periyodiklik algoritmalarını çalıştırın23,24 veya gen listesini belirlemek için istenen alternatif yöntemleri kullanın (örneğin, literatür sonuçları).
    2. Yeni bir hücrede aşağıdaki komutu kullanarak bir .csv veya .tsv gen listesi dosyasını not defterine alın:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Uygun dosya yolunu ve dosya adını değiştirin. Dosya bir .csv dosyasıysa, sep="\t" öğesini kaldırın.
  4. Yeni bir hücreye aşağıdaki komutu yazarak hizalanmış, enterpolasyonlu ve faz hizalanmış veri çerçevesi üzerinde bir ısı haritası karşılaştırması yapmak için Python yardımcı programları dosyasında sağlanan işlev plot_heatmap_comparison kullanın:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
    1. list_of_dfs için karşılaştırılacak deneylerin hizalanmış veri çerçevelerinin bir listesini değiştirin.
    2. Her veri çerçevesinin başlık listesini, list_for_legend için veri çerçeveleri listesiyle aynı sırada değiştirin.
    3. Genlist için çizilecek gen adlarının bir listesini (veri çerçevelerinin dizinine dahil edilmesi gereken) değiştirin.
    4. str_title yerine isteğe bağlı bir dize başlığı koyun.
      NOT: Listedeki ilk veri çerçevesi, ısı haritasındaki genleri sıralamak için kullanılacak olan veri çerçevesidir. Genler, bu veri çerçevesi için ilk periyotta maksimum sıraya göre sıralanacak ve aynı sıra, listedeki sonraki veri çerçeveleri için kullanılacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokolde ve Şekil 1'deki iş akışında açıklanan adımlar, iki temsili karşılaştırmayı göstermek için beş hücre döngüsü senkronize zaman serisi deneyine uygulanmıştır: farklı senkronizasyon yöntemlerine sahip replikalar (çiftleşme feromonu ve santrifüj elütriasyonu18) ve dizileme platformları (RNA-dizileme [RNA-seq] ve mikrodizi) arasında ve deneysel koşullar arasında. S. cerevisiae ile çoklu deneyler yapılmış ve her deney için hücre döngüsü fazı ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, senkronize hücre popülasyonları üzerindeki zaman serisi deneylerinden elde edilen verileri daha doğru ve nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, her deneyi14,15 parametrelendirmek için tomurcuklanan veriler ve akış-sitometrik DNA içerik verileri gibi giriş hücresi döngüsü faz verilerini kullanan bir Bayes çıkarım modeli olan CLOCCS'den öğrenilen parametreleri kullanır. CLOCCS, her bir deneyin parametrelerini çıkarmak için giriş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. Campione ve S. Haase, Ulusal Bilim Vakfı (DMS-1839288) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01GM126555) tarafından finanse edildi. Ek olarak, yazarlar makale hakkındaki yorumları ve protokolün beta testi için Huarui Zhou'ya (Duke Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca Francis Motta (Florida Atlantik Üniversitesi) ve Joshua Robinson'a Java koduyla ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2x PBS. Leman 2014'te açıklanmıştır.
Fiksatif Çözelti için% 4 formaldehit
% 100 Etanol. Haase 2002'de açıklanmıştır.
Akış sitometrisi protokolü için
Githttps://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
MikroskobuHücreleri ve tomurcukları saymak için.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
Proteaz çözeltisiAkış sitometrisi protokolü için. Haase 2002'de açıklanmıştır.
RNAse Akış. Haase 2002'de açıklanmıştır.
SYTOX Yeşil Nükleik Asit LekesiInvitrogenS7020Akış sitometrisi boyama için. Haase 2002'de açıklanmıştır.
TrispH 7.5
Fiksatif Çözüm için .Akış sitometrisi fiksasyonu için CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git Akış Sitometresi. sitometrisi protokolü için bir çözüm

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronyTime Series AlignmentLifeline NormalizationCross Experiment ComparisonSynchronized Cell PopulationsCell Cycle PhaseFlow CytometryBudding YeastTranscriptomic DataProteomic Data

Related Articles