Bu protokol, hücresel dağılımını ve ışık stimülasyonuna tepkisini doğru bir şekilde izlemek için cAMP sensörlerinin ve optogenetik bir protein olan bPAC-nLuc'un transfekte edilmesini içerir. Bir nokta tarama sistemi kullanarak bir cAMP yanıt haritası oluşturmaya yönelik yenilikçi yaklaşım, farklı alanlarda optogenetik proteinlerle yapılan araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Işık Stimülasyon Izgarası Kullanarak Bir Optogenetik Proteinin Hücresel Dağılımının Haritalanması
Bu makalede
Özet
Özet
Amacımız, bir optogenetik proteinin hücresel dağılımını doğru bir şekilde izlemek ve belirli bir sitoplazmik konum içindeki işlevselliğini değerlendirmekti. Bunu başarmak için, hücreleri nükleer hedefli cAMP sensörleri ve laboratuvarda geliştirilen optogenetik proteinimiz, bakteriyel fotoaktive edilebilir adenilil siklaz-nanolusiferaz (bPAC-nLuc) ile birlikte transfekte ettik. bPAC-nLuc, 445 nm ışık veya lusiferaz substratları ile uyarıldığında, adenozin 3',5'-siklik monofosfat (cAMP) üretir. HC-1 hücrelerinin sitoplazması boyunca küçük ışıklı noktalardan (~ 1 μm2) oluşan bir ızgara / matris modeli oluşturmamıza izin veren bir nokta tarama sistemine bağlı bir katı hal lazer aydınlatıcı kullandık. Bunu yaparak, nükleer hedefli bPAC-nLuc'un dağıtımını etkin bir şekilde izleyebildik ve kapsamlı bir cAMP yanıt haritası oluşturabildik. Bu harita, bPAC-nLuc'un hücresel dağılımını doğru bir şekilde temsil etti ve ışık stimülasyonuna tepkisi, aydınlatılan noktadaki protein miktarına göre değişti. Bu yenilikçi yaklaşım, hücresel optogenetik proteinleri araştırmak için mevcut olan tekniklerin genişleyen araç setine katkıda bulunur. Dağılımını ve yanıtını yüksek hassasiyetle haritalama yeteneği, geniş kapsamlı bir potansiyele sahiptir ve çeşitli araştırma alanlarını ilerletebilir.
Giriş
Nörobilimlerde devrim yaratan bir araç olarak doğan optogenetik, artık büyüyen bir araştırma alanı ve dünya çapında birçok laboratuvar tarafından ve biyolojideki çeşitli araştırma alanlarında rutin olarak kullanılan yükselen bir teknolojidir. Çok yönlü bir optogenetik protein olan bPAC-nLuc'u, ışığa duyarlı bir adenilil siklazı (AC) Beggiatoa sp.'den (bakteriyel fotoaktive olabilen adenilil siklaz; bPAC) nanolusiferaz (nLuc)1,2,3'e kaynaştırarak geliştirdik. Mavi ışıkla uyarıldığında, bPAC ikinci haberci 3',5'-siklik adenozin monofosfatı (cAMP) üretir. nLuc, substratlarından birinin varlığında biyolüminesans üretebilen ve cAMP production4'ü aktive edebilen, yakın zamanda geliştirilmiş küçük bir lusiferazdır. Bu nedenle, bu optogenetik protein, kısa ışık darbeleri kullanılarak veya Furimazin veya diğer lusiferaz substratları ile sabit bir şekilde aktive edilebilir, bu da farklı cAMP sinyal modellerini taklit etmemize ve hücresel tepkileri değerlendirmemize olanak tanır (transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu, gen ekspresyonu, hücre proliferasyonu, göç, vb.). 2. haberci sinyallemedeki son gelişmeler, çok kısıtlı sitozolik bölgelerde meydana gelen olayların önemini vurgulamıştır (örneğin, cAMP yanıt elementi bağlayıcı protein (CREB) fosforilasyonu için endozomal cAMP üretimi veya aktive edilmiş T hücrelerinin nükleer faktörü için Ca2+ mikro alanları (NFAT) çekirdeğe translokasyon)5,6. Bu nedenle, canlı hücrelerde bu bölmelerden gelen sinyalleri değerlendirmek, taklit etmek ve engellemek için tutarlı ve sistematik stratejiler geliştirmek önemlidir. bPAC-nLuc'un farklı hücre bölmelerinde spesifik olarak aktive edilme yeteneğini göstermek için, hepatomdan türetilmiş bir hücre hattını (HC-1) nükleer hedefli bPAC-nLuc ve bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) cAMP sensörü olan H208 ile birlikte transfekte ettik (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). HTC serisinden türetilen HC-1 hücreleri, test edilebilir AC aktivitesinden yoksundur, bu da çok düşük bazal cAMP seviyelerine neden olur, bu da FRET sensörlerinin tam dinamik aralığından yararlanırken varsayılan cAMP üretimini ölçmek için ideal hale getirir7,8. Bir nokta tarama sistemine (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic) bağlı bir katı hal lazeri (445 nm, LDI-7, 89 Kuzey) kullanarak, tek tek hücreler içindeki çok küçük dairesel alanları veya noktaları (~ 1 μm2) sistematik olarak uyarmak için bir protokol açıklıyoruz. Nokta tarama sistemi, iki katlı bir mikroskobun arka portlarından birine bağlandı, bu da hücreleri uyarmamıza ve bağımsız bir ışık yolu aracılığıyla aynı anda FRET ölçümleri yapmamıza izin verdi. Bu protokolde, hücrelerin sitoplazmasının kapsamlı bir taramasını gerçekleştirmek için Rapp OptoElectronic tarafından stimülasyon sistemi ile birlikte sağlanan SysCon Geo yazılımının kullanıldığı bir yöntem sunuyoruz. Yaklaşım, hücreleri bir ızgara düzeninde uyaran bir dizi aydınlatma ayarlayarak bir cAMP yanıt haritası oluşturmayı içerir (Şekil 1).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. HC-1 hücre kültürü ve görüntüleme için hazırlık
- 10 cm'lik tabaklarda %10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 IU/L), streptomisin (100 mg/L) ve L-glutamin ile desteklenmiş ve 37 °C, %5CO2'de inkübe edilmiş HC-1 hücrelerini DMEM'de tutun %95 nemlendirilmiş havada.
- 1: 5 veya 1: 10 seyreltme kullanarak hücreler ~% 90 birleştiğinde hücreleri her 2-4 günde bir geçirin.
- Deneyden 2 gün önce cam lameller üzerine transfeksiyon için tohum hücreleri.
- Önceden ısıtılmış besiyeri ve PBS içeren bir doku kültürü başlığında steril koşullar altında çalışarak, besiyerini neredeyse birleşen bir hücre kabından aspire edin ve 5 mL PBS ile nazikçe yıkayın.
- PBS'yi aspire edin ve 1 mL tripsin ekleyin. Hücreler ayrılana kadar 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 4 mL ortamda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Hücre sayısını saymak ve hücre yoğunluğunu hesaplamak için bir hemositometre kullanın.
- Hücreleri 1.5 x 104 hücre / mL yoğunluğa seyreltin.
- 2 oyuklu bir tabakta poli-D-lizin kaplamalı 25 mm cam lamellere 6 mL hücre süspansiyonu pipetleyin.
- Hücreleri% 70 birleşene kadar bir inkübatörde yaklaşık 24 saat inkübe edin.
- 3 μL transfeksiyon reaktifi başına 0,25 μg NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 μg NLS-H208 DNA oranı ve fenol kırmızısı içermeyen Opti-MEM ortamında seyreltilmiş 2 μL P3000 reaktifi kullanarak üreticinin talimatlarını izleyerek bir transfeksiyon kiti kullanarak hücreleri transfekte edin.
- Tespit edilebilir seviyelerde cAMP.
üretmek için gerekli olan yeterli bPAC-nLuc ekspresyonuna izin vermek için hücreleri ~ 48 saat boyunca inkübatöre yerleştirin NOT: Gerekli minimum bPAC-nLuc ekspresyonu seviyesi, stimülasyon sisteminin gücüne ve stimülasyonun parametrelerine bağlı olarak değişecektir. - Görüntüleme için lameller üzerinde hücreler hazırlayın.
- Ortamı bir kuyudan aspire edin ve 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Bir çift forseps kullanarak lameli dikkatlice kaldırın ve görüntüleme odasına yerleştirin.
- Görüntüleme odasına fenol kırmızısı içermeyen 1 mL Opti-MEM ekleyin. Hücreler ayrıca HBSS veya başka herhangi bir fizyolojik floresan uyumlu çözelti içinde de görüntülenebilir.
2. Işık simülasyonu ve canlı hücre görüntüleme
- Karanlık bir ortamda hücre kültürü ve NLS-bPAC-nLuc eksprese eden hücrelerin manipülasyonunu gerçekleştirin. <500 nm dalga boylarına maruz kalmaktan kaçınmak için, 13 W kehribar rengi kompakt floresan ampul (Malzeme Tablosu) ile kırmızı bir güvenli ışık lambası (Malzeme Tablosu) kullanın.
- 6 satırlı çok LED'li ışık motoru (Malzeme Tablosu), emisyon filtre çarkı (Malzeme Tablosu), XY aşaması (Malzeme Tablosu), ORCA-Fusion Dijital CMOS kamera (Malzeme Tablosu) ve 100x/1.4 NA yağ objektifi (∞/0.17/FN26.5) ile donatılmış motorlu iki katlı bir mikroskopta (Malzeme Tablosu) deneyler yapın. Dijital mikroskopi yazılımını kullanarak görüntü yakalayın (Malzeme Tablosu). Bu kurulum, bir ZT458rdc dikroik filtre (Malzeme Tablosu) ile sağlanan bağımsız bir ışık yolu kullanarak hücreleri uyarabilir ve FRET ölçümlerini aynı anda gerçekleştirebilir.
NOT: Uyumlu bir sensörle eşzamanlı optogenetik stimülasyona ve FRET/yoğunlaştırıcımetrik görüntülemeye izin veriyorsa herhangi bir alım kurulumu kullanılabilir. - UGA - 42 Geosystem'i açın. Mikroskobu açın ve H208 FRET sensörü ile elde etmek için uygun parametrelerle ayarlayın. Edinme konfigürasyonu, FRET sensörünün ifade seviyelerine bağlı olacaktır. Tipik parametreler YFP/mScarletI için 40 ms simülasyon süresi, %15 LED gücü ve 0,5 Hz'dir.
- SysCon yazılımını ve mikroskobu kontrol eden görüntüleme yazılımını açın.
- Kamera penceresinde Kalibrasyon Sekmesini seçin ve optogenetik protein ile uyumlu lazer dalga boyunu seçin. bPAC-nLuc'u uyarmak için 445 nm'lik bir dalga boyu kullanın.
- Her kullanımdan önce sistemi kalibre edin. Bu önemlidir, çünkü kurulumdaki küçük değişiklikler ve hatta oda sıcaklığındaki (RT) değişiklikler stimülasyonun hassasiyetini değiştirebilir.
- Kamera penceresinde, Kamera sekmesini seçin ve hayal yazılımından edinmeyi başlatmak için seçeneğine tıklayın.
- Görüntü Görüntüleyici penceresinde, stimülasyon nesnelerinin konumlandırılmasına rehberlik edecek olan görüntüleme yazılımından alınan hücrelerin floresansının canlı veya önceki bir alımını görselleştirin.
- Deneye başlamadan önce tek bir hücrenin yanıt verme hızını hızlı bir şekilde değerlendirmek için Tıkla ve Çalıştır modunu kullanın.
- Sıra Yöneticisi penceresini kullanarak, yeni bir dizi oluşturmak için öğesini seçin.
NOT: Doğru sistem kalibrasyonunu doğrulamak için, Image Viewer (Görüntü Görüntüleyici) penceresinde çeşitli şekiller ve boyutlar çizin. Bunlar, hücrelere yansıtılan stimülasyon modellerine tam olarak karşılık gelmeli ve amaçlanan tasarımla doğru hizalamayı sağlamalıdır. - Görüntü Görüntüleyici penceresinde, dairesel stimülasyon nesneleri çizmek için soldaki araç çubuğunda bulunan Yuvarlak simgesini seçin.
- Birden fazla küçük özdeş daire oluşturun ve uyarılacak hücrelerin tüm sitoplazmasının homojen bir şekilde kaplanmasını sağlamak için bunları eşit olarak dağıtın.
- Dairesel stimülasyon nesnelerinin homojenliğini doğrulamak için her birine sağ tıklayın. Bir pencere açılacaktır; yarıçaplarını, konumlarını vb. incelemek için kullanın.
- Kullanılan hedefe ve hücrenin boyutuna bağlı olarak yarıçapı 1 ile 5 arasında ayarlayın.
- Dairelerin eşit aralıklarla yerleştirilmesine ve hizalanmasına yardımcı olmak için, Görünüm alt penceresindeki düğmesini kullanın. Ayrıca, düğmesini kullanarak kılavuzun özelliklerini ayarlayın.
- Eşit aralıklı dairesel stimülasyon nesnelerinin ızgarasının veya matrisinin hücreyi tam olarak kapladığından ve boyutunun (örneğin, 6 x 6 veya 10 x 10) hücrenin boyutuna göre belirlendiğinden emin olun. Herhangi bir hücresel olayı tetiklememesi gereken boş stimülasyon için bir kontrol olarak, hücrenin dışına yerleştirilmiş bazı daireler ekleyin.
- Görüntü Görüntüleyici penceresinde oluşturulan her nesne Zaman Çizelgesi penceresinde görünecektir.
- Nesne Zamanlaması alt penceresinde, her bir stimülasyon nesnesinin zamansal özelliklerini (başlangıç zamanı, süre, gecikme) yapılandırın.
- Lightsource alt penceresinde, her nesnenin dalga boyunu ve yoğunluğunu yapılandırın. Bu protokol için, her nesnenin aynı dalga boyunu kullandığından ve süre ve yoğunluk açısından aynı olduğundan emin olun. Başlangıç zamanı her nesne için farklı olacaktır ve aralarındaki gecikme, farklı uyarımların etkisinin üst üste bindirilmesini önlemek için beklenen sonuca bağlı olarak değiştirilebilir.
- Zaman Çizelgesi penceresinde, gerekirse her bir stimülasyon nesnesinin etkinleştirileceği sırayı değiştirin. Belirli bir deneye bağlı olarak stimülasyonları düzenli bir düzende (örneğin, soldan sağa, yukarıdan aşağıya) veya rastgele bir düzende yapılandırın.
- Sırayı sisteme yükleyin ve sistemin gerçekleştireceği dizi döngülerinin (çalıştırma) sayısını yapılandırın.
- Görüntüleme yazılımındaki ilgi alanlarını (ROI'ler) istenen konumlara yerleştirin.
- Mikroskopla floresan görüntüleri almaya başlayın ve UGA-42 penceresinde düğmesine basın.
3. Veri analizi
- Stimülasyon sistemi tarafından sağlanan yazılım, daha sonraki kullanım için dizilerin kaydedilmesine izin verse de, gerçek deney bilgilerini kaydetmez. Bu nedenle, konum, yoğunluk, süre, çalışma sayısı vb. parametreler dahil olmak üzere deney sırasında kullanılan stimülasyon noktaları ve dizileri ile ilgili tüm ayrıntıları titizlikle belgeleyin. Farmakolojik ajanlar veya spesifik çözeltiler gibi diğer ilgili deneysel koşulları belgeleyin.
- Deney sırasında, tüm hücreden veya hücreler içindeki belirli konumlardan floresan yoğunluğu değişikliklerini yakalamak için belirlenen ROI'leri görüntüleme yazılımına yerleştirin.
- ROI'lerin stimülasyon noktalarına göre konumlandırılmasına özellikle dikkat edin. Uyarılan alanların içinde veya uzağında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri ölçün. Deney sonrası ROI'lerin konumlarını ayarlayın ve görüntüleme yazılımını yalnızca ROI yoğunluk değerlerinin değil, deney sırasında elde edilen görüntülerin kaydedilmesine izin verecek şekilde sağlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1'de sunulan sonuçlar, yalnızca hücre çekirdeğine yöneltilen stimülasyonların ölçülebilir cAMP artışları oluşturabildiğini göstermektedir. Bu durum, NLS-bPAC-nLuc'un HC-1 hücrelerinin yalnızca nükleer kompartmanında eksprese edildiğini doğrulamaktadır. Bir optogenetik proteinin hücre içi dağılımını haritalamak için bu ızgara/matris deseni kullanılarak protein hassas bir şekilde stimüle edilebilir. Ek olarak, nükleer merkeze doğru gözlenen daha yüksek cA...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın amacı, bir optogenetik proteinin hücre içi dağılımını hassas bir şekilde izlemek ve belirli bir sitoplazmik bölme içindeki performansını değerlendirmekti. Ayrıca, bir optogenetik proteini eksprese eden hücreler üzerinde bir nokta tarama sisteminin kesin stimülasyon yeteneklerini de gösterdik. Bunu başarmak için, yüksek ekspresyon seviyelerine sahip ancak çekirdekle sınırlı çok sınırlı bir dağılıma sahip nükleer hedefli bir bPAC-nLuc kullandık. Sonuçlar, optogenetik proteinin hücresel dağılımına bağlı olarak...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından sağlandı ve R01 GM099775 ve GM130612 DLA'ya verildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 13 W Amber kompakt floresan ampul - Düşük Mavi Işıklar | Fotonik Gelişmeler | ||
| 3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6 satırlı çoklu LED Lümen Spektrumları X | Lümenkor | 6 hatlı çok LED'li ışık motoru | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Düzenli fetal sığır serumu | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Kapak camları: daireler | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 koyu kırmızı safelight filtresi 5.5 " | Kodak | 1416827 | Kırmızı safelight lambası |
| Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | 1x'e seyreltilmiş, ayarlanmış pH |
| LDI-7 | 89 Kuzey | ||
| L-Glutamin | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofektamin 3000 | Thermo Fischer | L3000001 | Transfeksiyon kiti |
| Olympus IX83 motorlu& iki katlı Mikroskop | Olympus | Motorlu iki katlı mikroskop | |
| Opti-MEM, fenol kırmızısı Thermo | Fischer | 11058021 | |
| ORCA-füzyon dijital CMOS kamera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Fosfat tamponlu çözelti (1x) | Lonza | 17516F | |
| Önceki emisyon filtre tekerleği ve filtre setleri | Prior Scientific, Inc. | Emisyon filtre tekerleği ve nbsp; | |
| Önceki Proscan XY aşaması | Önceki Scientific, Inc. | XY aşaması | |
| Slidebook 6 | Akıllı Görüntüleme Yenilikleri | Dijital mikroskopi yazılımı | |
| SysCon yazılımı | SysCon Yazılımı | Stimülasyon sistemi tarafından sağlanan yazılım | |
| UGA-42 Coğrafi | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA yağ objektifi (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dikroik | Chroma Technology Corp | BS, Dalga Boyu (CWL): 498 deniz mili |
Kaynaklar
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
