Yöntem makalesi

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

DOI:

10.3791/65472

⸱

14 Temmuz 2023

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çift iplikçik kopmaları (DSB'ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB'leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1'de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX'i içerir. Her iki protein de DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB'leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB'lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB'lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel1 gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB'lerin onarımı2'nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.

Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü3'ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB'lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX'tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)3 gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,DSB'leri 4,5'i onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR6 yerine NHEJ'nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1'in fosforile edilmiş formu, DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB'lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir 6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR8,9 sırasında DSB'lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.

Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür10'a göre tanımlamaya çalıştık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma Pisa Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmış, her donörden bilgilendirilmiş ve imzalı onam alınmıştır.

1. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumu

  1. Numunelerin hazırlanması ve mutajenik tedavi
    1. Antikoagülan olarak lityum heparin içeren kan toplama (örneğin, Vacutainer) tüplerinde sağlıklı yetişkin bireylerden venipunktur yoluyla tam kan örnekleri toplayın.
    2. Uygun kan örneği korumasını garanti etmek için, numune alımından sonraki 24 saat içinde prosedürü başlatın.
    3. Numunenin 300 μL'sini 4.7 mL tam ortam içeren bir tüpe ekleyin (% 0.5 penisilin-streptomisin,% 0.75 fitohemaglutinin,% 10 FBS daha önce inaktive edilmiş,% 88.75 RPMI 1640).
    4. Daha sonra bleomisin sülfatı 5 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin.
      DİKKAT: Bleomisin sülfat bir mutajendir. Cilt temasından ve solumaktan kaçının. Çözeltiyi hazırlayın ve numuneyi bir başlık altına ekleyin.
    5. Her numune için negatif bir kontrol ayarlayın (mutajen yokluğu).
    6. Tüpü 2 saat boyunca 37 ° C'de bir termostata yerleştirin.
  2. Fiksasyon
    1. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
    2. Süpernatantı aspire edin ve peleti vorteks ile yeniden askıya alın.
    3. Kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olmak için 5 mL hipotonik çözelti (500 mL deiyonize suda çözünmüş 2.87 g KCl) ve 400 μL pre-fiksatif çözelti (5: 3 asetik asit: metanol) ekleyin.
    4. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
    5. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için peleti oda sıcaklığında 5 mL metanol içinde en az 30 dakika boyunca yeniden askıya alın.
    6. Alternatif olarak, hücreleri kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
  3. Slayt hazırlama
    1. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
    2. Süpernatantı aspire edin ve peleti 3: 1 metanolün 5 mL'sinde yeniden askıya alın: asetik asit çözeltisi. Bu adımları bir kez daha yineleyin.
    3. Sonunda, çözeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de tekrar santrifüj edin.
    4. Pelet, pipeti kuvvetli bir şekilde askıya almak, yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytlara bırakmak ve havayla kurutmak için yeterli çözelti (0.5 mL) bırakarak süpernatantı tekrar aspire edin. Slaytları 4 °C'de saklayın.
  4. İmmünofloresan
    NOT: İmmünofloresan, hedefin kendisini bağlayan bir primer antikor ve hedef11'in lokalizasyonuna izin veren primere bağlanan bir floresan sekonder antikor kullanarak spesifik hücre hedeflerini tanımlamak için immünolojik bir yöntemdir. Bu durumda, birincil antikorlar olarak bir fare monoklonal anti-53BP1 (1:50) ve bir tavşan poliklonal anti-γH2AX (1:50) kullanılırken, ikincil antikorlar olarak sırasıyla AlexaFluor568 anti-fare (1:400) ve DyLight488 anti-tavşan (1:200) kullanılır.
    1. Slaytları iki kez 50 mL 1x PBS içinde 5 dakika boyunca kuplin kavanozda yıkayın (arka arkaya 16 slayt).
    2. Daha sonra bunları bloke edici çözeltide 30 dakika bekletin (10 mL FBS, 10 mL 10x PBS, 80 mL deiyonize su, 300 μL Triton-X).
    3. Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
    5. Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    6. 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
    7. Çekirdekleri boyamak için montajdan önce kapaklara DAPI ile 2,5 μL antifade çözeltisi ekleyin.
      NOT: Fok kinetiği değerlendirmek için, prosedür 1.1 ila 1.4 arasında tarif edilenle aynıdır, hücre hasadı ve ikili immünofloresansın 0 saatte, bleomisin tedavisinden 2 saat sonra ve daha sonra mutajeni çıkardıktan sonra, tedavi sonrası 4 saat, 6 saat ve 24 saatte gerçekleştirildiğini belirtmektedir.

2. Floresan mikroskobu ile analiz

NOT: "Floresan mikroskobu", bir görüntü oluşturmak için floresan kullanan herhangi bir mikroskopu ifade eder. Örnek, floroforlar tarafından emilen belirli bir dalga boyundaki (veya dalga boylarındaki) ışıkla aydınlatılır ve bu da daha uzun dalga boylarında ışık yaymalarına neden olur12. AlexaFluor568 ve DyLight 488, sırasıyla yaklaşık 568 ve 488 nm ışığı emer ve sırasıyla 603 ve 520 nm ışık yayar. Böylece, sırasıyla bir TRITC veya bir FITC filtresi kullanılarak kırmızı veya yeşil floresan olarak görülebilirler.

  1. Her slayttaki odakların varlığını 100x daldırma hedefi altında puanlayın (Şekil 1).
  2. Slayt başına 200 çekirdek puanlayın ve her çekirdekteki γH2AX/53BP1 odaklarının sayısını sayın.
  3. Ekspresyon sonuçları, puanlanan toplam çekirdek başına ortalama odak sayısı açısından ifade eder. Bunlar arasında hem γH2AX/53BP1 pozitif (en az bir floresan sinyali gösteren) hem de negatif (herhangi bir floresan sinyali göstermeyen) çekirdekler bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periferik lenfositlerin floresan mikroskop analizi ile elde edilen veriler, üç ana yönü değerlendirmemize izin verir: bleomisin tedavisinin, mutajenik etkisinden dolayı γH2AX ve 53BP1 odaklarının (ve dolayısıyla DSB'lerin) sayısını arttırmadaki etkinliği, her iki odağın da DSB'lerin bölgesinde ne ölçüde birlikte lokalize olduğu ve bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini tanımlamak için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler arasında hem γH2AX hem de 53B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.

İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bütünlüğünün korunması esastı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam kan bağışçılarına ve kan örneklerini alan tüm sağlık personeline teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AlexaFluor 568 keçi anti-fare IgG (&gama; 1)İnvitrojenA2112453BP1 ikincil antikoru
BleoprimSanofibleomisin sülfat (mutajen)
Penisilin-streptomisin çözeltisi Kültürortamı PBS için antibiyotiklerECB3001D
10XTermofisher14200075Fosfat tamponlu salin
FBSEurocloneEC20180LFetal Sığır Serumu immünofloresan için
Keçi tavşan önleyici IgG (H + L) DyLight 488 ConiugatedTermofisher# 35552& gama; H2AX ikincil antikoru
Fare anti-53BP1 monoklonal antikoruMerckMAB 380253BP1 birincil antikoru
Labophot 2NikonFloresan mikroskobu
P-histon H2AX (Ser139) tavşan antikoruHücre Sinyali# 2577ve gama; H2AX birincil antikoru
FitohemoaglutininTermofisiherR30852801kültür ortamının bileşeni
antifade reaktifiniuzatın#8961Karşı boyama için DAPI ile antifade çözeltisi
RPMI 1640EurocloneECB9006LKültür ortamı
Triton-X100SigmaT9284Noniyonik deterjan geçirgenlik
DAPI Hücre Sinyali ile altın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853(2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gamma H2AX53BP1 Odaklarnsan Lenfositleriift Zincir K r klarDNA Hasar Belirte leriBleomisin UygulamasOdak KantifikasyonuOnar m Kineti iKo lokalizasyon Analizi

İlgili makaleler