Yetişkin zebra balıklarında kaudal pedinkülün iskelet kası rejenerasyonunu incelemek için bir kriyoyaralanma modeli

Omurgalılarda, çeşitli dokuların hasarlı kısımları yaşam süresi boyunca homeostatik yenilenme ve restorasyona uğrar. Bu yenilenme ve restorasyon kapasitesi tipik olarak yetkin kök hücrelerin varlığına veya olgun hücrelerin proliferatif kapasitesine bağlıdır ^1,2. İskelet kası, uydu hücreleri ^3,4,5,6 olarak adlandırılan lokal kök hücrelerle ilişkili post-mitotik miyofiberlerden oluşur. Bu nedenle, bu doku, kesintiye uğramış süreklilik alanlarının verimli bir şekilde kapatılması veya küçük yaraların onarımı için hücresel kaynaklar içerir. Bununla birlikte, memeli iskelet kasındaki daha büyük hacimsel kayıpları genellikle fibroz⁷ gibi rejeneratif olmayan onarımlar izler. Hayvan modelleri, büyük ölçüde hasar görmüş organların yenilenmesini teşvik eden biyolojik mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.

Zebra balığı, yüksek rejeneratif kapasiteye sahip köklü bir model organizmadır. Yetişkin zebra balığı, kaudal yüzgecinin kesilmiş bir kısmını veya kalp ventrikülünün rezeke edilmiş tepesini ^8,9,10,11 yenileyebilir. Ek olarak, zebra balığı^{12,13,14,15'te} yüzgeç ve kalp rejenerasyonunu incelemek için daha önce bir kriyoyaralanma yöntemi uygulanmıştır. İç organlar söz konusu olduğunda, kriyoyaralanma yöntemi, organ bütünlüğünü bozmadan hücre ölümünü indükleme avantajına sahiptir, böylece fizyolojik koşulları taklit eder^16,17. Doku kalıntıları, yara iyileşmesi sırasında doğal açıklık ile parçalanır, bunu onarıcı süreçler izler. Ancak bu yöntemin iskelet kasına uygulanıp uygulanamayacağı henüz belirlenememiştir.

Balıklarda, yanal kas yapısı, yüzme sırasında gövdenin yan yana bükülmesini sağlar¹⁸. İskelet kasları, bağ dokusu ^5,19 ile ayrılan miyomerler adı verilen metamerik birimler halinde düzenlenir. Zebra balığı, lazer ablasyonu veya bıçak yarası^{20,21,22,23,24} gibi küçük doku bozulmalarından sonra kaslarını yenileyebilir^, ancak tüm miyomerlerin geniş yaralanmalardan sonra yenilenip yenilenemeyeceği bilinmemektedir. Bu bilgi boşluğu muhtemelen uygun bir yaralanma modelinin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Bu protokol, iskelet kasının çoklu miyomerleri kapsayan geniş yaralanmasını indüklemek için yeni bir yaklaşım oluşturur. Tarif edilen kriyoyaralanma yöntemi, miyofiberlerin önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir aletle hızlı bir şekilde dondurulması ve çözülmesine dayanmaktadır. Büyük hasara rağmen, balığın refahı ciddi şekilde bozulmadı. Tüm miyomerler restore edilebilir ve böylece bu çalışma yetişkin zebra balıklarında kas sistemi rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için yeni bir model sistemi sağlar.

Bu çalışma, ilgili tüm etik düzenlemelerle uyum içinde yürütülmüştür. Zebra balığı, Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA)²⁵ sayılı yönergelere uygun olarak yetiştirildi, yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Hayvan barınağı ve tüm deneysel prosedürler, İsviçre'nin Fribourg kentindeki kanton veterinerlik ofisi tarafından onaylandı.

1. Ekipman ve kurulum

1. Araştırma için aletler üretebilen teknik bir atölyede paslanmaz çelik bir kriyoprobun üretimini düzenleyin.
   NOT: Cihazın belirli boyutlara sahip bir tasarımını sağlayın (Şekil 1A).
2. İşlem sırasında probu tutarken donmayı önlemek için, tutamağı bir pipet ucuna yerleştirin ve bantla sarın.
3. Anestezi çalışma çözeltisi için bir beher, balıkları işlemek için bir kaşık, nemli bir sünger ve işlemden sonra balığın iyileşmesini sağlamak için sistem suyu içeren bir tank hazırlayın.
4. Her deneyden önce çalışma solüsyonunu taze bir şekilde hazırlayın. Çalışma çözeltisini hazırlamak için, bir beherdeki 100 mL sistem suyuna 4 mL Trikain stok çözeltisi ekleyin.
   NOT: Anestezi stok çözeltisi, 980 mL damıtılmış su içinde çözünmüş 4 g Trikainden oluşur. PH'ı 1 M Tris-HCl, pH 9 ile 7'ye ayarladıktan sonra, çözeltiyi damıtılmış suyla 1 L'ye kadar doldurun. Stok çözeltisi ışığa duyarlıdır ve 4 ° C'de kehribar bir şişede saklanmalıdır.

2. Kas kriyoyaralanma prosedürü

1. Probu en az 3 dakika boyunca sıvı azot içine batırarak işleme başlayın. Süngeri sistem suyunda ıslatın ve düz bir yüzeye yerleştirin.
2. Tek bir yetişkin zebra balığını Tricaine çalışma çözeltisine aktarın ve 1 dakika veya 2 dakika sonra balığa kaşıkla hafifçe dokunarak tepkisizliğini onaylayın. Balık hala reaktif ise, biraz daha bekleyin.
3. Uyuşturulmuş balığı ıslak süngerin üzerine yerleştirin. Kaudal pedinkülü anal yüzgecin arkasına, kaudal yüzgecin ön tarafına yerleştirin.
4. Kriyoprobu sıvı azottan çıkarın. Ucunda sıvı azot kalıntısı kalmadığından emin olmak için probu hafifçe sallayın.
5. Spatula kenarını kaudal pedinkül üzerine vücuda dik olarak yerleştirin (Şekil 1C). Probu basınç uygulamadan 6 sn boyunca bu konumda tutun (Şekil 1D).
   NOT: Kriyoprobun ağırlığı, cihaz ile doku arasındaki teması sağlamak için yeterlidir.
6. Kriyoprobu dokudan serbest bırakın ve balıkları sistem suyuyla tanka aktarın.
7. Anesteziden uyandıktan sonra nefes almaya ve yüzmeye devam ederken balıkları izleyin. Operküler hareketler 30 sn sonra gerçekleşmezse, hayvan kendi kendine solunuma başlayana kadar solungaçlara sistem suyunu pipetleyerek balıkları uyarın.
   NOT: Balık, kurtarma tankında birkaç dakika içinde yüzmeye devam etmelidir.
   NOT: İlerleyen günlerde, balıklar yüzme aktivitelerini izlemek için filme alınabilir (Video 1 ve Video 2). Video kaydından önce, kontrolü ve yaralı balıkları yarı saydam bir çiftleşme tankına aktarın ve en az 1 dakika boyunca alışmalarına izin verin.

3. Kaudal pedinkül toplama ve fiksasyon

1. 2 mL% 4 formalin veya sonraki tahliller, bir Petri kabı, forseps ve cerrahi makas için uygun olan başka bir fiksatif hazırlayın.
2. Balıkları, bölgesel veterinerlik ofisi tarafından verilen yasal izne göre kriyoyaralanmadan sonra seçilen bir zaman noktasında ötenazi yapın.
   NOT: Ötenazi, yaklaşık 10 dakika boyunca aşırı dozda trikain çözeltisi (300 mg / L) ile gerçekleştirilir. Solungaç hareketinin kaybı ve kuyruk yüzgeci sıkışma refleksi ölümü doğrular. Ötanazi zaman noktaları, rejenerasyon aşamasına göre seçilmelidir: örneğin, kriyoyaralanma sonrası 1 gün (dpci) ila yara temizliği için 3 dpcí'ye; kas rejenerasyonunun başlatılması için 3 DPCI'den 10 DPCI'ye; ilerleyen rejenerasyon için 10 DPCI'den 30 DPCI'ye; ve doku restorasyonunun tamamlanması için 30 dpci sonra. Bu nedenle, kas dejenerasyonu ve rejenerasyonunun farklı adımlarını ve biyolojik süreçlerini değerlendirmek için, kriyoyaralanmadan sonra balık gruplarının çeşitli zaman noktalarında ötenazi yapılması gerekir.
3. Ötanazi yapılmış balıkları deiyonize su içeren bir Petri kabına yerleştirin. Vücudun ön ve arka kısımlarından kaudal pedinküle doğru bir kesim yapmak için makas kullanın (Şekil 1E). Dokunun Petri kabının deiyonize suyunda kanamasına izin verin.
4. Kaudal pedinkülü toplayın ve forseps ile bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlanan fiksatif çözeltiye aktarın.
   NOT: Tüpleri dikkatlice birkaç kez ters çevirin ve gece boyunca 4 °C'de tutun.

4. Kaudal pedinkülün montajı

1. Sabit dokuyu 1x PBS'de bir rocker üzerinde 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, 4 ° C'de deiyonize suda önceden soğutulmuş% 30 sakkaroz içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirin. Mikrosantrifüj tüplerini 4 °C'de en az 24 saat dik konumda bırakın.
   NOT: Kaudal pedinkül, sakkaroz çözeltisinin üzerinde yüzecek ve doku dehidrate olurken batmaya başlayacaktır.
2. Bir gömme kalıbını 5 mm'lik bir O.C.T. montaj ortamı katmanıyla doldurun. Ortamdaki kaudal pedinkülü ayarlamak için forseps kullanın. Kalıbın altına yerleştirin ve enine veya koronal kesitler için yönünü ayarlayın (Şekil 1F).
3. Ortamın bir kutu kuru buz içinde donmasına izin verin. Doku istenen pozisyonda stabilize edilir edilmez, O.C.T. tamamen donmadan önce kalıbın geri kalanını doldurun. Kalıbı −80 ° C'de en az 1 saat saklayın.
   NOT: Bu koşullar altında, dokular aylarca saklanabilir.

5. Bölümlerin kriyostatla kesilmesi

1. Kesme kalınlığı 25 μm olan bir kriyostat oluşturun. Oda sıcaklığını -26°C'ye, numune sıcaklığını -24°C'ye ve kesme açısını 12°C'ye ayarlayın.
2. Dondurulmuş bloğu numune ile kriyostata yerleştirin ve bloğun dibine paralel kesmek için oryantasyonunu sabitleyin. Numuneye ulaşana kadar kesin ve ardından numune toplamayı kolaylaştırmak için bloğu kırpın.
3. Altı yapışma slaytı hazırlayın. Örneğin kopyalarını hazırlamak için slaytları ardışık sayılarla etiketleyin.
4. Kesmeye başlayın ve etiketli yapışma slaytlarındaki doku bölümlerini toplayın. Slaytlardaki bölümleri daha sonraki deneysel taleplere göre düzenleyin.
5. Slaytları oda sıcaklığında 1 saat kurumaya bırakın. Bunları -20 °C'de kapalı kutularda saklayın.
   NOT: Slaytlar bu durumda 1 yıla kadar güvenle saklanabilir.

Kriyoyaralanma sonrası balıkların izlenmesi
Miyomer kriyoyaralanmasının hayvanlar üzerindeki etkisini belirlemek için, kriyoyaralanma sonrası 1 gün (dpci) ve 5 dpci'de kontrol ve kriyoyaralı balıkların video kaydı yapıldı. Her grupta beş balık vardı. 1 dpci'de, kriyoyaralı balıklar daha az aktif olarak yüzüyorlardı, ancak dönme, evrişim veya denge azalması gibi anormal hareketler göstermiyorlardı (Video 1). Hayvancılık sisteminde, tanktaki konumları ve yiyecek alımı, yaralanmamış balıklarınkine benzerdi. Normal davranış, 5 dpc'deki videoda örneklendiği gibi sonraki günler boyunca devam etti (Video 2). Sonuç olarak, kaudal pedinkülün kriyoyaralanma prosedürü hayvanların refahını ciddi şekilde etkilememiştir.

Kaudal pedinkül kesitlerinin histolojik analizi
Yaralanmanın derecesini değerlendirmek için, 4 dpci'lik zaman noktası seçildi, çünkü bu, miyofiber döküntülerin yarada tamamen emildiği zamandır. Kriyoyaralanmanın vücudun dorso-ventral ve anterior-posterior eksenleri boyunca etkilerini analiz etmek için iki grup balık kullanıldı (yani, sırasıyla kaudal pedinkülün koronal ve enine bölümleri) (Şekil 1F).

Kesitler Anilin Mavisi, Asit Fuşin ve Turuncu G'den (AFOG) oluşan trikrom boyama ile analiz edildi. Bu reaktif kombinasyonunu kullanarak, sağlam kaslar turuncu, omurilik koyu kırmızı ve kollajenöz matriks mavi renkte gösterilmiştir. Balık kas sisteminin metamerik birimleri olan hasarlı miyomerlerin sayısını belirlemek için bir dizi kesit analiz edilmiştir (Şekil 2). Miyokommata adı verilen miyomer sınırları, mavi renklenme ile tespit edildiği gibi kollajen birikimi ile tanımlandı. Hasarlı bölgeler turuncu lekelenmenin olmaması ile belirlendi. Belirgin miyokomatalı örneklerin daha yakından incelenmesi, portakal lekelenmesinin olmamasından çıkarıldığı gibi, yaklaşık dört ardışık miyomerin hasar gördüğünü ortaya koymuştur (n, balık sayısı = 4; Şekil 3A,A'). Aynı balığın yaralanmamış tarafı iç referans olarak görev yaptı.

Vücut eksenine dik yaranın derinliğini incelemek için zebra balığı kullanılarak 4 dpci ve 7 dpci'de enine kesitler hazırlandı. İkinci zaman noktası, miyojenik programın aktivasyonuna ve dolayısıyla kas yenilenmesinin başlangıcına karşılık gelir. Bu örneklerin AFOG boyaması, vücudun kriyoyaralı kanadında dejenere iskelet kası bölgesini sınırlayan geniş bir turuncu boyama eksikliği gösterdi (Şekil 3B, C). 4 dpci ve 7 dpci'de, yara alanı dokuları deriden dikey septuma doğru genişletti. Bu, kriyoyaralanma yönteminin, işlemden sonraki 7 gün boyunca fonksiyonel kastan yoksun kalan kaudal pedinkülün lateral bir yarısını derinden hedef aldığını göstermektedir. Birlikte ele alındığında, kaudal pedinkülün bir tarafında dört miyomer derinden hasar gördü.

Enine kesitlerin immünofloresan analizi
Kas rejenerasyonunun dinamiklerini değerlendirmek için, deney balık grupları 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci ve 30 dpci'de ötenazi yapıldı. Kaudal pedinkülün enine kesitleri, Phalloidin (filamentli aktin'e [F-aktin] bağlanan), bir sarkomer proteinini tespit eden Tropomiyosin-1 antikoru ve çekirdekleri etiketleyen DAPI kullanılarak çok renkli floresan boyama ile etiketlendi. Tüm zaman noktalarında, vücudun yaralanmamış yarısı bir iç kontrol sağladı; Hem F-aktin hem de Tropomiyosin 1, yaralanmamış kontrol parçalarında güçlü bir şekilde tespit edildi ve bu da hasarsız dokuya işaret ediyordu (Şekil 4).

4 dpci'de, kaudal pedinkülün yaralı tarafı bol miktarda DAPI-pozitif hücre içeriyordu, ancak çok az F-aktin ve Tropomyosin 1 immünofloresan gözlendi, bu da dejenere kaslara sahip yara bölgesini gösteriyordu (Şekil 4A-B'). 7 dpci'de, Tropomiyosin 1 ve F-aktin, yaranın dikey vücut orta hattına yakın bir kısmında tespit edilebilir (Şekil 4C-D'). Bu ekspresyon paterni, kaudal pedinkülde yeni miyoliflerin oluşumunun başladığı konumu sınırlar. 10 dpci'de, her iki kas belirteci de vücudun yüzeyine doğru genişledi ve iskelet kasının ilerleyen rejenerasyonunu düşündürdü (Şekil 4E-F'). 30 dpci'de, vücudun her iki tarafı da benzer bir F-aktin boyama dağılımı gösterdi (Şekil 4G-H'). Bu bulgu, iskelet kasının kaudal pedinkülün kriyoyaralanmasından sonra etkili bir şekilde restore edildiğini göstermektedir.

Şekil 1: Miyomer kriyoyaralanması için deney düzeneği. (A) Paslanmaz çelikten imal edilmiş özel üretim kriyoprobun boyutları. Cihazın distal kısmı, zebra balığı gövdesinin eğriliğini hesaba katmak için 1 mm derinlikte içbükey kenarlı bir spatula oluşur. Aletin orta kısmı, prosedür sırasında spatula'nın düşük sıcaklığını korumak için ağırlık ve rezervuar olarak işlev gören bir silindirden oluşur. Cihazın proksimal ucu ince bir metal sap şeklindedir. (B,C) Yetişkin balıkları, kaudal pedinkül üzerindeki kriyoprob ile nemli bir sünger üzerinde uyuşturulmuş. Sonda oda sıcaklığındaydı. (B) Probun kenar boşluğu, balık ile alet arasındaki nispi büyüklüğü göstermek için kaudal pedinkülün yakınına yatay olarak yerleştirilir. (C) Kriyoyaralanma için, aletin ucu balığa dik olarak yerleştirilir. (D) Manipülasyonları kapsamlı bir şekilde göstermek için balığın ventral tarafından kriyoyaralanma prosedürünün şematik gösterimi. Kriyoprob sıvı azotta önceden soğutuldu ve hemen 6 s boyunca balığın bir tarafına yerleştirildi. (E) Kriyoyaralanmadan sonra belirli bir zaman noktasında, balıklar ötenazi yapıldı ve kaudal pedinkülleri fiksasyon için toplandı. (F) Sabit malzeme histolojik olarak işlendi ve koronal veya enine düzlemler boyunca bölümlere ayrıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kaudal pedinküldeki hasarlı miyomerlerin dorsaldan vücudun ventral pozisyonuna kadar histolojik analizi. Kriyoyaralanma sonrası 4 gün içinde bir dizi koronal kesitin AFOG boyaması (dpci). Bölümler, ilk ve son panelin üstünde belirtildiği gibi, dorsaldan ventral tarafa doğrudur. Kesitler bitişik değildir ve aralarında yaklaşık 150 μm aralık vardır. Yaralanmamış kas, kasın turuncu boyanmasıyla tespit edilirken, yaralı doku bu lekelenmeden yoksundur ve grimsi görünür (kesikli bir çizgiyle çevrili alan). Cilt gibi kollajen içeren dokular mavi renkte boyanır. Omurilik çubuk benzeri bir yapı olarak görünür ve kırmızıya boyanır. Balık sayısı, n = 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AFOG boyama kullanılarak kaudal pedinküldeki yaralanma derinliğinin değerlendirilmesi. (A,A') Koronal bölüm omurilik seviyesindedir (kırmızı lekeli yatay çubuk). Alttaki görüntü, üst görüntüdeki bir çerçeveyle çevrili büyütülmüş bir alanı gösterir. Sıralı miyomer sınırları, omuriliğe eğik olarak yerleştirilmiş kollajenöz çizgiler (mavi) olarak görünür (büyütülmüş görüntü A'daki kırmızı oklar). (B,C) Kesitler, turuncu lekeli kaslara sahip yaralanmamış kanadı ve grimsi lekeli kriyoyaralı kanadı gösterir. Hasarlı alan siyah kesikli bir çizgiyle çevrilidir. Dikey septum (kırmızı kesikli bir çizgi ile tasvir edilmiştir) vücudu kontrol ve kriyoyaralı taraflara böler. Balık sayısı, n = zaman noktası başına 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kriyoyaralanma sonrası kas proteinlerinin immünofloresan tespiti. 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci ve 30 dpci'deki enine kesitlerin sol tarafında ve panelin üst kısmında (A-B') etiketlendiği gibi floresan boyaması. 4 dpci'de, yaralı doku (kesikli çizgiyle çevrili) DAPI-pozitiftir (mavi), ancak Phalloidin boyamasından (yeşil) veya Tropomyosin-1 immünoreaktivitesinden (kırmızı) yoksundur, bu da kriyoyaralanma sonrası kas liflerinin dejenerasyonunu düşündürür. (C-D') 7 dpci'de, her iki kas belirteci de yaralı bölgede aşamalı olarak ortaya çıkar ve rejeneratif süreci gösterir. Tropomiyosin-1, yeni oluşan liflerde F-aktin'den daha yoğun görünür. (E-F') 10 dpci'de, yaralanma bölgesi, F-aktin'e kıyasla daha yüksek yoğunlukta Tropomyosin-1 immünoreaktivitesi gösteren yeni miyofiberlerle doldurulur. (G-H') 30 dpci'de, vücudun her iki tarafında da benzer bir miyofiber paterni tespit edilir. A, C, E ve H panellerindeki çerçeveler, sağdaki bitişik görüntülerde büyütülen alanları kapsar. Miyomerin dışında floresan yayan dermal ölçekler, Adobe Photoshop kullanılarak görüntülerden silindi. Balık sayısı, n = zaman noktası başına 4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.