Yükleme Yüzeyinin Gömülmesi ile Fare Lomber Vertebra Tek Eksenli Kompresyon Testi

Yaşa bağlı kemik değişiklikleri, bu değişikliklerle ilişkili kemik kırığı riskinin artması nedeniyle yaygın olarak sorunlu olarak kabul edilmektedir. İnsanlarda kemik kırıkları kronik ağrıya, hareket kabiliyetinin azalmasına, uzun süreli sakatlığa, ölüm riskinin artmasına ve ekonomik yüklere yol açabilir¹. Yaşa bağlı kemik değişikliklerinin semptomlarını ele almak için araştırılan yaygın tedaviler arasında diyet takviyeleri, hormon tedavileri ve^ilaçlar 2,3,4,5,6,7,8,9 bulunur. İnsan denekler için bu tür tedavilerin ilk araştırmaları, genellikle insan iskeletinde bulunan iki ana kemik tipine sahip olan küçük hayvan modelleri (örneğin, laboratuvar fareleri ve fareler) kullanılarak yapılır¹⁰. Humerus, femur ve tibia gibi apendiküler uzun kemikler kortikal (yani kompakt) kemik açısından zengindir, omurlar ise süngerimsi kemik (yani dokuma, süngerimsi veya trabeküler kemik) açısından ^zengindir4. Kemik regülasyonu ve sinyal yollarının mekanizmalarının kortikal kemik (örneğin, uzun kemik orta diyafiz) ve süngerimsi kemik (örneğin, vertebral merkez) arasında farklılık gösterdiğine dair artan bilgiler ^vardır2. Bu nedenle, tedavilerin aynı kemik içinde kemiğe özgü ve hatta bölgeye özgü farklı etkileri olabilir ^2,3,4.

Bir cisme (örneğin kemiğe) kuvvet uygulanması, cismin sınır koşullarına bağlı olarak cismin ivmeye, deformasyona veya her ikisine birden uğramasına neden olur. Kemik kısıtlandığında, eşit büyüklükte zıt bir kuvvet kemiğin hızlanmasına direnir ve deformasyon meydana gelir. Kemik deformasyonu sürdürürken, stres adı verilen iç direnç üretilir ve bunun iki temel türü vardır: Gerilim veya sıkıştırma şeklinde normal kuvvet ve kesme kuvveti¹⁰. Genellikle, uygulanan kuvvet sistemine¹⁰ bağlı olarak temel stres türlerinin bir kombinasyonu üretilir. Bir malzemenin gücü, bozulmadan strese dayanma yeteneğidir. Bir malzemeye giderek daha büyük kuvvetler uygulandıkça, sonunda kalıcı deformasyona uğrar, bu noktada elastik bir durumdan (yani, kuvvet kaldırılırsa orijinal şekline geri döneceği) plastik bir duruma (yani, kuvvet kaldırılırsa orijinal şekline geri dönmeyeceği) geçtiği ^söylenir.11. Elastik halden plastik hale geçişin gerçekleştiği noktaya akma noktası denir. Malzemeye akma noktasının ötesinde daha da büyük kuvvetler uygulandıkça, toplam kırılma meydana gelene kadar mikro kırıkları (yani hasarı) giderek daha fazla sürdürür; Bu noktada, malzemenin ^11,12'de başarısız olduğu söyleniyor. Bir kemiğin kırılması hem yapısal düzeyde hem de doku^{düzeyinde 10} yetmezliği temsil eder. Örnek olarak, bir vertebral kemiğin kırılması, yalnızca çoklu trabeküllerin yapısal düzeyde başarısız olması değil, aynı zamanda doku düzeyinde bireysel bir trabekülde kollajen ve hidroksiapatit kristalleri gibi hücre dışı matris elemanlarının da başarısız olması nedeniyle meydana gelir.

Bir malzemenin arızalanmasına yol açan mekanik olaylar, çeşitli test yöntemleri kullanılarak ölçülebilir. Üç noktalı bükme, apendiküler iskeletten uzun kemiklerin mekanik özelliklerini test etmek için yaygın bir yöntemdir. Bu yöntem basit ve tekrarlanabilirdir, bu da onu birçok araştırmacı için tercih edilen biyomekanik test yöntemi haline getirir¹³. Bu yöntem, iki alt destek kirişi üzerinde duran uzun bir kemiğin orta diyafizinin üzerine bir çaprazkafa kirişi indirerek, yoğun bir şekilde organize edilmiş kortikal kemik olan orta diyafiz bölgesinin mekanik özelliklerini spesifik olarak test eder. Yük-yer değiştirme eğrilerinden, diğer özelliklerin yanı sıra elastikiyet, tokluk, kırılmaya kadar olan kuvvet ve kemik malzemelerinin elastikten plastik davranışına geçiş üzerindeki çekme kuvveti etkileri belirlenebilir.

Trabeküler, süngerimsi, dokuma veya süngerimsi kemik olarak adlandırılan ikinci kemik tipinde, kemik elemanları trabekül adı verilen bir dizi çubuk ve kiriş halinde oluşturulur ve "süngerimsi" bir görünüm verir. Ana vertebral cisimler (yani centra) süngerimsi kemik açısından zengindir ve genellikle insanlarda yaşa bağlı kompresyon kemiği kırıklarının bölgeleridir¹⁴. Bel (yani bel) omurları en büyük omurlardır, vücudun ağırlığının çoğunu taşır ve omur kırıklarının en yaygın olduğu yerdir^15,16. Eksenel kompresyon, in vivo vertebral kolonlara uygulanan normal kuvvet yükü olduğundan, omur gövdelerinin mekanik özellikleri en iyi şekilde tek eksenli kompresyon testi yöntemleri kullanılarak doğrudan değerlendirilebilir ¹⁷. Omurga cisimciklerinin in vivo sıkışması, kas ve bağ kasılmaları, yerçekimi kuvveti ve yer reaksiyon kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkar¹⁸.

Küçük hayvan omurlarının ex vivo kompresyon testi, küçük boyutları, düzensiz şekilleri ve kırılganlıkları nedeniyle zor olabilir. Vertebra cisimlerinin şekli, hafif ventral eğim ve hafif kraniyal içbükeylik¹⁷ ile bir paralelkenar olarak tahmin edilebilir. Bu şekil, ex vivo tek eksenli sıkıştırma testine ulaşmak için zorluklar sunar, çünkü yükleme yüzeyine yeterli hazırlık yapılmadan, yükleme yüzeyinin sadece bir kısmına basınç kuvvetleri uygulanacak ve bu da "yerel temas" ile ^{sonuçlanacaktır17,19}. Bu, tutarsız sonuçlara ve erken başarısızlığa neden olabilir¹⁹. İn vivo durum böyle değildir, çünkü yükleme yüzeyi vertebral eklemlerde intervertebral disklerle çevrilidir, bu da yükün kraniyal uç plaka boyunca dağıtılmasına izin verir. İntervertebral disk-kraniyal uç plaka kompleksi, vertebral gövde boyunca kuvvet uygulanmasında ve vertebral gövdeye kırık biyomekaniğinde önemli bir rol oynar^14,20. Kompresyon testi biyoloji alanında yeni olmasa da, kemiklerin mekanik testlerinin mevcut yöntemlerinde sınırlamalar vardır. Bu sınırlamalar, kemik mekaniği için öngörücü modellerin ve simülasyonların eksikliğini, benzersiz geometrik uzamsal mimariyi ve hatta doğal örneklem tabanlı biyolojik varyasyonları içerir²¹. Daha da önemlisi, bu alan, yöntemler arasında standardizasyon eksikliği ve literatürde rapor edilen yöntemlerin genel eksikliği ile karşı karşıyadır²².

Tek eksenli kompresyon testi elde etmek için kemirgen bel omurlarının hazırlanması için literatürde bildirilen iki yöntem vardır: kesme yöntemi ve gömme yöntemi 17,19,23,24,25,26. Kesme yöntemi, vertebral süreçlerin, kraniyal uç plakanın ve kaudal uç plakanın omur gövdesinden kesilmesini gerektirir. Pendleton ve ^ark.19 daha önce bu yöntemin fare bel omurlarında kullanımı için ayrıntılı bir yöntem bildirmişlerdir. Bu yöntem, hem kaudal hem de kraniyal uç plakalarında mükemmel paralel kesimler elde etmenin zorluklarını ortaya koyarken aynı zamanda numuneye herhangi bir zarar gelmesini önler. Ayrıca kraniyal uç plakanın çıkarılması sınırlaması vardır. Kraniyal uç plakası yoğun bir kortikal kemik kabuğu içerir ve intervertebral disklerden in vivo yüklerin dağıtılmasında önemli bir rol oynar ve in vivo kırıklar için kemiğin yetmezliğinde rol oynar 17,20,27. Buna karşılık, gömme yöntemi, omur gövdesinin kraniyal uç plakasını sağlam tutarken vertebral süreçlerin çıkarılmasını içerir. Yükleme yüzeyi daha sonra omur gövdesinin kraniyal ucuna az miktarda kemik çimentosu yerleştirilerek yaklaşık olarak yatay hale getirilir. Bu yöntem, kesme yöntemiyle ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmesi ve kraniyal uç plakanın korunması nedeniyle in vivo yük uygulama mekanizmasını ve kemik yetmezliğini daha iyi taklit etme avantajına sahiptir. Bu yaklaşım daha önce sıçan kemikleri üzerinde tek eksenli kompresyon testini içeren çalışmalarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, daha önce daha küçük fare bel omurları bağlamında belgelenmemiştir 17,25,26. Söz konusu yöntem daha önce Chachra ve ^ark.25 tarafından detaylandırılmıştı ve orijinal olarak, her biri silindirik bir boşluğa sahip iki plaka arasında tutulan ve daha sonra polimetilmetakrilat (PMMA) ile doldurulmuş bir kemik örneği kullandı. Aynı araştırma grubu daha sonra bir ucun hafifçe zımparalandığı (kaudal) ve diğer ucuna küçük bir kemik çimentosu noktası eklendiği (kraniyal) yöntemi ^{geliştirdi26}. Bu yöntem, merdaneler arasındaki malzemeyi en aza indirdiği ve bu makalenin odak noktası olduğu için önceki yönteme göre bir gelişmedir. Tek eksenli vertebral kompresyon testi ile ilgili zorluklara rağmen, özellikle üç nokta bükme ile eşleştirildiğinde, önerilen bir tedavinin kemik üzerindeki etkileri hakkında değerli bilgiler sağlayabilecek bir yöntemdir.

Burada, tek bir makine kullanılarak hem uzun kemiklerin hem de omur gövdelerinin kolayca test edilmesini sağlamak için dönüştürülebilir üç noktalı eğilme/basma test cihazının kullanımı sunulmaktadır. Ayrıca, fare bel omurlarının tek eksenli kompresyon testini elde etmek için bir gömme yönteminin kullanımı sunulmuştur. Bu çalışma, diyet kenevir tohumu takviyesinin genç, büyüyen dişi C57BL / 6 farelerinde^iskelet kemiğinin özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlayan daha büyük bir çalışmanın parçası olarak gerçekleştirilmiştir ^5,6. Üç noktalı bükme test cihazı ilk olarak Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo'daki Mühendislik Bölümü'ndeki öğretim üyeleri ve öğrenciler tarafından inşa edildi ve araştırma grubumuz tarafından uzun kemikler üzerinde üç noktalı bükme testlerinde kullanıldı [sıçan femur ve tibia⁷ ve fare humerus, femur ve tibia 5,6,8,9 ]. Bununla birlikte, fare vertebral vücut kompresyon testinde kullanım için modifikasyonu ve uygulaması araştırılmamıştır. Üç noktalı bükme makinesinin tasarımı ve yapımı daha önce açıklanmıştır⁷. Bu rapor, sıkıştırma testi için makineyi değiştirmek ve sistem yer değiştirmesini düzeltmek için kullanılan yöntemlere odaklanacaktır. İkinci olarak, fare vertebral gövdesi yükleme yüzeyi hazırlığı için gömme yöntemi, tek eksenli sıkıştırma testi ve yük-yer değiştirme verilerinin analizi için yöntemler ile birlikte açıklanmaktadır.

Tüm deneyler ve protokoller, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden onay almıştır (Protokol Numarası: 000-000A-021). Hayvan bakımı için ayrıntılı prosedürler daha önce açıklanmıştır ^5,6. Fareler, kenevir tohumu takviyeli bir diyetin genç, büyüyen dişi C57BL / 6 fareleri üzerindeki etkilerini araştırmayı amaçlayan daha geniş bir çalışmanın parçası olarak üç haftalıkken elde edildi (bkz. 5 ila 29 haftalıkken, fareler üç diyetten birinde yetiştirildi: kontrol (% 0 kenevir tohumu), 50 g / kg (% 5) kenevir tohumu veya 150 g / kg (% 15) kenevir tohumu, grup başına sekiz fare ^5,6. Çalışma boyunca, fareler kendi diyetlerine ve sularına ad libitum erişimine sahipti, polikarbonat kafeslere yerleştirildi ve 12 saatlik bir ışık: 12 saat karanlık döngüsünde (ışıklar 06: 00 - 18: 00 saatleri arasında açıkken) tutuldu. Farelerin kilosu ve sağlığı haftalık olarak değerlendirildi ve tüm fareler herhangi bir olumsuz sağlık koşulu geliştirmeden çalışmayı başarıyla tamamladı. Yirmi dokuz haftalıkken, fareler izofluran gazı kullanılarak derin anestezi altına alındı ve servikal çıkık yoluyla ötenazi^{yapıldı 5,6}. Sternumdan kuyruğa kadar ventral yüzeyde orta hat insizyonu yapıldı ve tüm intratorasik, peritoneal ve retroperitoneal organlar karkaslardan çıkarıldı. İçi boşaltılmış karkaslar, yaklaşık bir yıl sonra meydana gelen omur testi için kemik diseksiyonu zamanına kadar -70 °C'de% 0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde korundu.

1. Üç noktalı bükme makinesinin sıkıştırma test makinesine dönüştürülmesi

1. Üç noktalı bükme makinesindeki⁷ yük sensörüne bağlı çaprazkafa kirişini sökün (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1A,B).
2. Kendinden hizalı bir üst plakayı, çaprazkafa kirişiyle aynı diş ile yük sensörüne (Malzeme Tablosuna bakın) vidalayın (Şekil 1C).
3. Alt plakanın daha sonra takılacağı alt desteklerin her birine iki yatay delik açın (Şekil 1D).
4. Alt desteklerdeki delinmiş deliklerle hizalamak için dişleri paslanmaz çelik alt plakanın iki tarafına hafifçe vurun (Şekil 1E).
5. Dişli altıgen vidalar kullanarak alt plakayı iki alt desteğe sabitleyin ve sabitlenene kadar sıkın (Şekil 1F).
   NOT: Altıgen vidalar, alt desteklerdeki ve üst/alt plakalardaki dişli deliklerle eşleşen dişlere sahip olmalıdır. Kendinden hizalı bir üst plakanın kullanılması, üst plaka ile yükleme yüzeyi arasında düzgün bir temas sağlanmasına yardımcı olabilir, ancak vertebral gövdelerin kraniyal ucunun içbükeyliği göz önüne alındığında yeterli değildir. Bir yükleme yüzeyi hazırlama yöntemi kullanılarak daha fazla hazırlık gereklidir. Birçok endüstriyel/mühendislik malzemesinden daha küçük ve daha zayıf olan küçük hayvan kemikleri için bir sıkıştırma test cihazı inşa ederken, yük sensörünün yük kapasitesini ve yük çerçevesinin boyutunu dikkate almak önemlidir. Ek olarak, doğru sonuçlar ve sorunsuz çalışma sağlamak için makineler düzenli olarak temizlenmeli ve yağlanmalıdır.

2. Sıkıştırma test makinesinin yer değiştirmesinin düzeltilmesi

1. Üst plaka ile alt plaka arasında test malzemesi yokken, hafif temas sağlanana kadar (~0.3-0.5 N ön yük kuvveti) üst plakayı alt plakaya indirin.
2. Sıkıştırma testine başlamak için makineyi sabit bir indirme hızında (~1 mm/dak) açın. Mekanik testlerin veri toplaması için dijital veri toplama yazılımını (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak yük (N) ve yer değiştirme (mm) ölçümlerini toplayın.
   NOT: Üst ve alt plaka arasında herhangi bir malzeme olmadığından, gözlemlenen tüm yer değiştirmeler yalnızca makinenin (Δx_makinesi) (şasi, yük hücresi, plakalar, kaplinler vb.) yer değiştirmesinden kaynaklanacaktır.
3. Tüm kemik örneklerinden elde edilecek kuvvetten daha yüksek kuvvetlere ulaşılana kadar üst plakayı sabit (yani monotonik) bir hızda alt plakaya indirmeye devam edin.
4. 2.1'den 2.3'e kadar olan adımları toplam üç kez tekrarlayın.
5. Sistem yer değiştirmesi (Δx_makine, mm) ile karşılaştırılan verileri çizin. uygulanan yük (Kuvvet, N).
6. Verilere en uygun regresyon çizgisini sığdırın (Şekil 2A-D).
7. Kemik kompresyon testinden elde edilen verileri içeren bir elektronik tabloda, bir fare lomber vertebra kompresyon testinin bir veri noktası için kaydedilen yer değiştirmeyi (Δx_{toplam kaydedilen}) etkileyen makine yer değiştirme miktarını (Δx_makinesi) belirlemek için regresyon analizi tarafından sağlanan denklemi kullanın.
   NOT: Örneğin, 18 N kuvvetin uygulandığı ve 2.730 mm yer değiştirmenin kaydedildiği (toplam kaydedilen Δx) bir veri noktası düşünün. Örnek üçüncü dereceden polinom regresyon denklemine göre (Şekil 2D) [Δx_makine = (4 × 10-7 x Uygulanan Yük ³) - (8 × ^10-5 x Uygulanan Yük²) + (0.0044 x Uygulanan Yük)], kaydedilen yer değiştirmenin 0.056 mm'si makine yer değiştirmesinden (Δx_makinesi) kaynaklanmaktadır.
   Δx_{toplam kaydedildi=} Δx_makine + Δx_numune
8. Veri noktası için kaydedilen ötelemeyi düzeltin.
   NOT: Örneğin, yukarıdaki örneği ele alalım. 2.730 mm yer değiştirme kaydedilirse (Δx_{toplam kaydedildi}) ve makine yer değiştirmesi ₍Δx_makinesi) toplamın 0.056 mm'sini oluşturuyorsa, ilgilenilen numunenin (yani kemik) maruz kaldığı yer değiştirme (Δx_örneği) 2.664 mm'dir. Bu nedenle, 2.664 mm, omurun maruz kaldığı gerçek yer değiştirmedir (Δx_örneği) ve yük-yer değiştirme eğrisi analizi için kullanılacak değerdir.
   Δx_numune = Δx_{kaydedilen toplam numune -} Δx_makine
9. Her bir örnek (kemik) için toplanan her veri noktası için 2.7-2.8 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Bu adım önemlidir, çünkü sıkıştırma testi sırasında gözlemlenen yer değiştirme sadece numunenin yer değiştirmesinden kaynaklanmaz, bunun yerine gözlemlenen yer değiştirme, makine yer değiştirmesinin (Δx_makinesi) (örneğin, çerçevenin, yük hücresinin, plakaların, kaplinlerin vb. sıkıştırılması/yer değiştirmesi) ve numunenin (Δx_numunesi). Bu nedenle, küçük bir hayvanınki (örneğin, fare) gibi nispeten küçük miktarlarda yer değiştirmeye maruz kalan numuneler için, sistem yer değiştirmesi (Δx_makinesi) büyük hatalara neden olabilir. Sistemin yer değiştirmesini düzeltmek için burada açıklanan prosedürler daha önce Kalidindi ve Abusafieh²⁸ tarafından rapor edilmişti ve burada açıklanana ek olarak diğer iki yöntemi de detaylandırıyordu. Bazı araştırmacıların sistem yer değiştirmesini belirlemek için birden fazla yöntem kullandıkları belirtilmiştir¹⁷. Her makine, üzerine yükler uygulandığında benzersiz desenler ve sistem yer değiştirme dereceleri gösterebilir. Bu nedenle, sistem yer değiştirme düzeltme faktörü her makine için belirlenmelidir ve herhangi iki makine arasında aynı olmayacaktır. Bir omur kemiğinin kompresyon testinin aksine, üst ve alt plaka arasında hiçbir malzeme olmadığı için sistem yer değiştirmesi ölçülürken büyük bir kuvvet azalması gözlenmeyecektir.

3. 5^{. bel} omurunun (L5) fare karkasından diseksiyonu

1. Dondurulmuş fare karkasını oda sıcaklığında çözdürün, düzenli olarak %0,9 NaCl'lik izotonik bir çözelti uygulayarak yumuşak dokuları ve kemikleri nemli tutmaya özen gösterin.
2. Kuyruğun tabanına yakın dorsal orta hattaki deride küçük (<0,5 cm) bir kesi yapın, ardından kesiği her bir arka bacak boyunca uzatın ve postu kuyruğun tabanından hayvanın kafasına çıkarmak için hafifçe çekin.
3. Vertebral kolon kolayca görünene kadar karın duvarı kaslarını kesin.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, iki sakroiliak eklemi ve sakrumun kraniyal ucunu görselleştirin.
5. Bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak, son bel omurunu (L6) sakrumun kraniyal ucundan ayırmak için ince bir kesim yapın.
6. Yine, intervertebral boşluk arasında keserek, L6 ve L5'i vertebral kolondan çıkarın ve analiz için L5'i bir kenara koyun (Şekil 3).
7. Omuru diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve intervertebral disk de dahil olmak üzere tüm yumuşak dokuları çoğunlukla gazlı bez kullanarak ve gerektiğinde forseps ile nazikçe çıkarın.
   NOT: Bu çalışmada ilgilenilen omur olarak L5 seçilmiştir, ancak kompresyon testi için diğer bel omurları da seçilebilir.

4. PMMA kemik çimentosu gömme yöntemi kullanılarak tek eksenli kompresyon testi için L5 vertebra yükleme yüzeyinin hazırlanması

1. Döner bir alete bağlı bir elmas kesme çarkı (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak, enine ve dikenli işlemi çıkarmak için her pedikülde bir kesim yapın (Şekil 4). Merkeze bağlı bırakılırsa, vertebral süreçler, yükün merkez boyunca dağılımının aksine, süreçlerin kendisinde üst/alt plakalarla yerel temaslara neden olabilir.
2. Tüm intervertebral diskleri, yumuşak dokuyu ve düzensizlikleri gidermek için 120 kumlu ince zımpara kağıdı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak omurun kuyruk ucunu nazikçe zımparalayın.
3. Daha sonra kolay tanımlama için zımparalanmış kuyruk ucunu kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin.
4. PMMA kemik çimentosunu üreticinin talimatlarına göre karıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
5. PMMA kemik çimentosu hala yarı yumuşakken, omurun kraniyal (işaretsiz) ucuna yukarı bakacak şekilde minimum miktarda yerleştirin ve kemik örneğini nemli ve serin tutmak için omur tuzlu su banyosunda otururken tüm yüzeyin kaplandığından emin olun.
6. PMMA hala yarı yumuşakken, omuru kaudal (işaretli) tarafı aşağı bakacak şekilde alt plakaya yerleştirin (Şekil 5).
7. Tahrik dişlilerini devreye sokmak için makineyi açın ve kemik çimentosu ile temas sağlanana ve PMMA'yı kemik yüzeyine eşit olarak dağıtmak için minimum kuvvet (<0,5 N) uygulanana kadar üst plakayı omur + PMMA kemik çimentosu kompleksi üzerine yavaşça indirin. Nötr konumdaki üst plaka yatay olarak tahmin edilebilir ve yarı yumuşak PMMA'ya basıldığında, PMMA'nın omurun kraniyal ucundaki içbükeyliği doldurmasına ve üst plakanın altında düz bir yatay yüzey oluşturmasına neden olur.
8. Üst plaka PMMA kemik çimentosuna hafifçe bastırırken, PMMA kemik çimentosu tamamen sertleşene kadar numunenin rahatsız edilmeden oturmasına izin verin (bu çalışmada kullanılan PMMA kemik çimentosu için üreticinin talimatlarına göre ~ 10 dakika). Numuneyi tuzlu su banyosunda tutun veya numuneyi nemli ve serin tutmak için bu süre zarfında sık sık tuzlu su ile buğulayın.
9. PMMA kemik çimentosu tamamen sertleştikten sonra kompresyon testi başlayabilir. Mekanik testlerin veri toplaması için tasarlanmış dijital yazılımı kullanarak sensörlerden gelen yük (yani kuvvet) (N) ve yer değiştirme (yani sapma) (mm) için verileri gerçek zamanlı olarak bir elektronik tabloya toplayın (bkz.
10. <0,5 N'lik minimum ön yük kuvvetinde uygulanan 5 sn boyunca temel veri toplama işleminden sonra, sıkıştırma testini başlatmak için (~1 mm/dak) üst plakayı numune üzerine tek (yani monotonik), önceden belirlenmiş bir indirme hızında indirmeye başlayın.
11. Malzeme arızasını gösteren yükte (N) büyük bir azalma gözlemlendiğinde veri toplamayı durdurun.
    NOT: Üretici talimatları, PMMA kemik çimentosu için yaklaşık sertleşme süresini belirtecektir. PMMA kemik çimentosu için sertleşme süresi, kullanılan PMMA kemik çimentosu tipine bağlı olarak farklılık gösterebilir. PMMA sertleşmesi için bekleme süresini belirlemek için üretici talimatlarını izleyin. Bununla birlikte, PMMA kemik çimentosu tamamen sertleştiğinin bir göstergesi olarak, PMMA kemik çimentosu ek bir numunesi, omur üzerine yerleştirilecek numune ile aynı anda karıştırılabilir, ancak bir kenarda tutulabilir ve hala yumuşak veya tamamen sertleşmiş olup olmadığını kontrol edebilir. Tamamen sertleşirse, bu kemik üzerindeki PMMA'nın da kemik + PMMA kompleksini bozmadan tamamen sertleştiğini gösterebilir. Kemik numunesi, PMMA sertleştirme ve test periyotları boyunca iyi nemlendirilmiş ve soğuk kalmalıdır. Kuru havaya birkaç dakika kadar kısa bir süre maruz kalmak, biyomekanik özelliklerde değişikliklere neden olabilir. Bazı araştırmacılar tuzlu su banyosu ile donatılmış kompresyon test cihazları kullanmaktadır¹⁹. Bu çalışmada basma test cihazında tuzlu su banyosu yoktu. Bunun yerine, PMMA sertleştirme periyodu ve test periyodu boyunca düzenli olarak ince bir tuzlu su sisi uygulandı.

5. L5 vertebra tek eksenli basma testleri için yük-yer değiştirme eğrilerinin analizi

1. Yük (N) ve düzeltilmiş yer değiştirme (mm) verilerini elektronik tablodan kopyalayıp teknik bir grafik ve veri analizi yazılımına yapıştırın (bkz.
2. Y ekseninde yük (N) ve x ekseninde düzeltilmiş numune yer değiştirmesi (Δx_numune, mm) ile bir grafik oluşturun (Şekil 6). Bunu yazılımda önce Windows, Yeni Tablo'ya tıklayarak yapın, ardından bir tablo yapmak için yapın . Düzeltilmiş ötelemeyi (mm) kopyalayın ve ham veri elektronik tablosundan yeni tabloya yükleyin (N).
3. Ardından, Veri'ye tıklayarak ham verileri temsil edecek bir dalga formu oluşturun, ardından XY Çifti - Dalga Formu'na tıklayın ve X-Wave için düzeltilmiş yer değiştirme verilerini seçin ve Y-Wave için verileri yükleyin. "Nokta Sayısı" kutusunda doğru sayıda veri noktası olduğundan emin olun, dalga biçimini adlandırın ve ardından Dalga Biçimi Yap'a tıklayın. Bir dalga formu oluşturulduktan sonra, Windows'a, ardından Yeni Grafik'e tıklayarak bir grafik oluşturun ve dalga formunu Y eksenine yerleştirin ve X eksenine "hesaplandı".
4. Analiz için grafikte ilgi çekici noktaları/bölgeleri işaretlemek için imleç aracını kullanın. Yaygın tam kemik mekanik özelliklerini hesaplamak için ilgi çekici noktalardan/bölgelerden birkaçı adım 5.4-5.8'de belirtilmiştir (Şekil 6) ve işten arızaya (N x mm), maksimum yük (N), sertlik (N/mm), akma yükü (N) ve akma sonrası yer değiştirmeyi (mm) içerir.
5. İşten başarısızlığa (N x mm) hesaplanması için, testin başlangıcına bir imleç (A) ve malzeme arızalanmadan hemen önceki noktaya bir imleç (B) yerleştirin (yani, yükte büyük bir azalma gözlemlenmeden önce test sırasında ulaşılan maksimum yüke).
   NOT: Bu nedenle, A-B imleçleri, malzemenin kuvvetlere dayanmaya başladığı ve malzemenin başarısız olduğu noktaya kadar yer değiştirmeye başladığı andan itibaren testin tamamını parantez içine alacaktır. İşten başarısızlığa (N x mm), eğrinin altındaki toplam alan (yani, A ve B imleçleri arasındaki eğrinin altındaki alan) olarak ölçülebilir.
6. Test sırasında gözlemlenen yük için en yüksek değer olarak maksimum yükü (N) hesaplayın (yani, B imlecindeki yük).
7. Malzemenin sertliğini (N/mm) doğrusal elastik bölgenin eğimi olarak hesaplayın (yani, C ve D imleçleri arasındaki eğim).
8. Akma yükü (N), yük-yer değiştirme eğrisinin doğrusallıktan saptığı ve plastik bölgeye girdiği, böylece kalıcı deformasyonu (yani D noktasındaki yükü) sürdürdüğü yüktür. Bunu, D imlecindeki yükü ölçerek hesaplayın.
9. Akma sonrası yer değiştirme (mm), bir malzemenin sünekliğinin bir göstergesidir. Bunu, akma noktası ile malzeme kırılma noktası arasındaki yer değiştirme olarak ölçün (yani, D ve B imleçleri arasındaki yer değiştirme).
   NOT: Yukarıda listelenen parametreler, bildirilen yaygın tüm kemik mekanik özelliklerinden sadece birkaçıdır. Bir yük-yer değiştirme eğrisinden elde edilebilecek tüm tüm kemik mekanik özelliklerinin tam bir listesi değildir. Diğer tüm kemik mekanik özellik parametreleri arasında toplam yer değiştirme (mm), emilen elastik enerji (N x mm), elastik yer değiştirme (mm), emilen plastik enerji (N x mm) ve plastik yer değiştirme (mm) sayılabilir. Ayrıca, doku düzeyinde kemik mekanik özellikleri listelenmemiştir; Bunlar, kemik çapı gibi belirli anatomik ölçümler kullanılarak veri dönüşümleri gerektirir. Yazılımdaki yük-yer değiştirme eğrisinden ölçümler yapmak için örnek kod Ek Dosya 1'de listelenmiştir.

L5 yükleme yüzeyinin gömülmesini ve dönüştürülebilir üç noktalı bükme makinesini/sıkıştırma test makinesini kullanan bu adım adım protokolle, gruplar arası karşılaştırmalar için fare bel omuru üzerinde kompresyon testi yapmak mümkündür. Gömme yöntemi kullanılarak toplam yirmi dört fare L5 omuru hazırlandı. Bununla birlikte, numunelerden üçü, döner bir alet üzerinde bir elmas kesme diski kullanılarak vertebral işlemlerin çıkarılması sırasında hasar gördü ve bu nedenle test edilmedi. Bu göz önüne alındığında, listelenen mekanik özellikler, gömme yöntemi kullanılarak yirmi dört numunenin yirmi birinden başarıyla elde edildi. Numuneler her testten sonra görsel olarak incelendi ve PMMA kapağı testlerin hiçbirinde hasar görmedi. Belirtildiği gibi, bu çalışmada kullanılan fareler, diyet kenevir tohumunun genç ve büyüyen C57BL / 6 dişi farelerin kemikleri üzerindeki etkilerini belirlemeyi amaçlayan daha büyük bir çalışmanın parçasıydı. Yaygın olarak bildirilen beş tam kemik mekanik özelliğinin tanımlayıcı istatistikleri Tablo 1'de sunulmaktadır. Yirmi bir numunenin tümü için yük-yer değiştirme eğrileri Şekil 7'de verilmiştir.

Şekil 1: Üç noktalı bükme makinesinin basma test makinesine dönüştürülmesi. (A) Makine, yer değiştirme sensörü ve yük sensörü ile birlikte üç noktalı bükme makinesi olarak çalışacak şekilde tam donanımlıdır (beyaz oklar). (B) Çaprazkafa kirişi çıkarıldıktan sonra makine. (C) Makine, kendinden hizalı bir üst merdane yerleştirildikten sonra, çaprazkafa kirişinin daha önce yerleştirildiği yere yerleştirilir. (D) İçlerine delikler açılmış alt destek kirişleri. (E) Dört dişli deliğe sahip paslanmaz çelik alt plaka ve deliklerden birine kısmen vidalanmış bir vida. Fotoğrafta görülmeyen diğer iki delik karşı taraftadır. (F) Alt plaka dört altıgen vida ile tutturulmuş alt destek kirişleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Doğrusal (A), logaritmik (B), ikinci dereceden polinom (C) ve üçüncü dereceden polinom (D) regresyon ile donatılmış örnek bir sistem yer değiştirmesi (Δxmakinesi) ve yük grafiği. Bu örnekte, üçüncü dereceden polinom,R2 değeri başına en iyi uyumu sağlar ve regresyonu, sistem yer değiştirme düzeltme faktörü olarak kullanılır. Görüntüler, regresyon uydurmasını göstermek için örnek verileri temsil eder ve araştırmacılar tarafından tek tek makineler için elde edilmesi gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Fare lomber vertebral kolonu. L6 çıkarılmadan önce (A) ve L6 çıkarıldıktan sonra L5 yapışık bırakılarak (B) diseksiyon mikroskobu altında bir fare lomber vertebral kolonu. L5 daha sonra çıkarılacak ve sıkıştırma testi için hazırlanacaktır. Beyaz renkli bantlar, diseke edilen ve çıkarılan intervertebral disklerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: L5 omurunun anatomisi. Diseksiyon mikroskobu altında kraniyal, kaudal, dorsal ve ventral görünümlerde temsili bir fare L5 omuru. Vertebra gövdesi için önemli boyutlar, renkli çizgilerle gösterildiği gibi yükseklik, dorsoventral genişlik ve yanal genişliği içerir. Siyah kesikli çizgiler, vertebral süreçleri ortadan kaldırmak için yaklaşık olarak nerede kesiklerin yapılacağını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: PMMA kemik çimentosunun sertleşme periyodu. Kraniyal uç plakaya yerleştirilmiş PMMA kemik çimentosu (yeşil) ve üst plaka PMMA kemik çimentosu + kemik kompleksi üzerine indirilmiş örnek bir L5 omuru. PMMA kemik çimentosu tamamen sertleştikten sonra kompresyon testi başlayacaktır. Üst plaka, malzemenin arızalandığı gözlemlenene kadar daha da alçaltılacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Fare vertebral kemik kompresyon testi yük-yer değiştirme eğrisi ve veri analizi. İmleç A , sıkıştırma testinin başlangıcını işaretler. İmleç B , malzeme arızası noktasını işaretler. C imleci doğrusal elastik bölgenin başlangıcını işaretlerken, D imleci sonunu (yani akma noktasını) işaretler. Açık gri ile gölgelenen alan, yük kaldırılırsa malzemenin orijinal şekline geri döneceği doğrusal elastik bölgedir. Koyu gri gölgeli alan, malzemenin kalıcı deformasyona uğradığı ve yük kaldırılırsa orijinal şekline geri dönmeyeceği plastik bölgedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Yirmi bir kemik örneğinin tümü için yük-yer değiştirme eğrileri. Desenler kemikler arasında değişiyordu. Genel olarak, en büyük değişkenlik, kemiklerin birkaçının (n = 5) nispeten küçük bir verim sonrası yer değiştirmesine ve diğerlerinin (n = 16) nispeten büyük bir verim sonrası yer değiştirmesine sahip olmasıyla, verim sonrası yer değiştirmedeydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yükleme yüzeyi hazırlama gömme yöntemi kullanılarak elde edilen, yaygın olarak bildirilen tüm kemik mekanik özellikleri için temsili değerler. Değerler, bu çalışmada detaylandırılan tüm protokoller kullanılarak elde edilmiştir. Bu nedenle, değerler burada açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilebilecek değerleri temsil eder. Değerler SEM ± anlamına gelir. Gruplar, 5-29 haftalık% 0 (CON), 50 g / kg (% 5) (5HS) veya 150 g / kg (% 15) konsantrasyonlarında bütün kenevir tohumu ile zenginleştirilmiş bir diyetle beslenen C57BL / 6 dişi fareleri temsil eder. Parametrelerden biri için (işten başarısızlığa), diyetin tek yönlü bir ANOVA başına değerleri etkilediği görülmektedir (p < 0.05). Tukey-Kramer post hoc analizine göre, aynı harf üst simgesini paylaşan değerler önemli ölçüde farklı değildir (p > 0.05), farklı harf üst simgelerine sahip değerler önemli ölçüde farklıdır (p < 0.05).

Ek Dosya 1: Tüm kemik mekanik özelliklerini elde etmek için örnek kod. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.