Method Article

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

DOI:

10.3791/65517

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Korea Food Research Institute, 2Department of Food Biotechnology, Korea University of Science and Technology, 3Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C'de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acinetobacter'in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir1. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır 2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir4. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter4'ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli fa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakteri aşısının hazırlanması

  1. -80 °C'de saklanan gliserol stok şişesini çıkarın.
  2. Steril bir pipet ucu kullanarak bakteri suşunu (2-10 μL) flakondan çıkarın.
    NOT: Bu protokolde Acinetobacter suşları, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ve A. ursingii (24-1) kullanılmaktadır.
  3. Piyasada bulunan bir kanlı agar plakasını (% 5 koyun kanı ile desteklenmiş triptik soya agarı, Malzeme Tablosuna bakınız) bakterilerle aşılayın.
    NOT: Besleyici agar veya MacConkey agar gibi di....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü takiben, orijinal olarak mutfak yüzeylerinden izole edilen Acinetobacter izolatlarının biyofilmleri, kristal viyole ile boyanmış polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerinde oluşturuldu ve boyalar etanol içinde çözündürüldü ve biyofilm kütlesi için ölçüldü (Şekil 1). Biyofilm sayısı, OD 0.04 ila 1.69 arasında değişen suşlara bağlı olarak büyük ölçüde değişmiştir (Şekil 1). Stepanović ve ark.16 tarafından belirlenen kriterler.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).

Bu protokolde Acinetobacter'in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, çünkü birçok çalışma Acinetobacter'.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Bilim ve BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Gıda Araştırma Enstitüsü'nün (KFRI) Ana Araştırma Programı (E0210702-03) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 oyuklu hücre kültürü plakasıSPL30096Polistiren 96 oyuklu plaka
BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu) suyuMerck KGaA1.10493.0500
Kan Agar Taban PlakasıKisanBioMB-B1005-P50Acinetobacter
CHROMagar için büyüme ortamı AcinetobacterCHROMagarAC092Acinetobacter
Kristal viyole için seçici plaka çözümSigma-AldrichV5265
Filmtracer CANLI/ÖLÜ biyofilm canlılık kitiInvitrogenL10316SYTO9 ve propidyum iyodür
Mikroplaka okuyucuTecanInfinite M200 PRO NanoQuant Biyofilmölçümü
RBC Cam Kaplama BoncuklarıRBCRG001Cam boncuklar
ve mu;-Plaka 96 Kuyu Siyahibidi89621CLSM için tasarlanmış mikroplaka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
  2. Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Acinetobacter BiofilmsBiofilm QuantificationViability AssessmentBiofilm VisualizationCrystal Violet StainingViable Count MethodConfocal MicroscopyMicroplate ReaderSerial DilutionPropidium Iodide Staining

Related Articles