Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Peptitlerinin Tanımlanması

Summary

Bu protokol, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile makrofajlardan küçük hücre dışı vezikülleri izole etmek ve kütle spektrometrisi ile tanımlamak için peptidomu çıkarmak için bir prosedürü açıklar.

Abstract

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) tipik olarak multiveziküler cisimlerin (MVB'ler) ekzositozu ile salgılanır. <200 nm çapındaki bu nanoveziküller, çeşitli vücut sıvılarında bulunur. Bu sEV'ler, proteinler, DNA, RNA ve metabolitler gibi kargoları aracılığıyla gen transkripsiyonu ve translasyonu, hücre çoğalması ve hayatta kalması, bağışıklık ve iltihaplanma gibi çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Şu anda, sEV'lerin izolasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bunlar arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem altın standart olarak kabul edilir ve sEV'lerin izolasyonu için yaygın olarak kullanılır. Peptitler, doğal olarak 50 amino asitten daha az uzunluğa sahip biyomakromoleküllerdir. Bu peptitler, hormonlar, nörotransmiterler ve hücre büyüme faktörleri gibi biyolojik aktiviteye sahip çeşitli biyolojik süreçlere katılır. Peptidom, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile spesifik biyolojik numunelerdeki endojen peptitleri sistematik olarak analiz etmeyi amaçlamaktadır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile sEV'leri izole etmek için bir protokol tanıttık ve LC-MS/MS ile tanımlanmak üzere peptidomu ekstrakte ettik. Bu yöntem, kemik iliği kaynaklı makrofajlardan yüzlerce sEV türevi peptit tanımladı.

Introduction

Çapı 200 nm'den küçük olan küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) hemen hemen her tür vücut sıvısında bulunur ve idrar, ter, gözyaşı, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı dahil olmak üzere her türlü hücre tarafından salgılanır¹. Başlangıçta, sEV'ler hücresel atıkların bertarafı için kaplar olarak kabul edildi ve bu da sonraki on yılda minimum araştırmaya yol açtı². Son zamanlarda, artan kanıtlar sEV'lerin spesifik proteinler, lipitler, nükleik asitler ve diğer metabolitler içerdiğini göstermektedir. Bu moleküller hedef hücrelere³ taşınır ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur ve bu sayede d....

Protocol

1. Küçük hücre dışı veziküllerin izolasyonu

NOT: Tüm santrifüjleme işlemlerini 1.1-1.11 adımlarında 4 °C'de gerçekleştirin.

1. sEV içermeyen fetal sığır serumunun (FBS) hazırlanması: Endojen sEV'leri çıkarmak için FBS'yi gece boyunca 4 °C'de 110.000 × g'de bir ultrasantrifüj aracılığıyla santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Süpernatanı toplayın, filtreleyin, 0,2 μm ultrafiltrasyon membranı ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
2. 150 mm'lik bir kültür kabına yaklaşık 3 x 10⁷ ölümsüzleştirilmiş kemik iliği türevli makrofajları (iBMDM'ler) yerleştirin ve 20 mL DMEM....

Results

Diferansiyel ultrasantrifüj ile izole edilen sEV'ler için (Şekil 1), Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği'ne (ISEV)¹⁷ göre morfolojilerini, partikül boyutu dağılımlarını ve protein belirteçlerini değerlendirdik.

İlk olarak, sEV'lerin morfolojisi TEM tarafından gözlemlendi ve tipik bir fincan benzeri yapı gösterdi (Şekil 2A). NTA, izole edilmiş sEV'lerin çoğunlukla 136 nm'de yoğunlaştığını gösterdi (

Discussion

sEV'lerin işlevini araştırırken, olası kontaminasyonları önlemek için karmaşık biyolojik numunelerden yüksek saflıkta sEV'ler elde etmek zorunludur. sEV'lerin izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir¹³ ve bu yöntemler arasında, diferansiyel ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, sEV'lerin nispeten yüksek saflığını göstermiştir. Bu çalışmada, 6 saat boyunca 200 mL hücre süpernatantı toplandı ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile yaklaşık 200-300 μg sEV elde edildi. Bununla birlikte, sEV pelet.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Test Kiti	Beyotime Teknolojisi	P0012
CD9	Beyotime Teknolojisi	AF1192
Santrifüj filtre tüpü	Millipore	UFC5010BK
Santrifüj şişeleri polipropilen	Beckman Coulter	357003	Yüksek hızlı santrifüj
Kemilüminesan substrat	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM kültür ortamı	Hücre Dünyası	N? A
GRP94	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	20292
Yüksek hızlı santrifüj	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Santrifüj rotoru (JA-25.50)
Ölümsüzleştirilmiş kemik iliği türevi makrofajlar (iBMDM)	Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Çin		Dr. Feng Shao (Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Çin) tarafından
sağlanmıştırİyodoasetamid	Sigma	l1149	5 g
Mikrofüj tüpü polipropilen	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Masaüstü ultrasantrifüj ve nbsp;
nano-yüksek performanslı LC sistemi	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanopartikül izleme analizi	Malvern Panalitik	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X kütle spektrometresi	Thermo Fisher Scientific	N/A
Fosfat tamponlu salin	Solarbio	P1020
Polyallomer santrifüj tüpleri	Beckman Coulter	326823	Ultrasantrifüj
Proteaz inhibitörü	Bimake	B14002
SpeedVac vakum yoğunlaştırıcı	Eppendorf	Konsantratör artı
Masaüstü ultrasantrifüj	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultrasantrifüj rotoru (TLA 55)
Transmisyon elektron mikroskobu	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultrasantrifüj rotoru (SW32 Ti)
Ultrasonik hücre bozucu	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot görüntüleyici	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853