Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Asimetrik hücre bölünmesi (ACD), RNA, proteinler ve organeller gibi hücre altı bileşenlerin^{yavru hücreler 1,2} arasında eşit olmayan bir şekilde bölündüğü süreçtir. Bu süreç, farklı gelişimsel kaderlere sahip yavru hücrelere yol açmak için ACD'ye maruz kalan kök hücrelerde yaygın olarak görülür. Drosophila NB'ler, kökünü koruyan bir NB ve bir ganglion ana hücresi (GMC) üretmek için asimetrik olarak bölünür. GMC, farklılaştırıcı nöronlar veya glia³ üretmek için daha fazla bölünmeye uğrar. Asimetrik olarak bölünen NB'ler, mikroskopi ile kolayca gözlemlenen üçüncü instar larvalarının gelişmekte olan beyinlerinde bol miktarda bulunur. Üçüncü instar larva aşamasında, her bir merkezi beyin lobunda^yaklaşık 100 NB bulunur ^3,4,5,6.

Asimetrik hücre bölünmesi oldukça dinamik bir süreçtir. Canlı hücre görüntüleme protokolleri, hücre polaritesi 7,8,9,10, iğ oryantasyonu^11,12,13, aktomiyosin korteks^{dinamiği 14,15,16,17,18}, mikrotübül ve sentrozom biyolojisi ^{19,20 dinamiklerini ölçmek ve ölçmek için kullanılmıştır},21,22,23,24,25,26,27 ve membran ^10,28 ve kromatin dinamiği ²⁹. ACD'nin nitel ve nicel açıklamaları, sağlam canlı beyinlerde NB'leri bölmek için sağlam yöntemlere ve protokollere dayanır. Aşağıdaki protokol, iki farklı montaj yaklaşımı kullanarak in vivo canlı hücre görüntüleme için üçüncü instar larva beyinlerini hazırlama, disseke etme ve görüntüleme yöntemlerini özetlemektedir. Bu yöntemler, kök hücre bölünmelerinin mekansal zamansal dinamiklerinin yanı sıra diğer beyin hücrelerindeki bölünmelerle ilgilenen araştırmacılar için en uygun olanıdır, çünkü hücresel olayların kısa ve uzun vadeli gözlemlerine izin verirler. Ek olarak, bu tekniklere alana yeni gelenler için kolayca erişilebilir. Bu yaklaşımın etkinliğini ve uyarlanabilirliğini, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübül ve kortikal füzyon proteinlerini eksprese eden larva beyinleri ile gösteriyoruz. Ek olarak, analiz yöntemlerini ve diğer çalışmalarda uygulama için dikkat edilmesi gerekenleri tartışıyoruz.

NOT: Şekil 1'de bu etüdü gerçekleştirmek için gerekli malzemeler gösterilmektedir.

1. Deney için dikkat edilmesi gereken noktalar ve hazırlıklar

1. Larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin.
   NOT: Eksplant larva beyinlerinin kalitesi, diseksiyon öncesi larvaların sağlığı ve kalitesi ile doğrudan ilişkilidir. Aşırı kalabalıktan yetersiz beslenen larvalar genellikle daha düşük kaliteli beyinler verir³⁰.
   1. Yetersiz beslenmeyi önlemek için yemek kapağı kabı başına 20-30'dan fazla larva bulunmadığından emin olun. Bunların örnekleri Şekil 2'de görülebilir.
2. Kullanmadan önce Schneider'in ortamını filtreleyin ve aliquot edin.
   1. Her diseksiyon için, alıntılanan Schneider'in böcek besiyerini% 1 sığır büyüme serumu (BGS) ile destekleyerek taze görüntüleme ve diseksiyon ortamı hazırlayın. Bir görüntüleme deneyi için genellikle 5 mL'lik bir diseksiyon ve görüntüleme ortamı hacmi yeterlidir.
   2. Kullanmadan önce takviye edilen ortamı oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
3. Toplanacak filmin uzunluğunu düşünün ve görüntüleme ortamının takviyesini, montaj yaklaşımını ve mikroskobun edinme ayarlarını hesaba katmak için bunu kullanın.
   NOT: En uygun koşullar altında, sadece BGS ile desteklenen beyinlerdeki NB'ler, 3 saate kadar sağlam bir şekilde bölünecektir.
   1. Daha uzun filmler gerektiren deneyler yaparken 4 saatten önceki bölünmeleri desteklemek için görüntüleme ortamına larva yağlı vücut dokuları ekleyerek görüntüleme ortamını destekleyin.
      NOT: Yağlı cisimler NB proliferasyonunu destekleyen mitojenler salgılar³¹ ve 10 larvadan gelen tüm yağlı vücutlar dört ila beş beyni desteklemek için yeterlidir. Ayrıca, membrana bağlı bir slaytla görüntülenen örneklerin 10 saat^13,32'den fazla bölündüğü gösterilirken^, çok kuyucuklu bir slaytla görüntülenen örnekler genellikle daha az bölünür (yayınlanmamış gözlemler).
   2. Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi daha uzun filmler için daha karmaşık bir görüntüleme ortamı uygulayın³³. En iyi sonuçlar için pozlama süresini, lazer gücünü ve örnekleme frekansını ayarlayarak fotohasarı en aza indirin.

2. Larva evrelemesi ve toplanması (Şekil 2)

1. İstenilen genotipte döl üretmek için 1-5 günlük dişi bakire sinekleri 1-7 günlük yetişkin erkek sineklerle geçin. Optimum verim için, 10-15 dişi bakireyi 5-10 erkekle geçin. Bu sinekleri bir yemek kapağı olan bir sinek kafesine koyun (Şekil 2A-C) ve 25 ° C'de kuluçkaya yatırın.
2. Yemek kapağını günlük olarak değiştirin. Bu, yemek kapaklarının larvalarla aşırı kalabalıklaşmasını önler, bu da disseke beyinlerin kalitesini düşürür.
3. Yemek kapağı larvalarla önemli ölçüde kaplıysa (yani, >30), bu yemek kapağını ikiye bölün ve yarısını da ikiye kesilmiş taze bir yemek kapağıyla değiştirin. Alternatif olarak, yemek kapaklarını daha sık değiştirin (yani, her 24 saatte bir yerine her 12 saatte bir). Aşırı nüfuslu yemek kapaklarının örnekleri Şekil 2E, F'de görülebilir.
4. Larvalar istenen yaşa ulaşana kadar yemek kapağını larvalarla 25 ° C'de inkübe edin.

3. Larva yağlı vücut diseksiyonu (Şekil 3)

NOT: Bu protokol, 3 kuyucuklu bir diseksiyon kabı kullanarak diseksiyonları açıklar.

1. Pipet, 3 delikli bir diseksiyon kabının her bir kuyucuğuna ~ 400 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamı.
2. On adet 72-96 saatlik iyi beslenmiş vahşi tip larvaları, diseksiyon forsepsleri ile hafifçe tutarak ve tüm gıda partikülleri yıkanana kadar en alttaki kuyuya diseksiyon çözeltisinin içine ve dışına daldırarak yıkayın. Durulamadan sonra, temiz larvaları orta kuyuya taşıyın.
3. Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile larvaların kütikülünün bir tarafını yırtın.
4. Bu yırtılma, yağlı cisimlerin larvadan dökülmesine neden olacaktır. Yağ cisimleri kirli beyaz ve yarı yarı saydamdır ve kafes benzeri bir yapıya sahip olacaktır (Şekil 3I). Yağlı cisimler ayrıca kendilerine ve diseksiyon cımbızlarına yapışma eğiliminde olacaktır. Tanımlandıktan sonra, her larvadan mümkün olduğunca fazla yağ gövdesi toplayın ve forseps ile 400 μL RT diseksiyon ortamı ile en üstteki kuyuya aktarın.

4. Larva beyin diseksiyonu (Şekil 3)

1. Deneysel larvaları yiyecek artıklarından arındırmak için yukarıdaki gibi diseksiyon ve görüntüleme ortamında yıkayın. En iyi sonuçlar için, disseke edilmemiş larvaları diseksiyon çözeltisinde saklamaktan kaçının. Bu, larvaların "boğulmasına" neden olacak ve disseke edilmiş beyinlerin kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir.
2. Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Başka bir cımbız seti kullanarak, larvaların yaklaşık 1 / 3'ünü arka taraftan yavaşça kesin / sökün (Şekil 3A). Bu, sindirim sisteminin, yağ gövdelerinin, bağ dokusunun ve sinir sisteminin elemanlarının larvaların yırtılmış tarafından "patlamasına" neden olacaktır (Şekil 3B).
3. Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile, kütikülü ağız kancalarına doğru nazikçe fırçalayın, tüm larva içten dışa dönene kadar ağız kancalarını tutan cımbızlarla içeri doğru "iterek". Bu hareket bir çorabı "içten dışa" çevirmeye benzer (Şekil 3C, D).
4. Larvaları ters çevirin, böylece merkezi sinir sistemi ve diğer dokular hala kütiküle bağlıyken dışa doğru bakar. Bu adımda, yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için merkezi sinir sistemini (CNS) bulun. Cımbız kullanarak, CNS olmayan tüm dokuları nazikçe çıkarın, sadece CNS ve beyni kütiküle bağlı bırakın (Şekil 3E).
5. Beyin, aksonal bağlantılar yoluyla kütiküle bağlanacaktır. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, beyni kütikülden serbest bırakmak için bu aksonal bağlantıları kesin. Bunu yapmak için, önce beyin loblarının altını yavaşça kesin (Şekil 3F). Ventral sinir kordonunun altındaki bağlantılarla tekrarlayın.
   NOT: Bu adım, mikrodiseksiyon makası mevcut değilse cımbızla yapılabilir. Cımbız kullanırken, kütikülden çıkarılırken beyin dokusunun aşırı gerilmediğinden emin olmak için özel dikkat gösterin, çünkü mekanik stres beyin sağlığını olumsuz yönde etkileyecektir.
6. Diseke edilen beyni diseksiyon ve görüntüleme ortamı ile bir kuyuya aktarın. 3 saatten daha uzun görüntüleme deneyleri için, yukarıda açıklandığı gibi yağlı cisimlerle desteklenmiş diseksiyon ve görüntüleme ortamı kullanın. Diseksiyon süresini 20 dakikanın altında tutmak için larvaları gruplar halinde diseke edin.

5. Montaj ve görüntüleme (Şekil 4)

1. Membrana bağlı slayt³⁴ ile görüntüleme için:
   1. Diseksiyon kabının son kuyusunda hem disseke edilmiş beyinleri hem de izole edilmiş yağ gövdelerini toplayın.
   2. Slaytın yarısını, slaytın arkasına gaz geçirgen bir membran yerleştirerek birleştirin ve bölünmüş halkayı yerinde tutarak merkeze bastırın (Şekil 4A-C).
   3. 200 μL'lik bir mikropipet kullanarak, ~ 130-140 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamında 10 adede kadar disseke edilmiş beyni ve mümkün olduğunca fazla yağ gövdesini (yukarıya bakın) membrana aktarın. Ortamı, numunelerle birlikte gaz geçirgen membranın ortasına bıraktığınızdan emin olun (Şekil 4D, E).
   4. Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için yönlendirin (Şekil 4E). Numuneyi mikroskopun amacına mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Örneğin, merkezi beyin loblarındaki NB'leri görüntülemek için, beyinleri beyin lobları hedefe en yakın olacak şekilde yönlendirin (Şekil 4H).
   5. Beyinler yönlendirildikten sonra, zardaki çözeltinin üzerine yavaşça bir cam örtü parçası yerleştirin. Bu, beyinleri ve yağ gövdelerini içeren çözeltinin zarın tamamına yayılmasına neden olacaktır (Şekil 4F).
   6. Bir laboratuvar dokusunu kapak kayma kenarına yakın tutarak aşırı çözeltiyi lekeleyin. En uygun çözüm miktarı, beyinler ezilmeden kapak kaymasına dokunduğunda elde edilir. Bu adımda yeniden yönlendirme gerekiyorsa, beyinleri hareket ettirmek için kapak kaymasını dikkatlice hareket ettirin.
   7. Bir boya fırçası ile kapak kaymasının kenarları boyunca erimiş petrol jölesi uygulayarak kapak kaymasını hareketsiz hale getirin. Jölenin katılaşmasına izin verin (Şekil 4G).
2. Çok kuyulu görüntüleme slaytı ile görüntüleme için (Şekil 4):
   1. Çok kuyucuklu bir slaytın bir kuyucuğuna 400 μL görüntüleme ortamı ekleyin (burada yapılan deneyde, odacıklı 8 delikli bir mikro [μ] slayt kullanılmıştır; Şekil 4I). Daha önce disseke edilmiş yağ cisimleri bu kuyuya aktarın (bkz. adım 3.4).
   2. Kuyunun merkezine yakın bir kümede 10 adede kadar beyin biriktirin (Şekil 4J).
   3. Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için, adım 5.1.4'te açıklandığı gibi yönlendirin (Şekil 4K). Örnekleri birbirine yakın olacak şekilde düzenleyin. Bu, aşamanın numuneler arasında hareket etmesi gereken mesafeyi en aza indirecek ve bu da alım sırasında numune sürüklenmesini azaltacaktır.
   4. Beyinler kuyuya yönlendirildikten sonra, beyinlerin 2-5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Bu, taşıma / görüntüleme sırasında stabilitelerini arttırır. Bu süre zarfında mikroskopu edinim için hazırlayın.
   5. μ slaytı slayt kapağıyla örtün ve mikroskopa aktarın. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için mümkün olan en düşük lazer gücü ve pozlama süresi ile edinmeye başlayın.

6. Veri işleme ve yönetimi için en iyi uygulamalar

1. Verileri mevcut analiz yazılımına göre gerektiği gibi işleyin.
   1. Burada gösterilen örnek için, elde edilen verileri SlideBook yazılımıyla SlideBook Image File (.sld) olarak kaydedin.
   2. Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak Imaris'in tescilli dosya türüne (.ims) dönüştürmek için, Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü ayrı bir pencerede açın. .sld dosyalarını tıklayın ve Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nün " giriş" bölümüne sürükleyin.
   3. Dönüştürülen dosyalar için istediğiniz çıktı konumunu belirleyin ve "Tümünü başlat" ı tıklayın.
   4. Dönüştürmeden sonra, Imaris yazılımındaki verileri görüntüleyin ve bunlara açıklama ekleyin.
      NOT: Görüntü analizi için Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) veya diğerleri gibi Imaris yerine alternatifler kullanılabilir.
2. Doğru kayıt tutma için orijinal verilerin mümkün olduğunca çoğunu saklayın. Örneğin, edinme yazılımı bir dosya biçiminde kaydedilmiş, ancak analiz için farklı bir biçime dönüştürülmüşse, verilerin edinilen sürümünü koruyun.
3. Veri analizi için, örnek ve edinme ayarları hakkında mümkün olduğunca çok ayrıntının kaydını tutun. Saklanacak anahtar bilgiler, disseke edilen larvaların genotipini, diseksiyondan önce larvaların yaşını, yetiştirildikleri yemek kapağının durumunu, görüntüleme sırasında kullanılan lazer gücünü, maruz kalma süresini, edinim uzunluğunu ve zamansal çözünürlüğü içerir.

7. Hücre döngüsü uzunluğunun örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)

NOT: Bu örnekte, polarite işaretleyici Pinleri (Pins::EGFP¹⁶) ve mikrotübül bağlayıcı protein Jüpiter^25'i (cherry::Jüpiter¹³) ifade eden larvalar görüntülenmiştir. Sonraki analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.

1. Seçtiğiniz görüntü analiz yazılımını kullanarak filmi açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin. Bölünen NB'leri farklı mitotik iğlerine göre tanımlayın (Şekil 5C-E).
2. Hücre döngüsü uzunluğunu belirlemek için bir referans hücre döngüsü aşaması tanımlayın. Bu örnekte, metafaz başvuru olarak kullanılmıştır.
3. Ardışık metafazlar arasındaki kare sayısını el ile belirleyin ve bir hücre döngüsünü tamamlamak için geçen süreyi belirlemek için bunu dakikalara veya saatlere dönüştürün.
   1. Bunu, filmin zamansal çözünürlüğünü alarak ve metafazlar arasındaki kare sayısıyla çarparak yapın. Örneğin, filmin zamansal çözünürlüğü her 5 dakikada bir kareyse ve metafazlar kare 13 ve kare 35'te gözlenirse, bu metafazlar arasındaki süre 110 dakika olacaktır ([35 − 13] × 5).
4. Verileri uygun herhangi bir yazılımla çizin. Burada gösterilen veriler PRISM yazılımı kullanılarak çizilmiştir.

8. Hücre mili hizalamasının örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)

NOT: Bu örnekte, analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Film dosyasını Imaris'te veya tercih edilen başka bir yazılımda açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin.
2. Apikal ve bazal sentrozomları ( m ile temsil edilen) kullanarak iş mili kutupları tarafından oluşturulan vektörü aşağıdaki gibi belirleyin:
   
   burada Ax, Ay ve Az , apikal sentrozomun koordinatlarıdır ve Bx, By ve Bz , bazal sentrozomun koordinatlarıdır. Benzer şekilde, bölünme vektörünün ekseni ( n ile temsil edilir) apikal Pinlerin orta noktası tarafından oluşturulur::EGFP hilali ve bazal korteks:
   
   burada Ax, Ay ve Az , Pinlerin orta noktasının koordinatlarıdır::EGFP hilali ve Bx, By ve Bz , bazal korteksin orta noktasının koordinatlarıdır.
3. m ve n vektörlerinin büyüklüğünü belirleyin:
   m büyüklüğü:
   n'nin büyüklüğü:
4. m ve n'nin nokta ürününü (k ile temsil edilen) belirleyin:
   
5. Nokta çarpımı k ve vektör büyüklükleri m ve n'yi kullanarak, vektörler arasındaki açıyı belirleyin:
   
6. Verileri tercih ettiğiniz yazılımda çizin. Burada gösterilen veriler Microsoft Excel'de hazırlanmış ve PRISM'de görselleştirilmiştir.

Pinleri ifade eden merkezi beyin lobu NB'lerinin diseksiyonu ve görüntülenmesi::EGFP ve Cherry::Jüpiter
Bu protokolü sergilemek için, UAS güdümlü Kiraz::Jüpiter13'ü ifade eden larvalar ve endojen olarak etiketlenmiş Pinler::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jüpiter/CyO; Pinler::EGFP/TM6B, Tb) çok kuyulu görüntüleme slaytları kullanılarak tarif edilen protokol kullanılarak 4 saat boyunca görüntülendi (Şekil 5C,D). UAS güdümlü Kiraz::Jüpiter13'ü ifade eden larvalardan ek veriler alındı ve endojen olarak Miranda::EGFP (w; worGal4, UAS-cherry::Zeus/CyO; UAS-Miranda::GFP/TM6B), membrana bağlı bir slayt kullanılarak 10 saat boyunca görüntülenmiştir (Şekil 5E,F). Larvalar, bu protokolün 1. bölümünde açıklandığı gibi kafeslerde yetiştirildi. 72-96 yaşına gelindiğinde larvalar diseke edildi (Şekil 3), monte edildi (Şekil 4) ve görüntülendi. Burada yapılan deneyler için 100 ms pozlama süresi ile lazer gücünde 561 nm, 100 ms pozlama süresi ile lazer gücünde 488 nm lazer kullanılmıştır. Z-yığınları (41 μm) 1 μm adım boyutunda elde edildi. RT'de her 5 dakikada bir, bir Yokogawa CSU-W1 dönen disk ünitesi ve iki Prime 95B Scientific CMOS kameradan oluşan Akıllı Görüntüleme İnovasyonları (3i) dönen disk konfokal sisteminde görüntüler elde edildi. Görüntüleme için Nikon Eclipse Ti mikroskobuna monte edilmiş 60x/1.4NA yağ daldırma hedefi kullanıldı. Canlı görüntüleme vokselleri 0.22 μm x 0.22 μm x 0.75 μm (60x/1.4NA dönen disk) idi.

Önceki raporlar16 ile tutarlı olarak, Pinler mitoz sırasında NB'leri bölmede belirgin bir apikal hilal oluşturdu ve mitotik iğler sürekli olarak bu apikal hilal ile hizalandı (Şekil 5C). Hücre döngüsü uzunluğu, bireysel NB'lerin ardışık metafazları arasındaki sürenin ölçülmesiyle belirlendi (Şekil 5D, F).

Yağ gövdesi takviyesi olmadan 4 saat boyunca çok kuyucuklu bir görüntüleme slaytında görüntülenen örneklerde, hücre döngüsü uzunluğu artan görüntüleme süresi ile artmıştır (Şekil 5C, D). Membrana bağlı bir slayt üzerinde yağ gövdesi takviyeli ortamda görüntülenen örnekler, hücre döngüsü uzunluğunda bir artış göstermedi (Şekil 5E, F). Ayrıca, 10 saatlik membrana bağlı slaytta dört bölümlü NB'ler gözlendi (Şekil 5D'ye karşı Şekil 5F).

Son olarak, bölme ekseni ile mitotik iş mili arasındaki açı, referans olarak GFP etiketli Pinler kullanılarak belirlenmiştir (şematik Şekil 5G'de gösterilmiştir). Mitozda pimlerin oluşturduğu apikal hilalin orta noktasının belirlenmesi ve hücrenin ikiye bölünmesi ile bölünme ekseni belirlendi (Şekil 5G, kırmızı kesikli çizgi). Daha önce tarif edildiği gibi, vahşi tip NB'ler, bölme ekseninden en fazla 30 ° yönlendirilmiş mitotik iğler sergiledi (Loyer ve Januschke36 ve Şekil 5H).

Resim 1: Malzemeler. (A) Diseksiyon mikroskobu. (B) İstenilen genotipteki sinekleri içeren toplama kafesi ve büyüyen larvaları olan bir yemek kapağı. (C) Diseksiyon ve görüntüleme ortamı, 5 mL. (D) Üç farklı koleksiyondan larvalarla yemek kapakları. (E,E') Mikrodiseksiyon aletleri, soldan sağa: mikrodiseksiyon makasları, forsepsler. (F,F') Diseksiyon kabı. (G) Numuneleri görüntülemek için 8 kuyulu μ slayt. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örnek yemek kapakları. (A) Çaprazlanacak erkek ve dişi sineklerin bulunduğu iki şişe, boş bir embriyo toplama kafesi ve taze bir yemek kapağı. (B) Yeni yemek kapağı ile embriyo toplama kafesinin alt kısmı (solda) ve sineklerin bulunduğu kafesin üst kısmı (sağda). (C) Tamamen monte edilmiş sinek kafesi. (D) Diseksiyon için larva içeren iyi hazırlanmış bir yemek kapağı örneği. Yiyeceklerin larvalar tarafından rahatsız edildiğini, ancak aşırı rahatsız edilmediğini unutmayın. (E,F) 4 günlük, aşırı kalabalık yemek kapaklarına iki örnek. Bu yiyeceğin artık çorba benzeri bir kıvama sahip olduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Diseksiyon . (A) Üçüncü bir instar larvasının dorsal görünümü. Larvaların arka ucundaki kırmızı çizgi, ilk kesimin nerede yapılması gerektiğini gösterir. (B) Arka ucu çıkardıktan sonra larvaların dorsal görünümü. (C) Larvaların nasıl tersine çevrileceğini gösteren diyagram. Bir set forseps kullanarak, larvaları ilk kesimin yapıldığı yerin yakınındaki kütikül tarafından tutun. Diğer forsepsleri kullanarak, ters çevirmek için larvaların ön ucuna bastırın. Siyah oklar, forsepslerin yönünü gösterir, biri larvaları ön taraftan "iterek", diğeri ise kesilmiş arka ucu ön uca doğru hareket ettirir. Daha küçük kırmızı ok, şişman vücutların bir karikatürünü gösterir. (D) Şişman cisimler ve sindirim sistemi hala bağlı olan ters çevrilmiş bir larva görünümü. (E) CNS olmayan doku çıkarılmış ters çevrilmiş bir larva görünümü. Kırmızı kesikli çizgi, hala bağlı olan beyni özetler. (F) Beynin kütikülden nasıl çıkarılacağını gösteren şematik. Kırmızı kesikli çizgi, beyni ters çevrilmiş kütikülden serbest bırakmak için mikrodiseksiyon makası ile kesilecek yolu gösterir ve siyah oklar beynin kütikülden çıkarılmasını gösterir. (G) Ventral sinir kordonu (VNC) altındaki az sayıda aksonal bağlantı ile kütiküle hala bağlı olan ters çevrilmiş beynin bir görünümü. (H) İzole larva beyni. Beyin lobları kesikli turuncu çizgilerle özetlenmiştir. (I) İzole edilmiş şişman cisimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Montaj ve görüntüleme. (A) Membrana bağlı metal bir slaytın montajı için bileşenlerin görünümü. (B) Membrana bağlı sürgü bileşenlerinin şeması ve bunların montajı. (C) Metal kızağa yerleştirilen membranın, bölünmüş metal halka tarafından yerinde tutulan yandan görünümü. (D) Kapak kayması olmadan monte edilmiş görüntüleme slaytının üstten görünümü. Yağ cisimleri ve diseke beyinleri içeren diseksiyon ve görüntüleme ortamı membran üzerine yerleştirildi. (E) Ortamdaki şişman cisimlerin ve beyinlerin yakınlaştırılmış görünümü. (F) Cam kapak kayması eklendikten sonra metal slaytın üstten görünümü. (G) Erimiş petrol jölesi ile slayda sabitlenmiş cam kapak kayması ile monte edilmiş slaytın üstten görünümü. Kapak kaymasının kenarlarının petrol jölesi ile kaplanması da ortamın buharlaşmasını önler. (H) Ters çevrilmiş mikroskopta gözlem için yönlendirilmiş beyinlerle birleştirilmiş membran slaytının şeması. Mavi daireler, merkezi beyin loblarındaki ve VNC'deki NB'leri gösterir. (I) Boş bir çok kuyulu slaytın görünümü. (J) Çok kuyulu görüntüleme slaytının bir kuyucuğunun yakınlaştırılmış görünümü. (K) Merkezi beyin loblarını ters çevrilmiş bir mikroskopta çok kuyucuklu bir slaytla görüntülemek için beyin oryantasyonunu gösteren şematik. Mavi daireler, merkezi beyin loblarındaki ve VNC'deki NB'leri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hücre döngüsü uzunluğunun nicelleştirilmesi . (A) Merkezi beyin lobları ve VNC içindeki beyin loblarını, optik lobu (OL, koyu gri), ventral sinir kordonunu (VNC), NB'leri (koyu mavi), GMC'leri (açık mavi) ve nöronları (mor) vurgulayan üçüncü bir instar larva beyninin diyagramı. (B) NB ve GMC bölümlerinin şeması. (C) Beyaz (MTs, UAS-Cherry::Jüpiter) ve apikal Pinler (Pins::EGFP yeşil renkte) etiketli mikrotübüllere sahip vahşi tip bir NB'nin görüntü serisi, 4 saat boyunca yağ gövdesi takviyesi olmadan çok kuyucuklu bir slaytta görüntülenmiştir. Birleştirilmiş görüntüler ve hücre döngüsü zamanlamasına sahip ilgili soyağacı aşağıda gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Yağ gövdeleri olmayan çok kuyucuklu bir slaytta görüntülenen örneklerdeki birinci, ikinci ve üçüncü bölümler için hücre döngüsü uzunluğunun (metafaz - metafaz) ölçülmesi. (E) Beyaz (MTs, UAS-Cherry::Jüpiter) etiketli mikrotübüllere sahip vahşi tip bir NB'nin görüntü serisi, aşağıda gösterilen karşılık gelen soy ağacı ve hücre döngüsü zamanlaması ile 10 saat boyunca yağ gövdesi takviyesi ile membrana bağlı bir slaytla görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F) Yağ gövdeli membrana bağlı bir slaytta görüntülenen örneklerdeki birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü bölümler için hücre döngüsü uzunluğunun (metafaz - metafaz) ölçülmesi. (G) İş mili ekseni (turuncu kesikli çizgi) ile bölme ekseni (θ, kırmızı kesikli çizgi) arasındaki açının nasıl belirlendiğinin şeması. (H) Yağ gövdeleri olmayan çok kuyucuklu bir slayt kullanılarak görüntülenen 10 hücreden θ miktarının belirlenmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal açıklama bulunmamaktadır.