Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila nöral kök hücreleri (nöroblastlar, bundan sonra NB'ler) asimetrik bölünmelere uğrar, kendini yenileyen nöroblastı yenilerken, aynı zamanda iki nöron veya glia'ya yol açmak için ek bir bölünmeye uğrayacak olan farklılaştırıcı bir gangliyon ana hücresi (GMC) oluşturur. NB'lerde yapılan çalışmalar, hücre polaritesi, iğ oryantasyonu, nöral kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmanın altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. Bu asimetrik hücre bölünmeleri, canlı hücre görüntüleme yoluyla kolayca gözlemlenebilir, bu da larva NB'leri canlı dokudaki asimetrik hücre bölünmesinin mekansal zamansal dinamiklerini araştırmak için ideal hale getirir. Besin takviyeli ortamda düzgün bir şekilde diseke edildiğinde ve görüntülendiğinde, eksplant beyinlerindeki NB'ler 12-20 saat boyunca sağlam bir şekilde bölünür. Daha önce açıklanan yöntemler teknik olarak zordur ve bu alanda yeni olanlar için zorlayıcı olabilir. Burada, yağ vücut takviyeleri kullanılarak canlı üçüncü instar larva beyin eksplantlarının hazırlanması, diseksiyonu, montajı ve görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Olası problemler de tartışılmakta ve bu tekniğin nasıl kullanılabileceğine dair örnekler verilmektedir.
Giriş
Asimetrik hücre bölünmesi (ACD), RNA, proteinler ve organeller gibi hücre altı bileşenlerinyavru hücreler 1,2 arasında eşit olmayan bir şekilde bölündüğü süreçtir. Bu süreç, farklı gelişimsel kaderlere sahip yavru hücrelere yol açmak için ACD'ye maruz kalan kök hücrelerde yaygın olarak görülür. Drosophila NB'ler, kökünü koruyan bir NB ve bir ganglion ana hücresi (GMC) üretmek için asimetrik olarak bölünür. GMC, farklılaştırıcı nöronlar veya glia3 üretmek için daha fazla bölünmeye uğrar. Asimetrik olarak bölünen NB'ler, mikroskopi ile kolayca gözlemlenen üçüncü instar larvaların....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Şekil 1'de bu etüdü gerçekleştirmek için gerekli malzemeler gösterilmektedir.
1. Deney için dikkat edilmesi gereken noktalar ve hazırlıklar
- Larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin.
NOT: Eksplant larva beyinlerinin kalitesi, diseksiyon öncesi larvaların sağlığı ve kalitesi ile doğrudan ilişkilidir. Aşırı kalabalıktan yetersiz beslenen larvalar genellikle daha düşük kaliteli beyinler verir30.- Yetersiz beslenmeyi önlemek için yemek kapağı kabı başına 20-30'dan fazla larva bulunmadığından emin olun. Bunların örnekleri Şekil 2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Pinleri ifade eden merkezi beyin lobu NB'lerinin diseksiyonu ve görüntülenmesi::EGFP ve Cherry::Jüpiter
Bu protokolü sergilemek için, UAS güdümlü Kiraz::Jüpiter13'ü ifade eden larvalar ve endojen olarak etiketlenmiş Pinler::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jüpiter/CyO; Pinler::EGFP/TM6B, Tb) çok kuyulu görüntüleme slaytları kullanılarak tarif edilen protokol kullanılarak 4 saat boyunca görüntülendi (Şekil 5C,D).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarından canlı eksplant beyinlerinin görüntülenmesi için bir yaklaşımı özetlemektedir. Burada açıklanan protokol, eksplant beyinlerinin doğru deneysel koşullar altında 12-20 saat boyunca gözlemlenmesini sağlar. Numunelerin hazırlanmasına ve istenen deneylerin tasarımına özel dikkat gösterilmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi, disseke edilmiş dokunun kalitesini belirleyen en kritik faktörlerden biri larvaların sağlığıdır. Mümkün olan en yüksek kaliteyi elde etmek için, la.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal açıklama bulunmamaktadır.
Teşekkürler
Bu araştırma R35GM148160 (C. C.) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Eğitim Hibesi T32 GM007270 (R. C. S) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; m polietersülfon (PES) Membran | Genesee | 25-231 | Vakumlu filtreler |
| Agar | Genesee | 20-248 | granül agar |
| Analitik Bilgisayar | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU, iki adet 3,80 GHz işlemcili, 64 bit işletim sisteminde Windows 10 çalıştıran |
| Sığır Büyüme Serumu | HyClone | SH30541.02 | |
| Odacıklı Görüntüleme Slaytları | Ibidi | 80826 | |
| Konfokal Mikroskop | Nikon | NA | |
| Özel işlenmiş metal slayt | NA | NA | özellikler için Cabernard ve Doe 2013'e (Ref. 34) bakın |
| Diseksiyon Tabakları | Fisher Scientific | 5024343 | 3 kuyulu porselen mikro spot plaka |
| Diseksiyon Forseps | Dünyası Hassas Aletler | Dumont #5 | |
| Diseksiyon Mikroskobu | Leica | NA | |
| Diseksiyon Makası | Güzel Bilim Araçları (FST) | 15003-08 | |
| Embriyo toplama kafesi | Genesee | 59-100 | |
| Yetişkin sinekleri uyuşturmak için CO2 erişimli flypad | Genesee | 59-172 | |
| Gaz geçirgen membran | YSI | 98095 | Gaz geçirgen membran |
| Cam Kapak Slaytlar Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 72204-03# | 1.5; 22 mm x 40 mm cam lameller |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatifleri: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris Dosya Dönüştürücü | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Maya | Saf-Instant | NA | |
| Pekmez | Genesee | 62-117 | |
| Petri kabı | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri kabı |
| Petrol Jeli | Vazelin | NA | |
| Schneider'in L-glutamin ve sodyum bikarbonat sıvılı Böcek Ortamı | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook edinme yazılımı | 3i | NA | |
| Vakumla Çalışan Filtrasyon Ünitesi, 0.22 & mikro; &mikro; m PES membran filtre | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Kaynaklar
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
