Burada, diğer beyin bölgelerinde herhangi bir etkiden kaçınırken koroid pleksustaki gen ekspresyonlarını seçici olarak değiştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Koroid pleksustaki genlerin hedefli yıkımı
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Koroid pleksus (ChP), hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında merkezi sinir sistemine (MSS) immün hücre infiltrasyonu için kritik bir geçit görevi görür. Son araştırmalar, ChP aktivitesinin düzenlenmesinin CNS bozukluklarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerini etkilemeden ChP'nin biyolojik işlevini incelemek, hassas yapısı nedeniyle zordur. Bu çalışma, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler) veya TAT dizisinden (CRE-TAT) oluşan siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) rekombinaz proteini kullanılarak ChP dokusunda gen yıkımı için yeni bir yöntem sunmaktadır. Sonuçlar, lateral ventriküle AAV veya CRE-TAT enjekte edildikten sonra, floresansın sadece ChP'de yoğunlaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, çalışma, RNA interferansı (RNAi) veya X-overP1 (Cre / LoxP) sistemlerinin Cre / lokusu kullanılarak ChP'deki adenozin A2A reseptörünü (A2AR) başarılı bir şekilde yıktı ve bu yıkımın deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) patolojisini hafifletebileceğini gösterdi. Bu teknik, ChP'nin CNS bozukluklarındaki rolü üzerine gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahip olabilir.
Giriş
Koroid pleksusun (ChP) genellikle beyin omurilik sıvısı (BOS) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) salgılayarak beyin fonksiyonel homeostazının korunmasına yardımcı olduğu düşünülüyordu1,2. Son otuz yılda artan araştırmalar, CHP'nin merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu için farklı bir yolu temsil ettiğini ortaya koymuştur.
Tek katmanlı bir ChP epitelinden oluşan ChP'nin sıkı bağlantıları (TJ'ler), makromoleküllerin ve bağışıklık hücrelerinin beyne girmesini önleyerek immünolojik homeostazı korur3. Bununla birlikte, belirli pato....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunda belirtilen ve Wenzhou Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.
1. Hayvanlar
- 8-12 haftalık ve 20-22 g ağırlığındaki erkek C57BL/6 fareleri satın alın.
- Transgenik Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) fare serisini ve erkek A2AR flox/flox farelerini edinin.
- Fareleri rastgele iki gruba atayın ve 1 hafta boyunca standart 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında kafes başına en f....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
AAV2 / 5-shRNA veya CRE-TAT'ın ICV enjeksiyonu ile ChP'ye özgü A2AR yıkımı
EAE patogenezinde nöral bilginin güçlü bir düzenleyicisi olarak CHP'deki A2AR'nin rolü belirsizliğini korumaktadır. ChP'ye özgü A 2A R ekspresyonunun yıkılması, EAE ve diğer sinir sistemi iltihaplanmalarında A2AR'nin merkezi bağışıklık sistemi üzerindeki düzenleyici etkilerine ışık tutabilir. Bu çalışmada, A 2A R flox/ flox farelerinin CHP'sindeA 2AR ekspresyonun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Araştırma, ChP genlerinin hedeflenen yıkımı için iki farklı yaklaşım sundu. İlk yaklaşım, Cre rekombinaz içeren CRE-TAT'ın A2AR flox/flox farelerine ICV enjeksiyonunu içeriyordu. İkinci yaklaşım, A2AR'nin shRNA'sını taşıyan AAV2/5'in ICV enjeksiyonunu gerektiriyordu. Bu iki stratejiyi kullanarak, çalışma ChP içinde A 2A R'nin seçici olarak yıkılmasını sağladı ve ChP'de A2AR sinyalini inhibe etmenin EAE patolojisi üzerindeki koruyucuetkilerini gösterebildi. Bu protoko.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, beyan etmek için rekabet eden mali çıkarları veya başka açıklamaları olmadığını belirtmektedir.
Teşekkürler
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (31800903 No'lu Hibe, W. Zheng'e verildi) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi'nin (No. Y2020426, Y. Y. Weng'e verildi) bu çalışma için desteğini minnetle kabul ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A2ARflox/flox fareler | Devlet Anahtar Oftalmoloji, Optometri ve Görsel Bilimler Laboratuvarı, Wenzhou Tıp Üniversitesi | ||
| AAV2 / 5-A < sub>2A< / sub>R-ShRNA virüsü | Şanghay Heyuan Biyoteknoloji A.Ş. | LTD PT-4828 | |
| antifade montaj ortamı | Beyotime Biyoteknoloji | 0100-01 | |
| borosilikat cam kılcal | Pekin Meiyaxian Technology Co., Ltd | B100-50-10 | |
| beyin stereotaksik aparatı | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL / 6 fare | Pekin Hayati Charles Nehri Laboratuvar Hayvanları Teknolojisi Şirketi | ||
| CRE-TAT rekombinaz | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| dondurulmuş dilimleme makinesi | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson ve şirket | 231141 | |
| Hamilton şırınga | Hamilton, Amerikan | P / N: 86259 | |
| Eksik Freunds adjuvan | Sigma | F5506 | |
| Lazer konfokal mikroskop | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT yapıştırıcı | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehit | Chengdu Kelong Kimyasal Reaktif Şirketi | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodyum | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipet tabancası | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1. İplikçik cDNA Sentez Kiti | Takara | 6110A Gerçek Zamanlı | |
| PCR Sistemi | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdDomates fareleri | Jackson Laboratuvarı | ||
| sükroz | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| süper yüksek hızlı homojenizatör | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| ksilen çözeltisi | Chengdu Kelong Kimyasal Reaktif Şirketi | 1330-20-7 |
Kaynaklar
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
