Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Mitokondri, ara metabolizma ve ATP üretimi, iyon homeostazı, lipid biyosentezi ve programlanmış hücre ölümü (apoptoz) dahil olmak üzere birçok önemli hücresel süreci düzenlemekten sorumlu olan endosimbiyotik kökenli ökaryotik organellerdir. Bu organeller topolojik olarak karmaşıktır ve birden fazla alt bölme¹ oluşturan bir çift zar sistemi içerir (Şekil 1A). Dış mitokondriyal membran (OMM) sitozol ile arayüz oluşturur ve doğrudan organeller arası temaslar kurar ^2,3. İç mitokondriyal membran (IMM), ATP sentezini ve diğer enerji gerektiren süreçleri ^4,5 yönlendirmek için esas olarak bir elektrik membran potansiyeli (ΔΨ_m) olarak depolanan iyon gradyanlarını koruyan enerji tasarrufu sağlayan bir membrandır. IMM ayrıca, OMM'ye yakından bastırılan iç sınır zarına (IBM) ve cristae membranı (CM) tarafından bağlanan cristae adı verilen çıkıntılı yapılara bölünmüştür. Bu zar, en içteki matris bölmesini intrakristal boşluktan (ICS) ve zarlar arası boşluktan (IMS) ayırır.

Mitokondri, dinamin süper ailesinin⁶ mekanoenzimleri tarafından yönetilen sürekli ve dengeli fisyon ve füzyon süreçlerine dayanan dinamik bir morfolojiye sahiptir. Füzyon, bağlantının artmasına ve retiküler ağların oluşumuna izin verirken, fisyon mitokondriyal parçalanmaya yol açar ve hasarlı mitokondrinin mitofaji ile uzaklaştırılmasını sağlar⁷. Mitokondriyal morfoloji, doku tipi⁸ ve gelişim evresi^9'a göre değişir ve hücrelerin enerjik ihtiyaçlar^10,11 ve stresörler ¹² gibi faktörlere uyum sağlamasına izin verecek şekilde düzenlenir. Mitokondrinin ağ oluşumunun kapsamı (birbirine bağlı ve parçalanmış), çevre, alan, hacim, uzunluk (en boy oranı), yuvarlaklık ve dallanma derecesi gibi standart morfometrik özellikleri, standart optik mikroskopi ile ölçülebilir ve ölçülebilir, çünkü bu özelliklerin boyutları ışığın kırınım sınırından (~200 nm) daha ^{büyüktür13}.

Cristae mimarisi, mitokondrinin iç yapısını tanımlar (Şekil 1B). Krista morfolojilerinin çeşitliliği genel olarak düz (lameller veya diskoidal) veya tübüler-veziküler¹⁴ olarak kategorize edilebilir. Tüm cristae, IMS'yi ICS'den ve IBM'i CM^15'ten bölümlere ayırmaya hizmet edebilen cristae bağlantıları (CJ'ler) olarak adlandırılan boru şeklindeki veya yuva benzeri yapılar aracılığıyla IBM'e bağlanır. Cristae morfolojisi, (1) CJ'lerde bulunan ve IMM-OMM kontaklarını stabilize eden mitokondriyal temas bölgesi ve cristae düzenleme sistemi (MICOS) dahil olmak üzere IMM'nin temel protein kompleksleri tarafından düzenlenir 16, (2) optik atrofi 1 (OPA1) CRISTA yeniden şekillenmesini düzenleyen GTPaz 17,18,19 ve (3) cristae uçlarında (CT'ler) stabilize edici oligomerik düzenekler oluşturan F ₁F_O ATP ^{sentaz20, 21}. Ek olarak, IMM, oldukça kavisli IMM^22'yi stabilize eden iki tabakalı olmayan fosfolipidler fosfatidiletanolamin ve kardiyolipin bakımından zenginleştirilmiştir. Cristae ayrıca dinamiktir, farklı metabolik durumlar 23,24, farklı solunum substratları²⁵, açlık ve oksidatif stres 26,27, apoptoz ^28,29 ve yaşlanma³⁰ gibi çeşitli koşullar altında morfolojik değişiklikler gösterir. Son zamanlarda, cristae'nin saniyeler içinde büyük yeniden şekillenme olaylarına maruz kalabileceği ve dinamik doğalarının altını çizdiği gösterilmiştir³¹. Bireysel cristae içindeki yapıların boyutları (örneğin, CJ genişliği, crista uzunluğu ve genişliği) ve bireysel crista'yı diğer yapılarla ilişkilendiren parametreler (örneğin, cristae içi boşluk ve OMM'ye göre cristae olay açısı) dahil olmak üzere cristae'nin çeşitli özellikleri ^{ölçülebilir32}. Bu ölçülebilir cristae parametreleri, fonksiyon ile doğrudan bir korelasyon gösterir. Örneğin, mitokondriyal ATP üretiminin kapsamı, cristae yoğunluğu veya başka bir özelliğe normalleştirilmiş cristae sayısı olarak ölçülen cristae bolluğu ile pozitif ilişkilidir (örneğin, OMM alanı başına cristae)^33,34,35. IMM morfolojisi nano ölçekli özelliklerle tanımlandığından, ışık kırınım sınırından daha yüksek çözünürlük sağlayan görüntüleme teknikleri gerektiren mitokondriyal üst yapıyı içerir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu tür teknikler arasında elektron mikroskobu ve süper çözünürlüklü mikroskopi (nanoskopi) bulunur.

Merkezi sinir sisteminin (CNS) nöral ve glial hücreleri özellikle mitokondriyal fonksiyona bağlıdır. Ortalama olarak, beyin toplam vücut ağırlığının sadece %2'sini oluşturur, ancak toplam vücut glikozunun %25'ini kullanır ve vücut oksijen tüketiminin %20'sini oluşturur, bu da onu enerji metabolizmasındaki bozulmalara karşı savunmasız hale getirir³⁶. Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington hastalığı (HD), multipl skleroz (MS) ve Parkinson hastalığı (PD) dahil olmak üzere ilerleyici nörodejeneratif hastalıklar (ND'ler), bugüne kadar en kapsamlı şekilde çalışılan patolojilerden bazılarıdır ve bu hastalıkların moleküler temellerini anlamaktan potansiyel terapötik önleme ve müdahaleler aramaya kadar uzanan araştırma çabaları. ND'ler, kısmen mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC)³⁷ tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinden (ROS) kaynaklanan artan oksidatif stresin yanı sıra değişen mitokondriyal kalsiyum işleme 38 ve mitokondriyal lipid metabolizması³⁹ ile ilişkilidir. Bu fizyolojik değişikliklere, MS 40,41,42,43,44, ALS 45,46, HD^47,48,49, MS 50 ve PD ^51,52,53 ile ilişkili mitokondriyal morfolojide belirtilen kusurlar eşlik eder. Bu yapısal ve işlevsel kusurlar, karmaşık neden-sonuç ilişkileriyle birleştirilebilir. Örneğin, cristae morfolojisinin OXPHOS enzimlerini⁵⁴ stabilize ettiği göz önüne alındığında, mitokondriyal ROS sadece ETC tarafından üretilmekle kalmaz, aynı zamanda ETC'nin bulunduğu altyapıya zarar vermek için hareket eder ve oksidatif hasara duyarlılığı artıran ileri beslemeli bir ROS döngüsünü teşvik eder. Ayrıca, cristae düzensizliğinin mitokondriyal DNA (mtDNA) salınımı ve otoimmün, metabolik ve yaşa bağlı bozukluklara bağlı inflamatuar yollar gibi süreçleri tetiklediği gösterilmiştir⁵⁵. Bu nedenle, mitokondriyal yapının analizi, ND'lerin ve bunların moleküler temellerinin tam olarak anlaşılması için anahtardır.

Transmisyon elektron mikroskobu, elektron tomografisi ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ve X-ışını tomografisi, özellikle kriyo-yumuşak X-ışını tomografisi dahil olmak üzere kristaları görüntülemenin popüler yöntemleri önemli bulgular ortaya çıkarmış ve çeşitli numune türleri ile çalışmıştır 56,57,58,59,60 . Organel üst yapının daha iyi gözlemlenmesine yönelik son gelişmelere rağmen, bu yöntemler hala numune fiksasyonu gerektirme uyarısı ile birlikte gelir ve bu nedenle, cristae'nin gerçek zamanlı dinamiklerini doğrudan yakalayamaz. Süper çözünürlüklü floresan mikroskobu, özellikle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM), genleşme mikroskobu (ExM) ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu, klasik optik mikroskopi yöntemlerini kısıtlayan kırınım sınırının altında çözünürlük gerektiren yapıları görüntülemenin popüler yolları haline gelmiştir. ExM başka bir süper çözünürlük tekniği ile birlikte kullanıldığında, sonuçlar etkileyicidir, ancak numune bir jel⁶¹ içinde sabitlenmeli ve boyanmalıdır. Karşılaştırıldığında, SIM, PALM / STORM ve STED'in tümü canlı örneklerle başarıyla kullanılmıştır ve genellikle IMM'yi boyayan yeni ve umut verici boyalar, mitokondri cristae dinamiklerinin^canlı görüntülenmesi için yeni ve kolay bir yaklaşım sağlar 62,63,64,65,66. STED görüntüleme için canlı boyalardaki son gelişmeler, boya parlaklığını ve fotostabiliteyi iyileştirmiştir ve bu boyalar, IMM'yi öncekilerden daha yüksek bir özgüllük derecesinde hedeflemektedir. Bu gelişmeler, süper çözünürlüklü görüntüleme ile uzun vadeli timelapse ve z-stack deneylerinin toplanmasına izin vererek, mitokondriyal üst yapı ve dinamiklerin daha iyi canlı hücre analizine kapı açar.

Burada, STED⁶³ kullanılarak PKmito Orange (PKMO) boyası ile boyanmış farklılaşmamış ve farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi için protokoller sağlanmaktadır. SH-SY5Y hücre hattı, metastatik nöroblastom^{67,68,69,70'in} kemik iliği biyopsisinden üretilen ebeveyn hücre hattı SK-N-SH'den üç kez alt klonlanmış bir türevdir. Bu hücre hattı, ND araştırmalarında, özellikle mitokondriyal disfonksiyonun yoğun bir şekilde dahil olduğu AD, HD ve PD gibi hastalıklarda yaygın olarak kullanılan bir in vitro modeldir 10,43,71,72,73. SH-SY5Y hücrelerini, kültür ortamını manipüle ederek nöron benzeri bir fenotipe sahip hücrelere ayırt etme yeteneğinin, birincil nöronal hücrelere güvenmeden sinirbilim araştırmaları için uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır^10,74. Bu protokolde, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşmasını indüklemek için hücre kültürü ortamına retinoik asit (RA) eklendi. RA bir A vitamini türevidir ve hücre döngüsünü düzenlediği ve nöronal farklılaşmayı düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu desteklediği gösterilmiştir⁷⁵. Sıçan hipokampusundan izole edilen nöronların kültürlenmesi ve canlı hücre görüntülemesi için bir protokol de sağlanmıştır. Hipokampusun mitokondriyal dejenerasyondan etkilendiği ve korteks ile birlikte yaşlanmada önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve ND 76,77,78,79,80.

1. SH-SY5Y hücrelerinin yayılması ve farklılaşması

1. Hücre büyümesi ve bakımı için ortamın hazırlanması
   1. Eksiksiz, yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu (DMEM, 4.5 g / L D-glikoz, 4 mM L-glutamin, 110 mg / L sodyum piruvat) nihai% 1 (h / h) antibiyotik-antimikotik (10.000 birim / mL penisilin, 10.000 μg / mL streptomisin ve 25 μg / mL Amfoterisin B) ve değişen miktarlarda fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edin (bkz. Farklılaşma ortamındaki FBS miktarları nihai %10, %5 veya %2 (h/h) FBS arasında değişmektedir.
2. Hücre bakımı
   1. Hücreleri %10 (h/h) FBS ile takviye edilmiş DMEM'de tutun ve 37 °C ve %5_CO2'ye yerleştirin, ardından farklılaşma için %5 (h/h) FBS içeren DMEM'e tohumlayın. Donmuş hücre stokları FBS'de 1-2 x 10⁷ hücre/mL'de %10 (h/h) dimetil sülfoksit (DMSO) ile depolandı.
3. Retinoik asidin (RA) hazırlanması
   1. 5 mM stok çözeltisi elde etmek için 7.51 mg all-trans-RA'yı (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 mL taze hazırlanmış% 95 etanol içinde çözün. Stok çözeltisinin etanol içinde 5 μM'de seyreltilmesi kullanılarak, üreticinin protokolü^81'deki ürün bilgi sayfasından elde edilen 350 nm'de (ɛ = 44.300 M-1 ^cm-1) absorbanslı konsantrasyonu doğrulayın. 5 mM stoğu ışıktan koruyarak 4 °C'de 6 haftaya kadar saklayın.
4. Lamel kaplama için poli-D-lizin hazırlanması
   NOT: Satıcı sitesi^82'nin Belgeler ve İndirmeler bölümünde bulunan poli-D-lizin (PDL) ürün protokolü, çeşitli kültür kaplarının kaplanması için bilgi sağlar.
   1. Bu protokol, steril #1.5 borosilikat örtü camı tabanları ile oyuk başına 4 cm 2 alana sahip² oyuklu odacıklı bir kaba dayalı hacimleri içerir (bkz. PDL'nin stok çözeltisini Dulbecco'nun PBS'si (DPBS; kalsiyum yok, magnezyum yok) ile iki kat 50 μg / mL'ye seyreltin.
      NOT: #1.5 veya #1.5H kapak camı, görüntü kalitesi için gerekli olan kabul edilebilir kalınlıklardır. Diğer kalınlıklar küresel sapmaya neden olur ve bundan kaçınılmalıdır.
5. PDL ile lamel kaplama
   NOT: Lameller, daha fazla sterilizasyon için bir biyogüvenlik kabininde 10-15 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılabilir.
   1. Bir hücre kültürü kabinindeki steril odacıklı lamellerin her bir oyuğuna 1.2 mL 50 μg / mL PDL çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PDL solüsyonunu çıkarın ve 3.6 mL damıtılmış su ile üç kez durulayın. Son yıkamayı tamamladıktan sonra, durulamadan ve hemen kullanmadan önce kaplanmış haznenin havaya maruz kalarak 2 saat kurumasını bekleyin veya hava geçirmez bir kapta 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
      NOT: Fazla PDL hücreler için toksik olabileceğinden lamelleri iyice durulayın.
6. SH-SY5Y hücrelerinin RA ile farklılaşması
   NOT: 15. pasajın üzerindeki hücreleri kullanmayın. Hücreler %80-90 birleşimde geçer. Farklılaşma prosedürleri farklıdır ancak benzer adımları takip eder. Nöroblastomlardan olgun nöronlara ek farklılaşma, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)68,83,84,85 ile daha ileri tedavi ile elde edilir^, ancak bu protokolde gerçekleştirilmemiştir.
   İSTEĞE BAĞLI: Kapak camına tohumlamadan önce en az 24 saat hücreler oluşturun. Dondurulmuş stoklardan hücre hazırlamak için, 1 mL donmuş hücre şişesini hızla çözün ve% 10 FBS ile desteklenmiş 9 mL önceden ısıtılmış ortama ekleyin, ardından 10 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 350 x g'da döndürün ve DMSO'yu çıkarmak için süpernatanı atın. Hücre peletini 5 mL önceden ısıtılmış ortamda ve tohum hücrelerini bir T-25 şişesinde yeniden süspanse edin. Hücreler %80-90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri sayarak ve uygun olduğunda farklılaşma için tohumlayarak geçirin.
   1. 0. Gün: Tohum hücreleri.
      1. Hücreleri, donmuş stoklardan veya çalışan bir şişeden odacıklı bir kapak camına tohumlayın. 1,5 x 10⁴ hücre/^cm2 tohumlama yoğunluğu kullanın.
         NOT:^{4 cm2} kültür alanına sahip standart 2 oyuklu odacıklı bir kapak camındaki tek bir kuyucuk 6.0 x 10⁴ hücre gerektirecektir. Farklılaşmayacak hücreler %10 (h/h) FBS ile desteklenmiş DMEM ile, farklılaşacak hücreler ise %5 (h/h) FBS ile desteklenmiş DMEM ile tohumlanmalıdır.
   2. 1. Gün: RA farklılaşma tedavisine başlayın.
      1. Bu farklılaşma prosedürü için araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere% 5 (h / h) FBS,% 1 (h / h) antibiyotik-antimikotik ve% 10 μM RA veya aynı katkı hacmine sahip etanol nihai konsantrasyonu ile desteklenmiş DMEM hazırlayın. Tohumlama için kullanılan odacıklı kapak camındaki ortamı çıkarın, 1x PBS ile durulayın ve yeni DMEM'i kuyucuklara ekleyin.
   3. 3. Gün: Ortamı taze RA veya etanol içeren ortamla değiştirin.
      1. 1. Günden itibaren medyayı çıkarın ve bu farklılaştırma prosedürü için araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere %2 (h/h) FBS, %1 (h/h) antibiyotik-antimikotik ve aynı katkı hacmine sahip 10 μM RA veya %95 etanol ile desteklenmiş taze ortamla değiştirin. Tohumlama için kullanılan odacıklı kapak camındaki ortamı çıkarın, 1x PBS ile durulayın ve kuyucuklara yeni ortam ekleyin.
   4. 6. Gün: Hücrelerin görüntülenmesini gerçekleştirin.
      NOT: Hücre farklılaşma süreleri protokole göre değişir, ancak RA'ya altı gün maruz kalmak, SH-SY5Y hücrelerinde nöron benzeri bir fenotipi indüklemek için yeterlidir⁸⁶.
      1. Bölüm 3 ve 4'teki ayrıntılarla canlı görüntüleme gerçekleştirin (Şekil 2).

2. Birincil sıçan hipokampal nöron kültürü

1. Sıçan hipokampal nöron izolasyonu için malzeme hazırlama.
   1. Taze takviye edilmiş DMEM hazırlayın.
      1. %10 (h/h) ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS, %1 (h/h) sodyum piruvat çözeltisi ve %1 (h/h) penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) ile desteklenmiş bir DMEM (yüksek glikoz, sodyum piruvat içermeyen) karışımını filtreyle sterilize edin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
   2. Taze takviye edilmiş nöron büyüme ortamı hazırlayın.
      1. %2 (h/h) B27 takviyesi, %0.25 (h/h) glutamin takviyesi ve %1 (h/h) penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş bir nöron büyüme ortamı karışımını filtreyle sterilize edin (bkz. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
2. Birincil hipokampal nöron kültürünü hazırlayın.
   1. Daha önce yayınlanmış çalışmayı⁸⁷ ve diseke edilmiş E18 sıçan hipokampusunun elde edildiği üreticinin sitesindeki ürün protokolünden⁸⁸ birincil hipokampal nöron kültürünü hazırlayın (bkz. Bu protokol, %<2 astrosit içeren çoğunlukla nöronal bir popülasyonla sonuçlanır.
      NOT: Bu dokunun gönderildiği hazırda bekletme ortamı, bu protokolün gelecekteki adımları için kullanılacaktır. Atmayın.
   2. Doku ayrışması için malzeme ve ortam hazırlayın.
      1. Açıklık çapını azaltmak için bir Pasteur pipetini alevlendirin ve kullanıma kadar kontaminasyonu önlemek için folyoda saklayın. Hazırlanan DMEM'i, 1X Hank'in Tamponlu Tuz Çözeltisini (HBSS) ve nöron büyüme ortamını 37 °C'ye ısıtın. 15 mL'lik konik bir tüpe steril cımbızla 2 pul DNAaz ekleyin.
   3. Doku ayrışması gerçekleştirin.
      1. Dokuyu DNAaz içeren 15 mL'lik konik tüpe yerleştirmeden ve 37 ° C'de kısa bir süre inkübe etmeden önce, diseke edilmiş E18 sıçan hipokampusunun depolandığı hazırda bekletme ortamının mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. 900 μL 1X HBSS ve ardından 100 μL% 0.5 tripsin ekleyin. Dokuyu 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.
         NOT: PDL kaplı plakalar depodan çıkarılabilir ve bu inkübasyon süresi boyunca kullanılana kadar bir inkübatöre yerleştirilebilir.
   4. Doku homojenizasyonu ve hücre sayımı gerçekleştirin.
      1. Tripsin ile inkübasyonun ardından, besiyerini çıkarın ve dokuya önceki adımdan 1 mL önceden ısıtılmış hazırda bekletme besiyeri-DNAaz ekleyin ve Pasteur pipeti ile homojenize edin. Medya opak görünecek ve homojenizasyon devam ettikçe yavaş yavaş netleşecektir.
      2. 4 mL önceden ısıtılmış DMEM ile yeni bir tüpe ayrışmış nöronlar ekleyin ve ardından bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   5. Hücre kaplamasını ve birincil hücrelerin büyümesini gerçekleştirin.
      1. DMEM'de yaklaşık 1.65 x 10⁴ hücre/^cm2 yoğunlukta plaka hücreleri. 2 oyuklu odacıklı bir kapak camı (4^cm2) için, 2 mL DMEM ile oyuk başına 65.000 – 70.000 hücre tohumlayın. Yapışmayı kontrol etmeden önce hücreleri 37 °C ve %5_CO2'de 2 saat inkübe edin. Hücreler yapışmaya başladığında, 1 mL ortamı çıkarın ve aynı hacimde hazırda bekletme ortamıyla değiştirin, ardından karıştırmak için hafifçe çalkalayın. Ortam karıştırıldıktan sonra, bu işlemi tekrarlayın ve mevcut ortamın yarısını çıkarın ve aynı hacimde nöron büyüme ortamı ile değiştirin, ardından yavaşça karıştırın.
         NOT: Kaplama günü, in vitro (DIV) 0 günü olarak kabul edilir ve hücreler DIV 7'de görüntülenmeye hazırdır (Şekil 2).

3. Canlı hücre görüntüleme için hücrelerin hazırlanması

NOT: Hücre tipleri ve orijini (yani, kültürlenmiş ve birincil hücreler) boyama gereksinimlerine göre farklılık gösterebilir; Daha fazla ayrıntı için yayınlanmış raporlara bakın^62,63.

1. PKmito Portakal Hazırlanışı
   NOT: Genel olarak İBB'yi lekeleyen diğer boyalar^64,65,66 olarak bildirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilir. PKMO, bu protokolde kullanılan tek protokoldür.
   1. Toz PKMO'yu (Malzeme Tablosuna bakın) üreticinin talimatlarına göre DMSO'da yeniden süspanse edin⁸⁹. Ortamı hücrelerden aspire edin ve önceden ısıtılmış fenol kırmızısı içermeyen ortamda yıkayın. Farklılaşma durumuna bağlı olarak %2 (h/h) FBS veya %10 (h/v), 20 mM'lik nihai konsantrasyona kadar HEPES ve %1 (h/h) antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış, fenol kırmızısı içermeyen DMEM'de bir PKMO stoğu hazırlayın. PKMO içermeyen bu formülasyon, canlı hücre görüntüleme ortamıdır.
2. PKMO ile hücre boyama
   1. Hücreleri boya ile 37 ° C'de ve% 5_CO2'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri canlı hücre görüntüleme ortamıyla üç kez yıkayın ve son yıkama için 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
   2. Taze, önceden ısıtılmış canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin. Hücreler artık görüntüleme için hazırdır.
      NOT: Akut tedaviler (ör., ilaçlar ve/veya stresörler), kullanıldığında, canlı görüntülemeden önce eklenir; Tartışma bölümüne ve Ek Şekil 1'e bakın.

4. STED mikroskobu ile canlı hücrelerin görüntülenmesi

NOT: Bu protokol, Malzeme Tablosunda belirtilen sistemle ters çevrilmiş bir mikroskop etrafında inşa edilmiş bir STED sistemi kullanır. Bu sistem, darbeli uyarma lazerleri (nominal güç ~300 μW ile 561 nm lazer) ve darbeli 775 nm STED tükenme lazeri (nominal güç 1,2 W), sürekli ayarlanabilir bir galvano tarayıcı ve 615/20 nm filtre tabanlı çığ fotodiyot dedektörü (APD) ile donatılmıştır. Burada STED için 100x/1.40 yağa daldırma lensi kullanılmıştır. Görüntü alımı için Lightbox yazılımı kullanılır. Sağlanan tüm detaylar doğrudan bu yazılım ve sistem kurulumu ile ilgilidir.

1. Görüntüleme için genel yönergeler ve adımlar
   1. Hücre canlılığını korumak için bir sahne üstü inkübatör veya çevre odası kullanın, ancak kısa süreli oda sıcaklığı deneyleri de kabul edilebilir. Bu adımlar, yukarıda açıklanan STED kurulumuna özgüdür.
   2. Görüntüleme için lazer ve filtre setlerini seçin.
      1. Boya Listesinden boyamada kullanılan boyayı/boyaları veya kullanılan boyaya/boyalara en yakın spektral özelliklere sahip olanı seçerek turuncu boya için parametreleri kullanın. Bunları, çift tıklayarak veya "Boyaları buraya sürükleyin" yazan örnek listeye sürükleyerek etkinleştirin.
   3. Görüntülemek için bir bölge seçin.
      1. Genel bakışta, dikdörtgen ROI düğmesini seçip bölgeyi şekillendirmek için tıklayıp sürükleyerek ilgilenilen bir mitokondri etrafında bir ilgi alanı ( ROI ) oluşturun. ROI, fareyi bir köşenin üzerine getirdiğinizde görünen ROI köşeleri veya kavisli kenarlar kullanılarak yeniden boyutlandırılabilir ve döndürülebilir.
         NOT: Önerilen görüntüleme parametrelerinin bir özeti Tablo 1'de bulunabilir. Bu parametreler, bu STED kurulumu ve boya kombinasyonu⁶³ için daha önce bildirilenler kullanılarak ampirik olarak ayarlanmıştır.
   4. Geçitlemeyi ayarlayın.
      1. Genel menüsünün yanında, Geçit menüsünü seçin veya menüyü görünüme eklemek için tıklayıp basılı tutun. STED dedektör kapısının burada sunulduğu gibi 1-1.05 ila 7.8-7.85 ns'ye ayarlanması önerilir. Geçit süreleri değişebilir ve 1-1.05 ila 7-7.05 ns kadar kısa olabilir.
   5. Yoğunluğu örneğe göre uygun şekilde ayarlayın.
      NOT: Genel olarak, STED için kullanılan uyarma gücü, konfokal için kullanılan gücün 2-3 katıdır, bu nedenle konfokal için %5 uyarma lazer gücü gerektiren bir numune, STED alımı sırasında %10-15 uyarma lazer gücü kullanabilir.
      1. STED için uyarma lazerini %15-20'ye ve STED tükenme lazerini 10 çizgi birikimi ile %20-25'e ayarlayın. Piksel boyutu 20-25 nm olan 4 μs'lik bir piksel bekleme süresi kullanın. İğne deliği, daha yoğun paketlenmiş mitokondride optik kesitlemeyi iyileştirmek için kültürlenmiş hücreler için 1.0 AU'da ve birincil sıçan hipokampal hücreleri için 0.7 AU'da tutuldu.
         NOT: Yan yana karşılaştırma için konfokal ve STED görüntülerin her ikisi de elde edilebilir (Şekil 3A, B, Şekil 4A) veya yalnızca STED elde edilebilir.
2. Zaman serisi/z serisi için ek bilgiler
   1. Zaman serisini seçin.
      1. Zaman açılır menüsünü seçin. Timelapse için istenen yineleme sayısını (burada 5 kullanılır) ve zaman aralığını (burada 25 veya 30 s kullanılır) tanımlayın (Şekil 3C, D, Şekil 4B).
         NOT: Aralık, alım süresinden daha kısaysa, yinelemeler herhangi bir gecikme olmadan devam eder. Timelapse gerçekleştirirken, olası sapmayı önlemek için mükemmel bir odak ünitesi veya benzer bir odak takibi kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
   2. Ses aralığını ayarlayın.
      1. Volume seçeneğini etkinleştirerek ve aralığın iki ucunu ayarlayarak z-volume aralığını istediğiniz gibi ayarlayın. Bu protokolde 2D görüntüleme için kullanılan adım boyutları 150-200 nm idi. Ham STED'in evrişiminin giderilmesi için gerekli olan Nyquist örneklemesine göre önerilen adım boyutu, çevrimiçi araçlarla^{hesaplanabilir 90}.
         NOT: STED tükenme lazer gücü ve görüntülenen düzlem sayısı, boya fotoağartmasını ve hücreye ışık maruziyetini zararlı seviyelere çıkarabilir. Edinimden sonra fototoksisite ve fotohasar belirtileri olup olmadığını kontrol edin.

5. Mitokondriyal üst yapı için işleme ve analitik araçlar

NOT: Görüntü işleme (yani, evrişim devolüsyon) isteğe bağlıdır, ancak genellikle yayın için STED görüntüleri oluştururken ve analiz ederken kullanılır. Kontrastı iyileştirmek ve gürültüyü azaltmak için dekonvolüsyon, aşağıda açıklandığı gibi, bireysel kristaların optimal segmentasyonu için şiddetle tavsiye edilir (Şekil 2).

1. STED görüntü evrişim dekonvolüsyonu
   NOT: Bu protokolde evrişimi gidermek için kullanılan yazılım Malzeme Tablosunda verilmiştir.
   1. Görüntünün mikroskobik parametrelerini ayarlayın.
      NOT: Mikroskop meta verilerinin görüntü Mikroskobik Parametrelerine doğru girildiğinden emin olun. Bu, montaj ortamı kırılma indisini içerir; daldırma ortamı; piksel boyutu; uyarma, emisyon ve tükenme dalga boyları; ve diğer ilgili bilgiler. Bu parametrelere sahip şablonlar yeniden kullanım için kaydedilebilir.
   2. Yazılım algoritması ile ham STED görüntülerini deconvolute.
      1. Dekonvolüsyon yazılımındaki otomatik dekonvolüsyon algoritmalarına erişim, uygulamalı dekonvolüsyon görüntü işlemeye izin verir. Ekspres düğmesini seçin ve çeşitli derecelerde evrişim gücü için evrişim türünü Hızlı, Standart, Agresif veya Muhafazakar olarak ayarlayın. Agresif ayarlarla Ekspres Evrişim kullanan temsili görüntüler gösterilmektedir (Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).
      2. Evrişim çözme yazılımındaki görüntüleri ICS2 formatında kaydedin.
   3. El ile evrişim için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      1. Kısaca, el ile evrişim açma işlemi gerçekleştirirken, tutarlılık için evrişim sihirbazı şablonlarını kaydedin ve sihirbazı başlattıktan sonra bir şablon yükleme seçeneğine sahip olun. Alım kurulumu ve parametreleriyle oluşturulmuşsa, ölçülen nokta yayılma işlevi (PSF) bilgilerini kullanın.
      2. Evrişim yazılımının görüntüyü otomatik olarak stabilize etmesini sağlamadan önce gerekirse ham STED görüntüsünü kırpın. Evrişim giderme yazılım paketlerine yapılan eklentiler, termal sapma ve renk sapmaları gibi olası görüntüleme artefaktlarının belirli bir şekilde telafi edilmesini sağlar.
      3. Ardından, arka plan çıkarma işlemini manuel veya otomatik olarak gerçekleştirmek için logaritmik bir histogram oluşturun. Klasik en yüksek olabilirlik tahmini (CMLE) evrişim çözme algoritmasını seçin.
         NOT: Evrişim için ayarlanacak temel değerler sinyal-gürültü oranı eşiği, yineleme sayısı ve kalite eşiğidir. Bu değerler ayarlanabilir ve en uygun ayarları belirlemek için evrişimin önizlemesi yapılabilir.
2. Segmentasyon ve partikül analizi
   NOT: Bu protokol, açık kaynaklı bir yazılım olan FIJI'yi (Is Just ImageJ) kullanır (bkz. Malzeme Tablosu), segmentasyon ve analiz için. CellProfiler, Icy, Ilastik ve QuPath dahil olmak üzere diğer karşılaştırılabilir yazılımlar bu amaçlar için kullanılabilir.
   1. Görüntüleri segmentasyon için hazırlayın.
      1. Dosya → Aç'a giderek veya dosyaları tıklayıp ImageJ araç çubuğuna sürükleyerek evrişim yazılımından .obf ham STED görüntülerini veya .ics2 dosyalarını açın. Buradan, görüntülerin segmentasyona ayrılmasını kolaylaştıran herhangi bir işlem, segmentasyondan önce gerçekleştirilebilir.
      2. Değişikliklerin tutarlı olmasını sağlamak için, Eklentiler → Makrolar'ı kullanarak işlevleri kaydedin → Eklentiler → Yeni → Makrosu'ndan anahtar komutları kaydedin ve kopyalayıp kopyalayıp yeni bir makroya yapıştırın. Makroyu çalıştırmadan önce işlenecek görüntüyü seçtiğinizden emin olun.
         NOT: Boyut ve şeklin nicelleştirilmesi için yaygın olarak kabul edilen değişiklikler arasında kırpma, z yığını yansıtma ve yumuşatma devre dışı bırakılmış arka plan çıkarma yer alır. Değişiklikler, bir veri seti içindeki görüntüler arasında tutarlı bir şekilde yapılmalı ve raporlanmalıdır.
   2. Eğitilebilir Weka Segmentasyon Ayarlarını Yapın
      NOT: Yarı otomatik segmentasyon aracının kullanımı ve mitokondri için aşağı akış analizleri için adım adım talimatlar içeren ek ayrıntılar yayınlanmıştır⁹¹.
      1. Eklentiler → Segmentasyon ve Eğitilebilir Weka Segment→asyonu altında bulunan Eğitilebilir Weka Segmentasyonu (TWS)⁹² eklentisinde dekonvolved STED görüntülerini açın. Segmentasyon Ayarları'nda Gauss bulanıklığı, membran projeksiyonları ve Sobel filtresi özelliklerini seçin. Varsayılan membran kalınlığı 1'dir ve membran yama boyutu varsayılanı 19'dur.
      2. Sınıf 1 veya 2'yi "Cristae" ve diğerini "Arka Plan" olarak etiketleyin (Şekil 2). Modeller ayrıca Sınıflandırıcıyı kaydet düğmesiyle de kaydedilebilir. Bu ayarları diğer görüntülerde yeniden kullanmak için Yük sınıflandırıcısını seçin.
   3. TWS sınıf izlemeleri gerçekleştirin.
      1. Çizginin veya arka planın bir kısmını vurgulamak için çizgi aracını veya diğer şekilleri kullanın. En azından bazı arka plan seçimleri, cristae arasında boşluklar içermelidir. Her iki sınıfa da atamak için yapının üzerine bir çizgi çizin, ardından cristae veya arka plan için sağ taraftaki Ekle düğmesini seçin. Yapıyı bu etiketten kaldırmak için bir izlemeye çift tıklayın.
   4. TWS sınıflandırma eğitimi gerçekleştirin.
      1. Eklentiye sağlanan bilgilere dayalı olarak bir harita oluşturmak için sol taraftaki Sınıflandırıcıyı eğit düğmesini seçin. Segmentlere ayrılmış sınıfların kaplaması, Kaplamayı Değiştir düğmesiyle açılıp kapatılabilir ve kaplamanın opaklığı Ayarlar'da ayarlanabilir. Sınıflandırıcı ek etiketlerle yeniden eğitilebilir. Memnun kaldığınızda, Olasılığı Al düğmesini seçin.
   5. Parçacıkları ölçün.
      1. Cristae olasılık haritasını kullanarak, bir maske oluşturmak için görüntünün eşiğini alın ve ardından Parçacıkları Analiz Et → Analiz Et'e gidin. Genel olarak, varsayılan eşik türü kullanılabilir ve tüm kristaların hesaba katılmasını sağlamak için aralık ayarlanabilir. Partiküllerin analiz edilmesiyle sağlanan ölçümler, Analiz → Set Ölçümleri ile ayarlanabilir.
         NOT: Cristae'nin alanı, çevresi, daireselliği ve en boy oranı gibi boyut ve şekil parametrelerinin örnekleri, seçilen ölçümlere göre ölçülür ve görüntülenir (Şekil 2, Şekil 5A, Ek Tablo 1).
      2. İSTEĞE BAĞLI: Döngüden çıkarılmış görüntüyle aynı boyutlara sahip ham STED görüntüsünü seçin ve yöneticiden ROI'leri uygulayın, ardından yoğunluk değerlerini elde etmek için ROI yöneticisinde Ölç'ü seçin.
   6. Çizgi grafikleri elde edin.
      1. Çizgi grafikleri, dekonvolved STED görüntülerinden oluşturuldu. Çok noktalı bir çizgi çizin, gürültünün ortalamasını almak için çizgi kalınlığını birkaç piksel genişliğe ayarlayın ve çizgiyi mitokondriye sığacak şekilde eğrin (Şekil 2, Şekil 5B). Elde edilen çizgi grafiği, belirli bir aralıktaki cristae'nin periyodikliğini ve dağılımını bildirmek için tepeden tepeye mesafeleri ölçmek için kullanılır.
         NOT: İlgili olarak, cristae yoğunluğu, mitokondrinin dış kısmı ölçülerek belirlenen belirli bir alandaki bağımsız cristae sayısı olarak rapor edilebilir. Mitokondriyal alan, bir maske oluşturmak için dekonvolved veya ham STED görüntüsüne bir filtre uygulanarak belirlenebilir. Alanı ölçmeden önce maskenin mitokondrinin ana hatlarına tam olarak uyduğundan emin olun.

Bu protokol, canlı hücre STED görüntülemesine ve ardından mitokondriyal krista analizlerine odaklanarak kültürlenmiş ve birincil hücreler için hücre büyüme koşullarını açıklar. Farklılaşmamış SH-SY5Y (Şekil 3A) ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y (Şekil 3B) hücrelerinden mitokondri ImageJ ile yapılan projeksiyonlar, geleneksel konfokal ve STED ile z-yığınları olarak toplanabilir ve ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir. Timelapse görüntüleme de yapılabilir ve daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 3C,D). Primer sıçan hipokampal nöronları için biraz farklı görüntüleme parametreleri kullanılarak (Tablo 1), konfokal ve ham STED görüntüleri z-yığınları olarak elde edilebilir ve ham STED görüntüleri dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 4A). Primer nöronlardan mitokondrinin timelapse görüntülenmesi de mümkündür (Şekil 4B). Genel olarak, hızlandırılmış görüntüler mitokondriyal dinamik olayları gösterebilmelidir.

Segmentasyon için kullanılan örneklerden ham STED ve dekonvolved STED z-yığını projeksiyonları tutarlı göründüğünde, kantitatif ölçümler gerçekleştirilir. TWS eklentisi, bir olasılık maskesi yapmak için bölümlere ayırmak için dekonvolved STED görüntüsünü kullanır ve bu daha sonra boyut ve şekil parametreleri elde etmek için cristae'nin ikili bir maskesini oluşturmak için kullanılır (Şekil 5A). Bu maskedeki bölgeler ROI yöneticisine kaydedilir ve göreli yoğunluktaki farklılıkları ölçmek için istenirse ham STED görüntüsüne uygulanabilir. Dekonvolved STED projeksiyonları, belirli bir alandaki kristae periyodikliğini ve yoğunluğunu belirlemek için de kullanılabilir (Şekil 5B).

Şekil 1: Mitokondriyal morfoloji. Mitokondri, farklı alt bölmeleri (A) tanımlayan iki zarlı bir sisteme sahiptir. Cristae, tanımlanmış özelliklere (B) sahip iç zarın kıvrımlarıdır. Kısaltmalar: OMM, dış mitokondriyal membran; ICS, intrakristal uzay; IMS, zarlar arası boşluk; CM, cristae membranı; IBM, iç sınır zarı; IMM, iç mitokondriyal membran; CT, cristae ucu; CJ, cristae kavşağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İş akışının şeması. SH-SY5Y hücreleri veya birincil sıçan hipokampal nöronları, PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütülür. SH-SY5Y hücreleri, farklılaşmadan kalacak şekilde paralel olarak büyütülür veya altı gün boyunca RA farklılaşmasına maruz kalır. Birincil sıçan hipokampal nöronları, yedi gün boyunca hipokampal bölümlerden izole edildikten sonra PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütüldü. Görüntülenmeye hazır olduğunda, hücreler PKMO ile boyandı ve STED ile görüntülendi. Ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyona tabi tutulur ve dekonvolvasyonlu görüntüler, cristae yoğunluğu, alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı gibi boyut ve şekil ölçümleri elde etmek için FIJI'de işlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: SH-SY5Y hücrelerinde mitokondrinin görüntülenmesi. PKMO boyamalı farklılaşmamış (A) ve RA farklılaşmış (B) SH-SY5Y hücrelerinden mitokondrinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolvasyonlu STED görüntüsü z-yığını projeksiyonları (sağda) gösterilmektedir. 30 sn aralıklarla ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin 5 yinelemesine sahip bir zaman atlamalı (C) gösterilir (C) seçilen bölgeler (beyaz kutular) genişletilerek (D) bu bölgelerin enterpolasyon olmadan ölçeklendirilmiş görüntüleri kullanılarak. Ölçek çubukları: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Primer sıçan hipokampal nöronlarında mitokondrinin görüntülenmesi. Temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolved STED (sağda) görüntüsü primer sıçan hipokampal nöronlarından mitokondrinin z-yığını projeksiyonları gösterilmiştir (A). Bu nöronlarda 25 s aralıklarla ve 5 mitokondri yinelemesi ile bir timelapse gösterilmiştir (B). Ölçek çubukları: A, 250 nm; B, 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: ImageJ'de dekonvolved STED görüntülerinin işlenmesi. Cristae boyutunu ve şeklini ölçmek için Eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisinin temsili kullanımı gösterilmiştir (A). Soldan sağa, aşağıdaki görüntüler gösterilir: dekonvolved görüntüsü, TWS eklentisinden segmentasyona dayalı olasılık haritası, olasılık haritasını girdi olarak kullanarak FIJI'de eşiklemeden maske, ROI'lerin ana hatlarıyla belirtildiği maske ve ROI'ler orijinal dekonvolved STED görüntüsünün üzerine bindirilir. Bu nesnelere karşılık gelen alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı ölçümleri Ek Tablo 1'de bulunabilir. Cristae yoğunluğu için bir okuma olarak tepeden tepeye mesafeleri ölçmek için dekonvolved STED görüntüsünü kullanan bir çizgi grafiği gösterilir (B). Ölçek çubukları: 0,5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: STED edinme parametrelerinin özeti. Her hücre tipi, farklılaşmamış SH-SY5Y, RA ile farklılaşmış SH-SY5Y ve primer sıçan hipokampal nöronları için 2D STED görüntüleme için kullanılan ayarlar görüntülenir. Tüm zaman atlamaları için, ROI boyutuna göre değişen aralıklarla 5 yineleme alındı.

Ek Şekil 1: SH-SY5Y hücrelerinin amiloid-β (Aβ) ilavesi ile görüntülenmesi. PKMO boyası (üstte) ve Aβ-HiLyte647 (altta) ile RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve dekonvolvasyonlu STED (sağda) görüntüleri gösterilmektedir (A). Ham Aβ STED (macenta) (B) ile ham PKMO STED (yeşil) veya dekonvolved Aβ STED (macenta) (C) ile dekonvolved PKMO STED'in (yeşil) birleştirilmiş z-yığını projeksiyonları gösterilmektedir. Ölçek çubukları: 0,5 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Parçalı cristae'nin boyut ve şekil ölçümleri. Segmentli mitokondriden Şekil 5A'da özetlenen nesnelere karşılık gelen alan (μm2), çevre (μm), dairesellik ve en boy oranının boyut ve şekil ölçümleri gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Amiloid β numuneleri ile edinim parametrelerinin özeti. Farklılaşmamış ve RA farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde PKMO ve Aβ-HiLyte647'nin 2D STED görüntülemesi için kullanılan ayarlar görüntülenir. Aβ-HiLyte647'nin konfokal olması, çözülecek belirli bir yapı olmadığı için tek başına kullanılabilir; Aβ-HiLyte647'nin STED görüntüleri, daha küçük parçacık boyutları için burada gösterilmektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Amiloid β tedavi protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.