Yöntem makalesi

LC-TIMS-TOF MS/MS kullanılarak Fentanil Analog Tarama

DOI:

10.3791/65562

⸱

8 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fentanil analoglarının alıkonma sürelerine, hareketliliklerine ve kütle spektrometresi parçalanma modellerine dayalı olarak taranması için bir yöntem.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fentanil kullanımı ve son yıllarda fentanil analoglarının ortaya çıkması, genel olarak toplum için artan bir endişe haline gelmiştir. Fentanil ve analogları, Amerika Birleşik Devletleri'nde ölümcül ve ölümcül olmayan aşırı dozlara en çok katkıda bulunanlardır. En son fentanil ile ilişkili aşırı doz vakaları, yasadışı olarak üretilen fentanil ve buna bağlı aşırı etki ile bağlantılıdır. Bu çalışmada, fentanil analoglarının taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve tandem kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir taramada tek bir numuneden yüzlerce fentanil analogunun ayrılmasına ve atanmasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim kullanarak veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimin son gelişmesinden ve ardından çarpışma kaynaklı ayrışma kullanılarak sıralı parçalanmadan yararlanır. Fentanil analogları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve MS parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fentanil ve analogları, Amerika Birleşik Devletleri'nde ölümcül ve ölümcül olmayan aşırı dozlara en çok katkıda bulunanlardır 1,2. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), 2013'ten 2021'e kadar sentetik opioide bağlı aşırı doz ölümlerinin sayısının 258.000'in üzerinde olduğunu bildirdi. Yalnızca 2021'de, 68.000'den fazla aşırı doz ölümü sentetik opioidlere atfedilebilir ve bu da ülkedeki tüm aşırı doza bağlı ölümlerin toplam %82'sini oluşturur3. 2013'ten bu yana, değişen potansiyele sahip yüzlerce fentanil analoğu tanımlanmıştır4. Yasadışı olarak üretilen fentanil analoglarının ortaya çıkmasıyla birlikte, program II sentetik opioidin kendisi Amerika Birleşik Devletleri'nde bulunan en popüler sentetik opioid olmaya devam etmektedir3. Adli Bilimler Araştırma ve Eğitim Merkezi'ne (CFSRE) göre, 2022'de en çok bildirilen fentanil analoğu florofentanil idi ve fentanil ile ilgili olmayan ek sentetik opioidler şu anda uçucu ilaç pazarı arzına hızlı bir şekilde dahil ediliyor5.

İlaç pazarında dolaşan fentanil ve fentanil ile ilgili analogların ezici hacmi nedeniyle, DEA, uyuşturucu ele geçirme vakalarını kökenlerine geri bağlama umuduyla bu bileşikleri sentezlemek için kullanılan metodolojiyi izlemek için Ölüm Ejderhası Operasyonu adlı bir fentanil imza profil oluşturma programı uygulamıştır6. 2018 yılında uyuşturucu ele geçirme vakalarının %94'ünün Janssen yöntemi ile sentezlendiği, kalan %6'sının ise Siegfried yöntemi ile sentezlendiği tespit edilmiştir6. İki yöntem arasındaki temel fark, Janssen yönteminde bir safsızlık olarak tespit edilen fentanil analogu, benzil fentanilin varlığıdır, fentanilin bir metaboliti/öncüsü olan despropionil fentanilin (4-ANPP) varlığı, Siegfried yöntemi7 ile sentezlenirken tespit edilen bir safsızlıktır.

Sentetik opioidlerin hedefli taranması ve miktarının belirlenmesi için kütle spektrometresi (sırasıyla GC-MS ve LC-MS) ile birlikte gaz ve sıvı kromatografisinin kullanımı, toksikoloji laboratuvarlarında düzenli olarak uygulanmaktadır. GC-MS, biyolojik örneklerde kötüye kullanılan ilaçların tespiti için altın standart olarak kabul edilmiştir. Halka açık kütle spektral kütüphanelerine8 ve tak ve çalıştır sistemleri olarak pazarlanan enstrümantasyona9 erişim, GC-MS'nin hem kapsamlı tarama hem de hedeflenen miktar tayini için laboratuvarlarda ayrılmaz bir parça olarak kalmasının bazı nedenleridir 9,10. Bununla birlikte, literatürdeki mevcut GC-MS kantifikasyon yöntemleri, sınırlı bir analit11 kapsamına sahip olma eğilimindedir ve hızla güncelliğini yitirir ve mevcut vaka çalışmalarına uygulanamaz. Daha da önemlisi, tespit ve miktar tayini limitleri LC-MS yöntemleriyle (< 1 ng/mL)12 karşılaştırılamaz, bu nedenle yanlış negatif sonuç potansiyelini arttırır. Postmortem örneklere bakan GC-MS ve LC-MS arasında yapılan böyle bir karşılaştırma, bugüne kadarki en güçlü sentetik opioidlerden biri olan 134 pozitif tanımlanmış karfentanil vakasından, bu vakaların 104'ünün GC-MS13 kullanılarak karfentanil için negatif tarandığını belirtti. İlaç analiz laboratuvarlarında GC-MS, analiz edilen numunelerin yüksek konsantrasyonu nedeniyle sentetik opioidler için daha sık kullanılır ve değiştirilebilir. Yine de, GC-MS, bu bileşiklerin doğrulanması için Fourier dönüşümü-kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) gibi ek tekniklerle birlikte hala kullanılmaktadır14. GC-MS'nin adli toksikolojide biyolojik örneklerin analizine uygulanması, bu bileşiklerin sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE) veya katı faz ekstraksiyonu (SPE)15 kullanılarak ekstraksiyonunu içeren numune hazırlama yöntemlerini gerektirir. LLE, çeşitli çözücülerle gerçekleştirilebilir, ancak yüksek üretimli bir laboratuvarda LLE, uygun maliyetli veya zamanında olmayabilir. LLE, numune hacminin yanı sıra büyük miktarlarda çözücü tüketirken, alternatif SPE otomatikleştirilebilir ve minimum numune hacmigerektirir 16. Yakın tarihli bir GC-MS çalışması, üç ayrı GC termal programı17 kullanılarak 20 farklı izomerik fentanil analogunun ayrıldığını bildirmiştir. İzomerler arasında temel ayrım başarılı olsa da, bu yöntemin ilgili adli vaka çalışmalarına ve iş akışlarına uygulanabilirliği sınırlıdır.

LC-MS, özellikle uçucu olmayan ve ısıya duyarlı bileşikler söz konusu olduğunda GC-MS'nin sınırlamaları nedeniyle adli testlerde popülerlik kazanmıştır18,19. Üçlü dört kutuplu (QQQ) ve iyon tuzağı enstrümantasyonunu kullanan LC-MS taraması, düşük konsantrasyonlarda (<1 ng / mL) sentetik opioidleri tespit etmede başarılı olmuştur12,20,21,22,23,24. Tipik olarak, bu LC-MS yöntemleri, immünoassay ve / veya GC-MS sonuçlarını tamamlamak için ikincil doğrulama yöntemleri olarak kullanılır. 2017 yılında Shoff ve ark. Miami-Dade County adli tabip departmanı (MDME) toksikoloji laboratuvarında, ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (UHPLC)-iyon tuzağı-MSn 13 kullanarak opioid ile ilgili 44 bileşik için kapsamlı bir tarama yöntemi geliştirdi. Hedeflenen MRM yöntemlerine benzer şekilde, bu iyon tuzağı yöntemi, mümkün olduğunda MS3 spektral parçalanması için tutma süreleri, öncü hedef iyonları ve ayrıca birincil yavru iyonları içeren planlanmış bir öncü liste (SPL) kullandı. Bu tarama yöntemini, üçlü dört kutuplu ve doğrusal dört kutuplu iyon tuzakları üzerinde geliştirilen yöntemlerden ayıran şey, spektral verilerde sağlanan ek detaydır. Bu tarama yönteminin sağlayamadığı şey, iyon tuzağı enstrümantasyonu üzerinde nadiren geliştirilen kantitatif analizin yanı sıra bilinmeyenlerin tanımlanmasıdır13. Sentetik opioidler için LC-QQQ yöntemleri, önceden tanımlanmış bir hedef listeyi aynı anda tarayabilir ve nicelleştirebilir. Bileşiklerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerinin kullanılması, güvenilir bir veri toplama tekniğidir ve sentetik opioidlerin tespiti için literatürde kullanılan en yaygın tekniktir12,20. Bir dizi sentetik opioidin miktar tayini için bildirilen doğrusal aralıklar 0.01-100 ng/mL arasında değişir ve karfentanil gibi daha güçlü sentetik opioidler1 1,24,25,26,27 altı ng/mL aralığında tespit edilir.

İzomerik sentetik opioidlerin ayrılması LC-MS yöntemlerinde ele alınmıştır. Böyle bir yöntem, bir bifenil sütunu28 kullanarak 16 dakikalık bir çalışma süresi içinde 174 izomerik fentanil analogunu ayırdı. Ek olarak, kolon verimliliği, mobil faz pH'ı ve basınç değişiklikleri gibi LC'ye bağlı parametrelerdeki dalgalanmalar, tutarlı izleme ve daha büyük toplama pencereleri (>0,4 dk) ile hedeflenen tahlillerde hesaba katılması gereken alıkonma süresi kaymaları yaratır ve bu da bu bir kez çözülen izomerlerin potansiyel örtüşmesine neden olabilir. 2 boyutlu sıvı kromatografisi (2D-LC)29 kullanımı da dahil olmak üzere izomerlerin ayrılması için ek kromatografik teknikler araştırılmıştır; Ve bu teknik, bileşiklerin ortogonal olarak ayrılmasını sağlama yeteneğine sahip olsa da, dezavantajlar, alternatif ayırmalara kıyasla aşırı çalışma süreleri, maliyet, yöntem geliştirmede zorluk ve kullanışlılık gibi avantajlardan daha ağır basar30.

Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS), sentetik opioidlerin tanımlanması için giderek daha güvenilir hale gelmektedir. Birkaç enstrümantasyon şirketi, karmaşık biyolojik matrislerdeçok çeşitli sentetik opioidleri tanımlamak amacıyla geliştirilen hedefli yöntemleri pazarlamıştır 19,28,31. Bu yöntemler, daha önce tartışılan yöntemlerden farklı olarak, geriye dönük analiz için analitik verileri depolayabilir. Böylece, daha önce belirsiz sonuçlarla analiz edilen numuneler, yeni tanımlanan bileşiklerin keşfi için daha sonra tekrar ziyaret edilebilir. HRMS'yi QQQ'dan ayıran şey, doğru kitle tanımlamasıdır. Her iki MS tekniği de düşük konsantrasyonlarda doğru bir şekilde nicelik tayini yapabilirken, HRMS'nin ilk tarama ve bilinmeyen bileşiklerin keşfi için daha etkili olduğu kanıtlanmıştır 32,33,34. HRMS, özellikle uçuş süresi (TOF) MS analizörleri ile NPS keşfinin ön saflarında yer almış ve adli test laboratuvarlarının, farkındalığı ve eğitimi artırırken bu bileşiklerin bazılarının yayılmasını ölçeklendirmek için hem kolluk kuvvetlerine hem de bilim camiasına yeni bileşikler hakkında zamana duyarlı veriler sunmasına olanak sağlamıştır33. Kötüye kullanılan ilaçların tespiti için TOF'un kullanımı, 10 dakikalık bir kromatografik program içinde ayrılmış 600'den fazla bileşik içeren yöntemlerle son derece kapsamlı hale gelmiştir. Önceki çalışmalarda, izomerik opioidlerin tespiti ve ayrılması için TOF'a bağlı tuzaklanmış iyon hareketlilik spektroskopisinin (TIMS) avantajları bildirilmiştir35.

Sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometrisi arasındaki ortogonallikten yararlanan sunulan yöntem, alıkonma süresi, izotopik model, hareketlilik ve parçalanma modeline dayalı olarak fentanil analoglarının geniş bir karakterizasyonunu sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune hazırlama

  1. Fentanil analog tarama kitini teslim alındıktan sonra -20 °C'de saklayın. 500 μL saf LC/MS sınıfı metanol ilavesiyle her numuneyi 400 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin.
  2. 1 saat boyunca 400 rpm'de bir plaka karıştırıcı veya girdap kullanarak veya 15 dakika orta hızda girdap kullanarak karıştırın. Yeniden süspansiyondan sonra şişeleri -20 °C'de saklayın.
  3. Her standardı saf LC / MS dereceli metanol kullanarak 1 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
  4. Standartları, her grup herhangi bir izomerik standart içermeyecek şekilde gruplara ayırın. 14 fentanil standardı grubunun dökümü için Ek Tablo 1'e bakınız.

2. HPLC mobil fazların hazırlanması

  1. % 0.05 formik asit (% 85) ile H2O'da 5 mM / L amonyum format (NH4HCO2) kullanarak mobil faz A'yı (MPA) hazırlayın.
    1. 0.078 gNH4HCO2'yi tartın, 250 mL'lik hacimsel bir şişeye dökün ve yaklaşık 2/3rd'ye kadar suyla doldurun. İyice karıştırmak için döndürün.
    2. Tamamen çözündükten sonra 0.125 mL formik asit (%85) ekleyin. Doldurma hattına (250 mL) kadar su doldurun ve karıştırın.
  2. 1: 1 metanol asetonitril karışımında %0,05 formik asit kullanarak mobil faz B'yi (MPB) hazırlayın.
    1. 125 mL asetonitril'i hacimsel bir şişeye dökün ve doldurma hattına ulaşana kadar metanol ekleyin.
    2. İyice karıştırmak için döndürün. Şişeye 0.125 mL %0.05 formik asit ekleyin ve homojenize etmek için karıştırın.

3. HPLC yöntemi geliştirme

  1. LC yazılımını ana ekrana açın. Pencerenin ortasında bulunan örnek tabloda yeni bir protokol oluşturun.
    1. Flakon sütununa örnek konumu ile açıklama ekleyin. YYYYMMDD_NAME (temsili tanımlayıcı) biçimini kullanarak örnek kimlik sütununa açıklama ekleyin. Hacim sütununa istenen enjeksiyon hacmi (15 μL) ile açıklama ekleyin.
  2. Veri yolu sütununa, verilerin kaydedileceği konumu bildirin.
  3. HPLC yöntemi girişi
    1. Ekranın ortasında bulunan örnek tablodaki çubuktan Yeni'yi seçin. Ayırma yöntemi altında, Açılır Ok'u seçin ve açılır pencerede Yeni Yöntem'e tıklayın.
    2. Ayırma yöntemi etiketli yeni bir pencere açılacaktır, burada edinme süresini veya cihaz kontrol çerçevesi (ICF) sistem yöntemini düzenleyin.
    3. Şekil 1'de görüldüğü gibi, ikili gradyanı düzenlemek üzere açılır pencereyi açmak için ICF sistemi için Edit Method (Yöntemi Düzenle) düğmesine çift tıklayın.
    4. İkili gradyan sekmesi altında, degradenin görsel bir temsili solda ve degradenin dökümü sağdadır, zaman damgalarını, akış hızını ve MPA ve MPB konsantrasyonlarını ayarlayın.
    5. Durma süresinin 18 dakika, akış hızının 0.400 mL/dk ve basınç limitinin min ve maks 0 psi ve 6000 psi'de ayarlandığından emin olun.
    6. Zaman damgası konsantrasyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın:
      0.00 dakikada B konsantrasyonunu 20.0'a ayarlayın.
      1.50 dakikada, B konsantrasyonunu 25.0'a ayarlayın.
      3.00 dakikada B konsantrasyonunu 27.0'a ayarlayın.
      6.00 dakikada, B konsantrasyonunu 27.0'a ayarlayın.
      6.50 dakikada, B konsantrasyonunu 30.0'a ayarlayın.
      7.00 dakikada, B konsantrasyonunu 95.0'a ayarlayın.
      Saat 16.00'da B konsantrasyonunu 95.0'a ayarlayın.
      16.50 dakikada, B konsantrasyonunu 20.0'a ayarlayın.

4. HPLC'nin başlatılması

  1. HPLC sütunu bölümünde, LC sütununu (monolitik C18 HPLC sütunu 100 mm x 4.6 mm) ve sütun korumalarını (koruma sütunu 5 mm x 4.6 mm) yerleştirin. Minimum ve maksimum kolon basıncına dikkat edin.
  2. Herhangi bir sızıntı olup olmadığını test etmek ve bir taban çizgisi oluşturmak için boş bir numune (aynı tampon çözeltisi) çalıştırın. Sızıntı olup olmadığına bakın. Sızıntılar, kolon basıncı dalgalanmaları ile gözlemlenebilir. Sızıntı varsa, nereden gelebileceklerini belirleyin ve bağlantıları sıkın.
  3. Sütunu ön koşullandırmak için istenen LC programını kullanarak bir örnek boşluğu (aynı tampon çözeltisi) çalıştırın.

5. timsTOF MS/MS metodu geliştirme

  1. timsControl uygulamasını açın. Pencerenin sol tarafında MS ve TIMS Ayarları bulunur.
    1. MS ayarları altında, taramanın başlangıcını ve bitişini sırasıyla 50 m/z ve 1800 m/z olarak ayarlayın. İyon polaritesi için pozitif modu seçin ve tarama modu için paralel birikim-seri parçalanmayı seçin.
    2. TIMS Ayarları altında Mod'u özel, 1/K0 başlangıcını 0,40 Vs/cm2, 1/K0 ucunu 1,85 Vs/cm2, rampa süresini 150,0 ms ve MS ortalaması 1 olarak ayarlayın.
  2. Alt sekme seçiminde, Kaynak altında, iki ayar kutusunda aşağıdaki değişiklikleri gerçekleştirin.
    1. Kaynakta, uç plaka ofsetini 500 V'a, kılcal damarı 4500 V'a, nebulizatörü 3,0 bar'a, kuru gazı 10,0 L/dk'ya ve kuru sıcaklığı 200 °C'ye ayarlayın.
    2. Şırınga pompası ayarlarında, şırınganın Hamilton 1 mL olduğundan, etkin olduğundan ve akış hızının 80.0 μL/h olarak ayarlandığından emin olun.
  3. Tune (Ayarla) sekmesinde General, Processing (İşleme) ve TIMS (TIMS) için ayar sekmelerinde aşağıdaki değişiklikleri gerçekleştirin.
    1. Genel ayarlar sekmesi altında, şu bölümleri ayarlayın: aktarım, çarpışma hücresi, dört kutuplu, odak öncesi TOF ve algılama.
      1. Aktarım ayarları altında, sapma 1 deltasını 70.0 V'a, huni 1 RF'yi 341.0 Vpp'ye, CID enerjisini 0.0 eV'ye, huni 2 RF'yi 300.0 Vpp'ye, çok kutuplu RF'yi 300.0 Vpp'ye ayarlayın.
      2. Çarpışma hücresi ayarları altında, çarpışma enerjisinin 6.0 eV'ye ve çarpışma RF'sinin 1200.0 Vpp'ye ayarlandığından emin olun.
      3. Dört kutuplu ayarlar altında, iyon enerjisinin 6.0 eV'ye ve düşük kütlenin 250.00 m/z'ye ayarlandığından emin olun.
      4. Odak öncesi TOF ayarları altında, aktarım süresini 75,0 μs'ye ve ön darbe depolamayı 5,0 μs'ye ayarlayın.
    2. İşleme ayarları sekmesi altında, aşağıdaki bölümleri ayarlayın: kütle spektrumları tepe algılama ve hareketlilik tepe algılama.
      1. Kütle spektrumları tepe ayarlarında, yoğunlukların toplamının (alan) seçimini kaldırın ve mutlak eşiği 667 olarak ayarlayın.
    3. TIMS sekmesi altında, şu bölümleri ayarlayın: ofsetler, iyon değişim kontrolü ve gelişmiş parametreler.
      1. Ofset ayarı altında Δt1 ila -20,0 V, Δt2 ila -100,0 V, Δt3 ila 40,0 V, Δt4 ila 80,0 V, Δt5 ila 0,0 V, Δt6 ila 120,0 ve çarpışma hücresi girişi 250,0 V'a ayarlanmıştır.
      2. İyon şarjı kontrol ayarları altında, etkinleştirmek için kutuya tıklayın ve hedef yoğunluğu 5.00 M olarak ayarlayın.
      3. Gelişmiş parametreler altında, mobilite aralığına kilit birikimini etkinleştirin.
  4. MS/MS sekmesinde Tarama modunu paralel birikim-seri parçalanma olarak ayarlayın ve şu bölümleri ayarlayın: öncü iyonlar, zamanlama, aktif dışlama, çarpışma enerjisi ayarları, izolasyon genişliği ayarları ve TIMS adımlaması.
    1. Öncü iyonlar altında, paralel birikim-seri parçalanma rampalarının sayısını 8'e, minimum şarjı 1'e ve maksimum şarjı 5'e ayarlayın.
    2. Zamanlama ayarları altında, öncü tekrarları etkinleştirin. Etkin hariç tutma altında, etkinleştirmek için kutuyu işaretleyin ve sürümü 0,40 dakika sonrasına ayarlayın.
    3. Çarpışma enerjisi ayarlarını ve izolasyon genişliği ayarlarını değiştirmeyin. Etkinleştirmek için TIMS Adım Kutusu'na tıklayın.

6. Hareketlilik ve kütle kalibrasyonu

  1. Hem m/z hem de mobilite alanları için kalibrasyon gerçekleştirin. m/z kalibrasyon ayarları altında, açılır menüde görünen referans listesi kutusunda önceden yüklenmiş ayar karışımı profillerinden birini seçin.
  2. Kalibre etmek için, TOF şırıngasını bir ayar karışımı çözeltisi ile yükleyin. Pencerenin sağ tarafında, en yüksek puanı elde etmek için ayarlanacak çeşitli kalibrasyon türleri için kalibrasyon modu başlıklı ayarları kullanın.
  3. Skorun mümkün olduğunca %100'e yakın olduğundan emin olun. En iyi puanı elde etmek için doğrusal, kuadradik ve gelişmiş ikinci dereceden arasında geçiş yapın.
  4. m/z'yi kalibre etmek için kullanılan 6.1-6.3 adımlarını izleyerek hareketlilik için kalibre edin.
  5. Kalibre edildikten sonra, üst çubuktaki Yöntem sekmesini seçerek MS yöntemini kaydedin. Açılır menüde, yeni bir MS yöntem dosyası oluşturmak için Farklı Kaydet'i seçin.

7. Veriden bağımsız edinim (dia) paralel birikim-seri parçalanma yönteminin oluşturulması

  1. Veriye bağlı edinimde (dda) paralel birikim-seri parçalanmada bir veri seti toplandıktan sonra, deneyleri dia'da çalıştırın. İyon hareketlilik yazılım uygulamasını açın ve adım 6.5'te kaydedilen dda yöntemini yükleyin.
  2. MS ayarı için tüm ayarları aynı şekilde bırakın, bunu paralel birikim-seri parçalanmadan diya-paralel birikim-seri parçalanmaya değiştirin.
  3. Panelin alt kısmında, MSMS sekmesini seçin ve ardından Şekil 2'de gösterilen dia penceresi açılır penceresini açmak için Pencere Düzenleyicisi'ne tıklayın.
  4. Açılır pencerenin üst kısmında bulunan analizi aç düğmesini kullanarak önceden kaydedilmiş dda veri kümesini (.m dosyası) yükleyin.
  5. Sol altta, grafik boyunca çapraz olarak uzanan bir pencere çokgenine sahip pencereleri gösteren bir ısı haritası görünür. Çokgeni ısı haritasındaki verilere sığacak şekilde yeniden boyutlandırmak için tıklayın ve sürükleyin (köşeler, yanal çizgilere çift tıklanarak seçilebilir, sürüklenebilen ve yeniden boyutlandırılabilen bir nokta görünecektir).
  6. Pencerelerin sağında pencere ayarları bulunur. Kütle genişliğini ayarlayın (50 git'tir) ve her ikisi de Da'da yatay örtüşmeyi ayarlayın.
  7. Kütle genişliği ve dikey örtüşme başına hareketlilik pencerelerinin sayısını ayarlayın.
  8. Yeni ayarlarla görüntülenen pencereleri görmek için açılır pencerenin sağ alt kısmındaki Pencereleri Hesapla'ya tıklayın. Uygun olduğunda, dia-PASEF Windows'u Yönteme Uygula'ya tıklayın. Bu, açılır pencereyi kapatacak ve ana ekrana geri getirecektir.

8. HPLC iyon hareketliliği TOF veri işleme

  1. Veri analizi yazılımını açın. Sol üst köşede, Dosya sekmesine tıklayın ve açılır menüden Aç'ı seçin. Yeni dosyalar penceresinde, tercih ettiğiniz dosyaları seçin ve Aç'a tıklayın.
  2. Kalibrasyonu kontrol edin. Analiz kutusunun altındaki dosya adına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin. Dosya name_analysis özellikleri etiketli bir pencere görünecektir. Kalibrasyon Durumu'nu seçin.
  3. Açılır kutudan, Kütle Spektrometresi için Cihaz Kalibrasyonu'nu seçin. Hatanın 1 μg/mL'den büyük olmadığını onaylayın. İlk Hareketlilik Kalibrasyonu'nu seçin ve hatanın 1 μg/mL'den büyük olmadığını onaylayın.
  4. Veri analizi yazılımında aşağıda açıklandığı gibi bir kromatogram hazırlayın.
    1. Dosya adının altındaki Kromatogram'a sağ tıklayın, Kromatogramı Düzenle'yi seçin. Tür bölümünde, açılır kutuya tıklayın ve Çıkarılan İyon Kromatogramı'nı seçin.
    2. Filtre altında, Tüm MS'yi seçin ve tarama modu ile Tümü'nü seçin. Bu, ilgilenilen molekülün yalnızca parçalarından ziyade zirvelerini görmek içindir.
    3. Bunun altında, molekül seçimi için iki filtre seçeneğini arayın: kütleler veya mavi ile vurgulanan formül.
    4. Bir iyonu çıkarmak için kütle kullanıyorsanız, ilgilenilen molekülün teorik m/z'sini ekleyin. Bu durumda, (temsili sonuç için kütle) m/z'yi seçin.
    5. Bir iyonu çıkarmak için formül kullanılıyorsa, molekül için formülü ve kromatogram için ilgilenilen iyon formlarını ekleyin. Bu durumda, protonlanmış iyonu seçin, [M+H]+.
    6. Polariteyi pozitif moda ayarlayın.
  5. Kütle spektrumu
    1. Bileşiğin tepe noktasının taban çizgisine sağ tıklayın ve tepe noktasının diğer kenarına sürükleyin. Bu, bu tutma süresi içinde bir yığın parça spektrumu oluşturacaktır.
  6. Mobilogram Oluşturma
    1. Mobilogram başlıklı sol sekmeye sağ tıklayın ve Mobilogramı Düzenle'yi seçin. Mobilogram izlerini düzenle başlıklı bir pencere açılacaktır. Kromatogramı düzenlemek için 8.4.2-8.4.7 adımlarını izleyin.
    2. Bekletme süresi girişinde, ilgilenilen zirvenin bekletme süresi aralığını ekleyin.
    3. Parametreler seçildikten sonra, mobilogram izlemelerini düzenle penceresinin sağ üst kısmındaki Ekle'ye ve ardından Tamam'a tıklayın.
    4. Kısa bir süre sonra, yazılım istenen seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır. Karışımdaki tüm iyonlar için 8.6.1-8.6.3 adımlarını tekrarlayın.
    5. Bileşik spektrumların oluşturulması
      1. Spektrum görünümü penceresinin alt kısmında, MS Profili ve Parça MS'yi seçin. Bu, tam tarama ve PASEF'ten iyonların dahil edilmesine izin verecektir.
      2. Spektrum görünümünde, sağ tıklayın ve Bileşik Spektrumları Kopyala'yı seçin. Sağda görünen spektrum verileriyle, çözünürlük çözme gücü, yoğunluk ve sinyal-gürültü oranı (S/N) gibi bileşik hakkında daha fazla bilgi bulun.
    6. Bilgi işlem
      1. Verileri işlemek için, ilgilenilen molekül hakkında önemli bilgiler elde etmek için kromatogramı ve hareketlilik tepe noktalarını manuel olarak entegre edin.
      2. Bul'a sağ tıklayın ve Yalnızca kromatogramı veya mobilogramı entegre et'i seçin. İstediğiniz zirveyi vurgulamak için sol tıklayın ve sürükleyin. Saklama süresi, alan, S/N ve hareketliliği içeren bilgiler görüntülenecektir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

250 analog standartta fentanil analog tarama kiti, m/z girişimlerini önlemek için 12 grup 17 analog ve 2 grup 16 analog olmak üzere 14 gruba ayrıldı. Her analog ayrıca m/z, tutma süresi (RT), hareketlilik (K) ve MS/MS parçalanma modeli ile karakterize edilir.

İzomerik ayrılma örnekleri, C22H28N2O2 ve C21H28N2OS kimyasal formülü için sırasıyla Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilmiştir.

Fentanil analog tarama kiti, C22H28N2O2 kimyasal formülüne sahip dört izomer içerir (bkz. Şekil 3). Şekil 4'ün incelenmesi, [M+H]+ ekstrakte edilmiş iyon kromatogramını, mobilogramları, izotopik modeli ve MS/MS parçalanma modelini göstermektedir. Metoksiasetil fentanil ve fentanil karbamat, LC ve hareketlilik alanlarında para-metoksi asetil fentanil ve B-hidroksil fentanilden iyi ayrılır. Bununla birlikte, para-metoksi asetil fentanil ve B-hidroksil fentanil arasında net bir ayrım, parçalanma modelleri ile elde edilir.

Fentanil analog tarama kiti, C21H28N2OS kimyasal formülüne sahip üç izomer içerir. Şekil 4'ün incelenmesi, [M+H]+ ekstrakte edilmiş iyon kromatogramını, mobilogramları, izotopik modeli ve MS/MS parçalanma modelini göstermektedir. A-metil tiyofentanil ve (±)-trans-3-metil tiyofentanil, LC alanında ayrılır, ancak hareketlilik alanında ayrılmaz. Ayrıca, (±) -trans-3-metil tiofentanil ve (±) -cis-3-metil tiofentanil, LC alanında değil, hareketlilik alanında ayrılır. Bu, LC ve hareketlilik ayrımının tamamlayıcılığını gösterir ve alanların ortogonalliği yoluyla izomerik türlerin tanımlanmasını geliştirir. Şekil 4D , LC ve mobilite tarafından sağlanan bu sonucu özetlemektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Yazılımdaki gradyan rampası. ICF sistem yöntemi diyalog gradyanları, B konsantrasyonunun yüzdesine bağlı olarak ayırma sırasında uygulanan zaman noktaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: dia-PASEF pencere ayarları. dia-PASEF MS yöntemleri altında MS/MS ayarları benzersizdir. Soldaki grafik, dda-PASEF yönteminde kaydedilen verilerden ayarlanan pencere poligonlarını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İzomerik opioidler için tipik ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı, ekstrakte edilmiş mobilogram ve amplifiye edilmiş MS projeksiyonu. (A) Metoksiasetil fentanil, para-metoksi asetil fentanil, β-hidroksi fentanil, fentanil karbamatın yapıları ve ilgili (B) tipik tutma süresi, (C) tipik hareketlilik, (D) izomerik sinyal, (E) ana fragmanlar ve (F) parçalanmanın temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: İzomerik opioidler için tipik ekstrakte edilmiş iyon kromatogramları ve ekstrakte edilmiş mobilogramlar. (A) α-metil tiyofentanil, (±) -trans-3-metil tiyofentanil ve (±) -cis-3-metil tiofentanilin yapıları. İlgili izomerler için (B) tipik alıkonma süresi, (C) tipik hareketlilik, (D) alıkonma süresi ile hareketlilik arasındaki ortogonallik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Karışım grupları. Bu tablo, bu prosedür için oluşturulan 14 karışımın her birinde hangi opioidlerin bulunduğunu özetlemektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek izomerik içerik içeren biyolojik numunelerin analitik olarak ayrılması analitik olarak zor olabilir. Bu yazıda, açıklanan yöntem, 250 opioid standart kitinden toplam 185 analog için 29 izomer setini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Test grubu hazırlığı sırasında, deneysel olarak ayırt edilemeyen m/z ile iki analog olmadığından emin olmak önemlidir. Burada açıklanan veriler, eğer bu yöntem bir saha deneyinde kullanılacaksa, insan tabanlı bir matristen olmayan standartları kullanır; Yöntemin uygulanabilirliğini sağlamak için ilgi matrisini kullanan ek denemeler gereklidir. Matris, analitlerin matrissiz bir deneyde olduğundan farklı şekilde iyonlaşmasına neden olabilir, bu da hangi yaygın iyon formlarının gözlemleneceğini belirlemeyi zorunlu kılar. Analizde, tanımlama, en bol bulunan formların izotopik modellerine dayanır (örneğin, [M + H]+1 ve [M + Na]+1).

LC programının seçimi, izomerlerin mobilite alanında ayrılmadığı durumlarda kritik öneme sahiptir. Gradyanın eğiminin azaltılması, kromatografik tepe noktaları arasındaki farkı artırarak yöntemin özgüllüğünü artırabilir.

Veri analizi sırasında, alıkonma süresi ve hareketliliği belirlenirken ilgisiz sinyallerin göz ardı edilmesi önemlidir. HRMS'nin avantajları, ek mobilite filtrelemesi ile dar m/z pencerelere (~50.000 tipik kütle çözünürlüğü) izin verir ve böylece kimyasal gürültüyü azaltır.

Burada açıklanan yöntem, bilinmeyen bir numuneden fentanil analoglarının taranması için bir referans kütüphanesi sağlar. Rapor edilen RT, K, izotopik ve MS parçalanma modeli, veri işleme ve bilinmeyen atama sırasında niteleyici olarak kullanılır. Geleneksel MRM LC-QQQ analizi ile karşılaştırıldığında, benzer LOD'yeulaşılabilir 13,19,27 olsa da, benzersiz avantaj, FID kiti kullanılarak oluşturulan veri tabanına dahil edilmeyen alternatif opioidleri taramaktır. Her yeni opioid, nihai doğrulaması için sentetik bir standart kullanılarak analiz gerektirecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matthew Willetts ve Melvin A. Park, timsTOF Pro2 ticari cihazının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr Cesar Ramirez'in ilk desteğini kabul etmek ister.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fluka17843-50Giçin amonyum formatı
  Snap-Cap Mikrosantrifüj Güvenli Kilit TüpleriFisher05-402-25
ESI-L Düşük Konsantrasyon Ayar karışımıAgilentG1969-85000
Fentanil Analog Tarama (FAS) Kiti ve nbsp;Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380,250 snthetic opioid, 210 fentanil analogundan oluşan 9003381 kit, tek bir kite bölünmüş ve ortaya çıkan panel versiyonları 1-4
Formik asit Optima LC/MSFisherA117-50
Oniks koruma sütunu (5 x 4,6 mm) PhenomenexCHO-7649C18 sütunları için koruma sütunu
Oniks monolitik C18 HPLC sütunu (100 x 4,6 mm)PhenomenexCHO-7643ters faz C18 LC sütunu
Optima sınıfı asetonitril ve nbsp;FisherA996-4
Optima sınıfı metanolFisherA454-4
Optima sınıfı suFisherW7-4
PipetFisher05-719-5101-10 ve mikro kit; L, 10-100 ve mikro; L ve 100-1000 &mikro; L pipet
Pipet uçları 10 ve mikro; LFisher94060100
Pipet uçları 1000 ve mikro; LFisher94056710
Pipet uçları 200 & mikro; LFisher94060310
Plakalı karıştırıcıIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE ultra hızlı sıvı kromatografıShimadzu, JaponyaDGU-20A5 ile donatılmış, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF PASEF ile TOF cihazı 
HPLC Eppendorf

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gladden, R. M., Martinez, P., Seth, P. Fentanyl Law Enforcement Submissions and Increases in Synthetic Opioid-Involved Overdose Deaths - 27 States, 2013-2014. Morbidity and Mortality Weekly Report. 65 (33), 837-843 (2016).
  2. Rudd, R. A., Seth, P., David, F., Scholl, L. Increases in Drug and Opioid-Involved Overdose Deaths - United States, 2010-2015. Morbidity and Mortality Weekly Report. 65, 1445-1452 (2016).
  3. Department of Justice Drug Enforcement Administration. Drugs of Abuse: A DEA Resource Guide. Department of Justice Drug Enforcement Administration. , (2022).
  4. Vardanyan, R. S., Hruby, V. J. Fentanyl-related compounds and derivatives: current status and future prospects for pharmaceutical applications. Future medicinal chemistry. 6 (4), 385-412 (2014).
  5. Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE). Q4 2022 NPS Opioids Trend Report. Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE). , (2022).
  6. Drug Enforcement Administration. Fentanyl SIgnature Profiling Program Report. Drug Enforcement Administration. , (2019).
  7. Drug Enforcement Administration. Control of a Chemical Precursor Used in the Illicit Manufacture of Fentanyl as a List I Chemical. Drug Enforcement Administration. , (2007).
  8. Valdez, C. A. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Synthetic Opioids Belonging to the Fentanyl Class: A Review. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 52 (8), 1938-1968 (2022).
  9. Churley, M., Cuadra-Rodriguez, L. Application Note: Screen More Drugs with the Agilent GC/MS Toxicology Analyzer with a High Efficiency Source. Agilent Technologies Incorporation. , (2017).
  10. Gerace, E., Salomone, A., Vincenti, M. Analytical Approaches in Fatal Intoxication Cases Involving New Synthetic Opioids. Curr Pharm Biotechnol. 19 (2), 113-123 (2018).
  11. McIntyre, I. M., Trochta, A., Gary, R. D., Malamatos, M., Lucas, J. R. An Acute Acetyl Fentanyl Fatality: A Case Report With Postmortem Concentrations. Journal of Analytical Toxicology. 39 (6), 490-494 (2015).
  12. Marchei, E., et al. New synthetic opioids in biological and non-biological matrices: A review of current analytical methods. Trends in Analytical Chemistry. 102, 1-15 (2018).
  13. Shoff, E. N., Zaney, M. E., Kahl, J. H., Hime, G. W., Boland, D. M. Qualitative Identification of Fentanyl Analogs and Other Opioids in Postmortem Cases by UHPLC-Ion Trap-MSn. Journal of Analytical Toxicology. 41 (6), 484-492 (2017).
  14. Drug Enforcement Administration. Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs (SWGDRUG) Recommendations. Drug Enforcement Administration. , (2022).
  15. Peters, F. T., et al. A systematic comparison of four different workup procedures for systematic toxicological analysis of urine samples using gas chromatography-mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (2), 735-745 (2009).
  16. Remane, D., Meyer, M. R., Peters, F. T., Wissenbach, D. K., Maurer, H. H. Fast and simple procedure for liquid-liquid extraction of 136 analytes from different drug classes for development of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric quantification method in human blood plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (6), 2303-2314 (2010).
  17. Cayman Chemical. Supplemental Material: Differentiation of Isobaric and Isomeric Fentanyl Analogs by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). Cayman Chemical. , (2018).
  18. Armenian, P., Vo, K. T., Barr-Walker, J., Lynch, K. L. Fentanyl, fentanyl analogs and novel synthetic opioids: A comprehensive review. Neuropharmacology. 134, 121-132 (2018).
  19. Zhang, Y., et al. Development and application of a High-Resolution mass spectrometry method for the detection of fentanyl analogs in urine and serum. Journal of Mass Spectrometry and Advances in the Clinical Lab. 26, 1-6 (2022).
  20. Concheiro, M., Chesser, R., Pardi, J., Cooper, G. Postmortem Toxicology of New Synthetic Opioids. Frontiers in Pharmacology. 9, 1210(2018).
  21. Mohr, A. L., et al. Analysis of Novel Synthetic Opioids U-47700, U-50488 and Furanyl Fentanyl by LC-MS/MS in Postmortem Casework. Journal of Analytical Toxicology. 40 (9), 709-717 (2016).
  22. Moody, M. T., Diaz, S., Shah, P., Papsun, D., Logan, B. K. Analysis of fentanyl analogs and novel synthetic opioids in blood, serum/plasma, and urine in forensic casework. Drug Testing and Analysis. 10 (9), 1358-1367 (2018).
  23. Seither, J., Reidy, L. Confirmation of Carfentanil, U-47700 and Other Synthetic Opioids in a Human Performance Case by LC-MS-MS. Journal of Analytical Toxicology. 41 (6), 493-497 (2017).
  24. Strayer, K. E., Antonides, H. M., Juhascik, M. P., Daniulaityte, R., Sizemore, I. E. LC-MS/MS-Based Method for the Multiplex Detection of 24 Fentanyl Analogues and Metabolites in Whole Blood at Sub ng mL(-1) Concentrations. ACS Omega. 3 (-1), 514-523 (2018).
  25. Kahl, J. H., Gonyea, J., Humphrey, S. M., Hime, G. W., Boland, D. M. Quantitative Analysis of Fentanyl and Six Fentanyl Analogs in Postmortem Specimens by UHPLC-MS-MS. Journal of Analytical Toxicology. 42 (8), 570-580 (2018).
  26. Fogarty, M. F., Papsun, D. M., Logan, B. K. Analysis of Fentanyl and 18 Novel Fentanyl Analogs and Metabolites by LC-MS-MS, and report of Fatalities Associated with Methoxyacetylfentanyl and Cyclopropylfentanyl. Journal of Analytical Toxicology. 42 (9), 592-604 (2018).
  27. Lurie, I. S., Berrier, A. L., Casale, J. F., Iio, R., Bozenko, J. S. Profiling of illicit fentanyl using UHPLC-MS/MS. Forensic Science International. 220 (1-3), 191-196 (2012).
  28. Krajewski, L. C., et al. Application of the fentanyl analog screening kit toward the identification of emerging synthetic opioids in human plasma and urine by LC-QTOF. Toxicology Letters. 320, 87-94 (2020).
  29. Pirok, B. W. J., Stoll, D. R., Schoenmakers, P. J. Recent Developments in Two-Dimensional Liquid Chromatography: Fundamental Improvements for Practical Applications. Analytical Chemistry. 91 (1), 240-263 (2018).
  30. Keller, T., Keller, A., Tutsch-Bauer, E., Monticelli, F. Application of ion mobility spectrometry in cases of forensic interest. Forensic Science International. 161 (2-3), 130-140 (2006).
  31. Klingberg, J., Keen, B., Cawley, A., Pasin, D., Fu, S. Developments in high-resolution mass spectrometric analyses of new psychoactive substances. Archives of Toxicology. 96 (4), 949-967 (2022).
  32. Fleming, S. W., et al. Analysis of U-47700, a Novel Synthetic Opioid, in Human Urine by LC-MS-MS and LC-QToF. Journal of Analytical Toxicology. 41 (3), 173-180 (2017).
  33. Guale, F., et al. Validation of LC-TOF-MS screening for drugs, metabolites, and collateral compounds in forensic toxicology specimens. Journal of Analytical Toxicology. 37 (1), 17-24 (2013).
  34. Palmquist, K. B., Swortwood, M. J. Data-independent screening method for 14 fentanyl analogs in whole blood and oral fluid using LC-QTOF-MS. Forensic Science International. 297, 189-197 (2019).
  35. Adams, K. J., et al. Analysis of isomeric opioids in urine using LC-TIMS-TOF MS. Talanta. 183, 177-183 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fentanyl Analog ScreeningLC TIMS TOF MSTandem Mass SpectrometryLiquid ChromatographyIon Mobility SpectrometryData Dependent AcquisitionData Independent AcquisitionCollision Induced DissociationIsomer DifferentiationHigh Throughput Screening

İlgili makaleler