Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65565

⸱

11 Ağustos 2023

 ,  ,  , 
1Prion Research Center, Colorado State University, 2Department of Microbiology, Immunology and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

Bu makalede

Özet

Adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (AdMSC'ler), inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde yararlı olan güçlü immünomodülatör özelliklere sahiptir. Murin AdMSC'lerin ve primer karışık gliaların nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini, AdMSC'lerin anti-inflamatuar genleri ve büyüme faktörlerini yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağını, AdMSC'lerin göçünün nasıl değerlendirileceğini ve AdMSC'lerin primer karışık prion ile enfekte glia ile nasıl ko-kültür yapılacağını gösteriyoruz.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), anti-inflamatuar sitokinler, kemokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi yoluyla inflamasyonun güçlü düzenleyicileridir. Bu hücreler, prion hastalığı ve diğer protein yanlış katlanma bozuklukları gibi nörodejeneratif hastalıklar bağlamında nöroinflamasyonu düzenleme yeteneği gösterir. Prion hastalıkları sporadik, edinsel veya genetik olabilir; Beyindeki prion proteininin yanlış katlanması ve toplanmasından kaynaklanabilirler. Bu hastalıklar her zaman ölümcüldür ve mevcut bir tedavisi yoktur.

Hastalığın en erken belirtilerinden biri, astrositlerin ve mikrogliaların aktivasyonu ve saptanabilir prion agregasyonu ve nöronal kayıptan önce ortaya çıkan ilişkili inflamasyondur; bu nedenle, MSC'lerin anti-enflamatuar ve düzenleyici özellikleri, prion hastalığında astrogliozu tedavi etmek için hasat edilebilir. Son zamanlarda, BV2 hücreleri veya primer karışık glia ile birlikte kültürlenen adipoz kaynaklı MSC'lerin (AdMSC'ler) parakrin sinyalleme yoluyla prion kaynaklı inflamasyonu azalttığını gösterdik. Bu makale, prion kaynaklı inflamasyonu azaltmak için uyarılmış AdMSC'leri kullanan güvenilir bir tedaviyi açıklamaktadır.

Heterozigot bir AdMSC popülasyonu, murin yağ dokusundan kolayca izole edilebilir ve kültürde genişletilebilir. Bu hücrelerin inflamatuar sitokinlerle uyarılması, hem prion ile enfekte beyin homojenatına doğru göç etme hem de yanıt olarak anti-inflamatuar modülatörler üretme yeteneklerini arttırır. Birlikte, bu teknikler MSC'lerin prion enfeksiyonu üzerindeki terapötik potansiyelini araştırmak için kullanılabilir ve diğer protein yanlış katlanması ve nöroinflamatuar hastalıklar için uyarlanabilir.

Giriş

Glial inflamasyon, Parkinson, Alzheimer ve prion hastalığı dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir rol oynar. Anormal protein agregasyonu, hastalık patogenezi ve nörodejenerasyonun çoğuna atfedilse de, glial hücreler de bu 1,2,3'ün şiddetlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, glial kaynaklı inflamasyonu hedeflemek umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Prion hastalığında, hücresel prion proteini (PrPC), oligomerleri oluşturan ve beyinde agregat oluşturan ve homeostazı bozan hastalıkla ilişkili prion proteinine (PrPSc) yanlış katlanır 4,5,6.

Prion hastalığının en erken belirtilerinden biri, astrositler ve mikrogliadan kaynaklanan inflamatuar bir yanıttır. Mikroglia'nın uzaklaştırılması veya astrositlerin modifikasyonu yoluyla bu yanıtı baskılayan çalışmalar, genellikle hayvan modellerinde hastalık patogenezinde herhangi bir iyileşme göstermemiş veya kötüleşmiştir 7,8,9. Glial inflamasyonu ortadan kaldırmadan modüle etmek, terapötik olarak ilgi çekici bir alternatiftir.

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), iltihabı parakrin bir şekilde modüle etme yetenekleri nedeniyle çeşitli enflamatuar hastalıkların tedavisi için bir tedavi olarak sahne almıştır 10,11. Anti-enflamatuar moleküller, büyüme faktörleri, mikroRNA'lar ve daha fazlasını salgılayarak iltihaplanma bölgelerine göç etme ve bu ortamlardaki sinyal moleküllerine yanıt verme yeteneğini göstermişlerdir 10,12,13. Daha önce, yağ dokusundan türetilen MSC'lerin (AdMSC'ler olarak adlandırılır) prion ile enfekte olmuş beyin homojenatına doğru göç edebildiğini ve anti-inflamatuar sitokinler ve büyüme faktörleri için gen ekspresyonunu yukarı regüle ederek bu beyin homojenatına yanıt verebildiğini göstermiştik.

Ayrıca, AdMSC'ler, hem BV2 mikrogliasında hem de birincil karışık glia 14'te 3 (NLRP3) inflamatuar sinyalleme içeren Nod Benzeri Reseptör ailesi pirin alanı ve glial aktivasyon olan Nükleer Faktör-kappa B (NF-κB) ile ilişkili genlerin ekspresyonunu azaltabilir. Burada, hem AdMSC'lerin hem de birincil karışık glia'nın farelerden nasıl izole edileceğine, AdMSC'lerin modülatör genleri yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağına, AdMSC göçünün nasıl değerlendirileceğine ve AdMSC'lerin prion ile enfekte glia ile nasıl birlikte kültürleneceğine ilişkin protokoller sunuyoruz. Bu prosedürlerin, nörodejeneratif ve diğer hastalıklarda glial kaynaklı inflamasyonu düzenlemede MSC'lerin rolünün daha fazla araştırılması için bir temel sağlayabileceğini umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler, Colorado Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokol #1138'e uygun olarak, Lab Animal Care International Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş Colorado Eyaleti'nin Laboratuvar Hayvan Kaynakları'nda yetiştirildi ve bakımı yapıldı.

1. Primer kortikal karışık glia'nın prionlarla izole edilmesi ve enfekte edilmesi

  1. Hem astrositleri hem de mikrogliaları içeren birincil karışık gliaları izole etmek için, sıfır ila iki günlük C57Bl / 6 fare yavruları elde edin.
    NOT: Bu protokol önceki protokollerden uyarlanmıştır 15,16.
  2. Yavruları teker teker başlarını keserek ötenazi yapın ve beyincik ile beyin sapını ayırıp atarak beyinlerini çıkarın.
    1. Beyni, 2x Penisilin/streptomisin/neomisin (PSN) içeren soğuk MEM/EBSS içeren 3 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bir diseksiyon kapsamı altında, beyin yarım kürelerini ayırın ve orta beyni çıkarın ve atın. Hipokampus ve meninksleri korteksten çıkarın ve atın.
    2. Her iki kortikal hemisferi 5 mL MEM / EBSS + 2x PSN içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.
  3. Bir doku kültürü davlumbazında, bir pipet ile hafifçe aspire ederek ve kortikal doku parçalarını tüpün dibinde bırakarak ortamı 50 mL konik tüpten çıkarın. Kaplanmış bir cam pipet ile 10 mL önceden ısıtılmış ayrışma ortamı ekleyin ve dokuyu cam pipet ile 10-20x ezin.
  4. Süspansiyonu küçük bir karıştırma çubuğu içeren 50 mL'lik bir behere aktarın ve en düşük ayarda, yaklaşık 30 rpm'de 10 dakika boyunca bir karıştırma plakasına yerleştirin. Beheri karıştırma plakasından çıkarın ve dokunun dibe çökmesini sağlamak için 3 dakika boyunca 30°'lik bir açıyla ayarlayın. Hücre süspansiyonunu (süpernatant) çıkarın ve buz üzerinde 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
  5. 10 mL ayrışma ortamına DNaz-I (4.000 U / mL) ekleyin ve dokuyu yeniden süspanse edin ve 10 dakika daha karıştırın. 2-4 kez daha taze ayrışma ortamı (DNase-I olmadan) ekleyerek (kullanılan her iki fare yavrusu için bir kez) ve hücre süspansiyonunu buz üzerindeki 50 mL konik tüpe aktararak tekrarlayın, beherin dibinde sadece fibröz doku kalana kadar.
  6. Hücre süspansiyonunu konik tüpte 4 ° C'de 1.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve glial büyüme ortamı ile değiştirin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve hücreleri 10 cm hücre kültürü ile muamele edilmiş kaplarda10 6 inç yoğunlukta plakalayın. % 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
  7. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve yeni glial ortam ile değiştirin. Hücrelerin 2 hafta içinde% 100 birleşmesine izin verin; Ardından, deney yapmak için onları bölün ve tabaklayın.
  8. İn vitro prion enfeksiyonu için, 6 oyuklu plakalarda kuyu başına 100.000 hücrede plaka glia ve% 80 -% 100 birleşmeye izin verir. Hücre kültürüne eklemeden önce 30 dakika boyunca PBS'de% 20'ye seyreltilmiş hem prion hem de normal beyin homojenatlarını UV ışığına maruz bırakın. Enfekte olacak gliadan aspire edin ve her bir oyuğa, son hacim% 0.1 normal veya prion beyin homojenatı içeren 1.5-2 mL glial büyüme ortamı ekleyin.
  9. 72 saat sonra, ortamı aspire edin ve kalıntı beyin homojenatını gidermek için hücreleri PBS ile yıkayın. Taze glial büyüme ortamı ile değiştirin (beyin homojenatı içermez).
  10. AdMSC hücrelerini izole etmek için serolojik bir pipet kullanın ve yağ dokusunu ~ 1 mL HBSS / Tripsin çözeltisi ile birlikte nazikçe aspire edin. 200 U/mL DNaz-I ve 400 U/mL kollajenaz/Dispas karışımı ile 2 mL DMEM/F12 ortamı içeren 4 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Küçük bir makasla, yağ dokusu parçalarını küçük parçalar halinde (5 mm'den küçük) kesin ve 37 ° C'de 1,5 saat inkübe edin.
  11. Petri kabının içeriğini serolojik bir pipet ile 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve karışımı pipet ile ~ 10x tritüre edin. Dokunun kolayca parçalandığından ve nispeten homojen bir karışım oluşturduğundan emin olun. Karışımı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyin ve kırmızı görünecek olan stromal vasküler fraksiyonu peletleyin.
  12. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peleti 5 mL önceden ısıtılmış steril PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de 1.000 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL AdMSC ortamında (L-glutamin içeren ve %15 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (hiFBS), %1 amino asit, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %1 PSN ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM içinde yeniden süspanse edin.
  13. Taze, steril, 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve ayrışmamış dokuyu çıkarmak için hücre süspansiyonunu süzgeçten pipetleyin. 10 cm'lik hücre kültürü uygulanmış bir tabağa 9 mL AdMSC ortamı ekleyin ve süzülmüş hücre süspansiyonunu tabağa pipetleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
  14. Çıkarın ve ertesi gün yeni AdMSC ortamıyla değiştirin. Hücrelerin 72 saat ile 96 saat arasında geçişe hazır olduklarında %80-90 birleşim şeklini bekleyin.
  15. AdMSC'leri yukarıda tarif edildiği gibi izole edin ve tutarlı bir homojen popülasyon elde etmek için iki kez geçin 14. Hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın ve her plakaya 2 mL önceden ısıtılmış tripsin (% 0.25) pipetleyin. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika veya plakadan tamamen çıkana kadar inkübe edin. Her plakaya 8 mL önceden ısıtılmış AdMSC ortamı ekleyin, hücre süspansiyonunu karıştırmak için pipetleyin, konik tüpe aktarın ve peletlemek için 4 ° C'de 1.000 × g'da santrifüjleyin.
  16. AdMSC'leri 3-10 mL ortamda (kullanılan plaka sayısına bağlı olarak) yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. AdMSC ortamı içeren 6 oyuklu plakalarda 100.000 hücre/kuyu plakası. Gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
  17. Ertesi gün, hücreleri sitokinler veya beyin homojenatı ile uyarın.
    1. Sitokin ile uyarılan hücreler için, 10 ng / mL TNFa veya 200 ng / mL IFNγ içeren AdMSC ortamı yapın. Kontrol kuyuları için taze ortam kullanın.
    2. Prion ile enfekte beyin homojenat tedavileri için, terminal enfekte prion farelerinden (22L veya RML suşları) %20 beyin homojenatı (PBS cinsinden) elde edin. Kontroller için %0.1 prion ile enfekte olmuş veya normal beyin homojenatı nihai konsantrasyonuna sahip AdMSC ortamı yapın.
    3. Kuyucuklardan besiyerini aspire edin ve 1.5 mL sitokin veya beyin homojenat içeren besiyerini karşılık gelen oyuklara pipetleyin. Üç nüsha halinde gerçekleştirin. Plakaları inkübatöre geri koyun.
  18. Ortamı çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile 2x yıkayın, her oyuğa %1 βME içeren 350 mL lizis tamponu ekleyerek RNA'yı izole edin ve hücre lizatlarını çıkarmak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Bir DNaz sindirim adımı da dahil olmak üzere mini kit üreticisinin protokolünü izleyerek RNA izolasyonu gerçekleştirin. RT-qPCR için, numune başına 25 ng RNA'yı ters transkribe edin ve cDNA'yı SYBR Green ve her gen için 10 mM'de primerlerle çoğaltın. 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak mRNA ekspresyonunu analiz edin ve referans gen β-aktin 17'nin ekspresyonunu normalleştirin.
    NOT: Tüm RT-PCR, MIQE yönergelerine göre yapılmıştır.
  19. Kuyucuk başına 50.000 hücrede BV2 mikroglia plakası veya 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 100.000 hücrede birincil karışık glia. Ertesi gün BV2 hücrelerini% 0.1 prion enfekte veya normal beyin homojenatı içeren ortamla tedavi edin. Karışık glia için, hücrelerin beyin homojenatı ile enfekte olmak için% 80-90 birleşene kadar bekleyin.
  20. Hücreleri beyin homojenatı içeren ortamda 72 saat inkübe edin. Kalan beyin homojenatını çıkarmak için hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın ve taze ortam ekleyin ve inkübatöre geri dönün.
  21. Ortak kültür için pasaj 3'teki AdMSC'leri kullanın. AdMSC'leri uyarıyorsanız, 10 ng / mL TNFa içeren ortam kullanın ve BV2 veya karışık glia ile birlikte kültürlemeden önce 24 saat tedavi edin. Kalan TNFa'yı çıkarmak için uyarılmış AdMSC'leri 3x PBS ile yıkayın.
  22. Adım 1.15'te açıklandığı gibi AdMSC'leri deneyin ve AdMSC ortamında yeniden askıya alın.
  23. AdMSC süspansiyonunu 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün. Bu süre zarfında, BV2 hücreleri veya karışık glia üzerindeki ortamı, AdMSC ortamının oyuğu başına 2 mL ile değiştirin ve oyukların yarısına 0,4 mikrometre gözenek boyutuna sahip 6 oyuklu plakalar için ekler yerleştirin. Her bir inserte 2 mL AdMSC media ve insert almayan kuyucuklara 2 mL daha micro media ekleyin.
  24. AdMSC'lerin peletlenmesi bittiğinde, peleti AdMSC ortamında yeniden askıya alın. AdMSC'leri bir hemositometre ile sayın ve her bir inserte 50.000-100.000 hücre ekleyin.
  25. BV2 hücreleri için, ko-kültürleri 24 saat inkübe edin. Karışık glia için, 24 saat kadar az ve 7 gün kadar inkübe edin.
  26. İstenilen süre boyunca AdMSC'lerle inkübe edildikten sonra, ekleri çıkarın ve atın veya bunları yeni bir 6 oyuklu plakaya yerleştirin, ekleri PBS ile 2x yıkayın, karışık glia veya BV2 hücrelerine RNA izolasyon kiti tarafından sağlanan tamponu ekleyin ve AdMSC RNA'sını analiz etmek için ekleri kazıyın.
  27. Pasaj 2'deki AdMSC'leri 10 ng / mL TNFa içeren ortamla tedavi edin. Ertesi gün, hücreleri önceden ısıtılmış steril PBS 3x ile yıkayın ve serumsuz AdMSC ortamında 4 saat inkübe edin.
  28. Göçmen hücre tahlili yapmak için, ek başına 25.000 AdMSC ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 24 saat inkübe edin. Bu süre zarfında, göçmen hücreler kesici ucun üst bölmesinden hareket edecek ve ek parçanın alt tarafına yapışacaktır. Hem kuyucuğun hem de eklerin içeriğini dikkatlice aspire edin ve 2x'i PBS ile yıkayın, eklerin her iki tarafta nemli kalmasını sağlamak için her kuyucukta 1 mL PBS bırakın.
  29. Teker teker, forseps kullanarak, ekleri çıkarın ve göç etmemiş hücreleri çıkarmak için üst bölmeyi bir pamuklu çubukla nazikçe ama iyice silin. Kalan PBS'yi aspire edin ve 500 μL kristal viyole solüsyonunu kesici ucun hem kuyusuna hem de üst haznesine pipetleyin ve kesici uç membranının tamamen suya daldırıldığından emin olun.
  30. Ekleri oda sıcaklığında kristal viyole çözelti içinde 1 saat inkübe edin. Rengi en iyi şekilde korumak için, sonraki adımları bir kerede yalnızca bir kesici uçla hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
    1. Ekin kuyusundan ve üst haznesinden kristal viyole solüsyonunu aspire edin ve 3x'i PBS ile yıkayın. Üst hazneyi tekrar pamuklu çubukla silin.
    2. Ek parçayı, 1 mL PBS içeren 24 oyuklu yeni bir plakadaki bir kuyuya yerleştirin. Plakayı, bir kamera takılı olarak ters çevrilmiş bir mikroskobun üzerine yerleştirin. 10x objektifi kullanarak, kesici ucun merkezine doğru rastgele dört alanın görüntülerini çekin ve yalnızca kesici ucun alt tarafına odaklanın.
  31. Bunu her bir kuyucukla gerçekleştirdikten sonra, görüntüleri tercih ettiğiniz görüntü işleme yazılımına yükleyin ve mor lekeli hücrelerle kontrastı artırmak için arka planı ayarlayın. Hücreleri bir hücre sayacı ile manuel olarak sayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AdMSC'lerin 24 saat boyunca TNFa veya interferon-gama (IFNγ) ile uyarılması, anti-enflamatuar moleküllerin ve büyüme faktörlerinin ekspresyonunda değişikliklere neden olur. AdMSC'lerin TNFα veya interferon-gama (IFNγ) ile tedavi edilmesi, TNF ile uyarılan gen 6 (TSG-6) mRNA'yı arttırırken, TNFa, ancak IFNγ değil, dönüştürücü büyüme faktörü beta-1 (TGFβ-1) mRNA'da bir artışa neden olur. TNFα veya IFNγ ile stimülasyon, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) mRNA'da bir artışa neden olur, ancak fibrobla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, bir glial hücre modelinde prion kaynaklı inflamasyonu azaltmada adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (AdMSC'ler) etkilerini değerlendirmek için güvenilir ve nispeten ucuz bir protokol gösteriyoruz. AdMSC'ler, 1 hafta gibi kısa bir sürede kullanım için kültürde kolayca izole edilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol tutarlı bir şekilde, immünofloresan ve akış sitometrisi ile mezenkimal stromal hücrelerinkiyle tutarlı belirteçleri eksprese eden ve sitokinlere veya prion ile enfekte beyin homojenatına sok...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, hayvancılıkları için Lab Animal Resources'a teşekkür ediyor. Bu el yazması için finansman kaynaklarımız arasında Boettcher Fonu, Murphy Turner Fonu, CSU Veterinerlik Fakültesi ve Biyomedikal Bilimler Koleji Araştırma Konseyi bulunmaktadır. Şekil 2A, Şekil 2C ve Şekil 3A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 TripsinCytivaSH30042.01
5 mL serolojik pipetlerCelltreat229005B
6 oyuklu doku kültürü plakalarıCelltreat229106
10 cm hücre kültürü kaplarıPeak SerumPS-4002
10 ml serolojik pipetlerCelltreat229210
15 mL konik tüplerCelltreat667015B
50 mL konik tüplerCelltreat667050B
BV2 mikroglia hücre hattıAcceGen BiotechABC-TC212S
Hücre kaldırıcıBiologix Araştırma Şirketi70-2180
Kristal viyoleElektron Mikroskobu Bilimleri  12785
DispaseThermo Scientific17105041
DMEM/F12Caisson LabsDFL14-500ML
DNase-ISigma Aldrich11284932001
Esansiyel amino asitlerThermo Scientific11130051
Etanol (%100)EMD MilliporeEX0276-1
Fetal sığır serumu (ısı inaktive edilmiş)Peak SerumPS-FB4Laboratuvarda ısıyla inaktive edilmiş veya inaktive edilmiş olarak satın alınabilir
FormaldehitEMD Millipore1.04003.1000
Cam 10 mL serolojik pipetCorning  7077-10N
Çile' s Teraziler Tuz ÇözeltisiSigma AldrichH8264-500ML
Hemositometre / Neubauer OdasıDaiggerHU-3100
Yüksek Glikoz DMEMCytivaSH30022.01
L-glutamin içeren düşük glikoz DMEMCytivaSH30021.01
MEM / EBSSCytiva SH30024.
esansiyel olmayan amino asitlerSigma-AldrichM7145-100M
Paraformaldehit (% 16)MP Biyomedikal219998320
Penisilin / streptomisin / neomisinSigma-AldrichP4083-100ML
Fosfat tamponlu salinCytivave nbsp; SH30256.01
Rekombinant Fare IFN-gama Proteini R& D Systems485-MI
Rekombinant Fare TNF-alfa (aa 80-235) Protein, CFR& D Systems410-MT
RNeasy mini kitQiagen74104
Sigmacote SigmaAldrichSL2-100MLSigmacote'da iki kez yukarı ve aşağı aspire ederek ve iyice kurumaya bırakarak cam pipetlerin içini kaplayın. 24 saat sonra alüminyum folyo ve otoklav pipetlerine sarın.
StemxymeWorthington Biochemical CorporationLS004106Kollajenaz / Dispas karışımı
Steril, ayrı ayrı sarılmış pamuklu çubukPuritan Medical  25-8061WC
Thincert Doku Kültürü Ekleri, 24 kuyulu, Gözenek Boyutu=8 &mikro; mGreiner Bio-One662638
Thincert Doku Kültürü Ekleri, 6 oyuklu, Gözenek Boyutu=0.4 &mikro; mGreiner Bio-Bir657641
FS

Kaynaklar

  1. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  2. Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
  3. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  4. Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
  5. Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
  6. Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
  7. Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83(2019).
  8. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549(2018).
  9. Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
  10. Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114(2022).
  11. Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219(2022).
  12. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784(2019).
  13. Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
  14. Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567(2022).
  15. Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99(2017).
  16. Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324(2018).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26(2012).
  19. Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551(2016).
  20. Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559(2018).
  21. Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309(2017).
  22. Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408(2023).
  23. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
  24. Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
  25. Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
  26. Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
  27. Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728(2021).
  28. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).
  29. Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
  30. Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).
  31. Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Adipoz Kaynaklı MSC'lerPrion HastalığıGlial İnflamasyonKarma Glia Ko-KültürüNöroinflamasyonAstrosit AktivasyonuMikroglia AktivasyonuParakrin SinyallemeProtein Katlanma Bozukluğu
Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.