Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kolektif davranışlarını incelemek için nematodların büyük ölçekli ekimi

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65569

⸱

25 Ağustos 2023

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, nematodların toplu davranışlarını, köpek maması agar ortamı kullanılarak toplu olarak kültürlenerek incelemek için bir sistem rapor edilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların çok sayıda dauer solucanını çoğaltmasına izin verir ve Caenorhabditis elegans ve diğer ilgili türlere uygulanabilir.

Özet

Hayvanlar, kuş sürülerinde, balık sürülerinde ve insan kalabalığında gözlemlendiği gibi dinamik kolektif davranışlar sergilerler. Hayvanların kolektif davranışları hem biyoloji hem de fizik alanlarında araştırılmıştır. Laboratuvarda, araştırmacılar yaklaşık bir yüzyıl boyunca meyve sineği ve zebra balığı gibi çeşitli model hayvanları kullandılar, ancak bu genetik olarak izlenebilir model hayvanlar tarafından düzenlenen büyük ölçekli karmaşık kolektif davranışları incelemek büyük bir zorluk olmaya devam etti. Bu makale, Caenorhabditis elegans'ta deneysel bir kolektif davranış sistemi oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Yayılan solucanlar Petri plakasının kapağına tırmanır ve toplu sürü davranışı gösterir. Sistem ayrıca nemi ve ışık stimülasyonunu değiştirerek solucan etkileşimlerini ve davranışlarını kontrol eder. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirerek kolektif davranışların altında yatan mekanizmaları incelememizi ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. Bu nedenle, sistem hem fizik hem de biyolojide gelecekteki araştırmalar için yararlıdır.

Giriş

Hem bilim adamı olmayanlar hem de bilim adamları, kuş sürülerinde ve balık sürülerinde olduğu gibi hayvanların kolektif davranışlarından etkilenirler. Kolektif davranışlar fizik, biyoloji, matematik ve robotik dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda analiz edilmiştir. Özellikle, aktif madde fiziği, kendinden tahrikli elemanlardan oluşan sistemlere, yani kuş sürüleri, balık sürüleri, hareketli bakterilerin biyofilmleri, aktif moleküllerden oluşan hücre iskeletleri ve kendinden tahrikli kolloid grupları gibi enerji tüketen sistemlere odaklanan büyüyen bir araştırma alanıdır. Aktif madde fiziği teorisi, bireylerin davranışları ne kadar karmaşık olursa olsun, çok sayıda canlının kolektif hareketlerinin az sayıda basit kural tarafından yönetildiğini savunur. Örneğin, kendinden tahrikli parçacıkların kolektif hareketinin birleşik bir tanımı için bir aday olan Vicsek modeli, hayvan sürülerinde olduğu gibi, 2B'de eksantrik dalgalanma ile uzun menzilli sıralı bir faz oluşturmak için hareketli nesnelerin kısa menzilli hizalama etkileşiminin gerekli olduğunu öngörmektedir1. Aktif madde fiziği ile ilgili yukarıdan aşağıya deneysel yaklaşımlar hızla gelişmektedir. Önceki deneyler, Escherichia coli2'de uzun menzilli sıralı bir fazın oluşumunu doğruladı. Diğer son çalışmalarda hücreler 3,4, bakteriler5, hareketli kolloidler6 veya hareketli proteinler 7,8 kullanılmıştır. Vicsek modeli gibi basit minimal modeller bu gerçek fenomenleri başarıyla tanımladı. Bu tek hücreli deney sistemlerinin aksine, hiç kimse 10.000 gerçek kuş veya balıkla kontrollü deneyler yapmayı umamayacağından, hayvanların kolektif davranışları genellikle vahşi doğada gözlemlenir.

Biyologlar fizikçilerle aynı ilgiyi paylaşırlar: bireylerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdikleri ve işlevsel olarak bir grup olarak nasıl davrandıkları. Bireysel davranışı analiz etmek için kullanılan geleneksel araştırma alanlarından biri, davranışın altında yatan mekanizmaların nöronal ve moleküler düzeyde incelendiği sinirbilimdir. Şimdiye kadar birçok nörobilimsel aşağıdan yukarıya yaklaşım geliştirilmiştir. Fizikte yukarıdan aşağıya yaklaşımlar ve biyolojide aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, meyve sineği, solucan Caenorhabditis elegans ve fare gibi model hayvanlar kullanılarak kolaylaştırılabilir9. Bununla birlikte, bu model hayvanların laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışları hakkında çok az bulgu vardır10; Genetik olarak izlenebilir model hayvanları laboratuvarda büyük ölçekte hazırlamak hala zordur. Bu nedenle, biyoloji ve fizikteki kolektif davranışlar üzerine yapılan güncel araştırmalarda, genellikle laboratuvarda araştırma yapan bilim adamlarının hayvanların kolektif davranışlarını incelemesi zor olmuştur.

Bu çalışmada, nematodların kolektif davranışlarını incelemek için büyük ölçekli yetiştiriciliği için bir yöntem oluşturduk. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirmemize ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkisini incelememizeolanak tanır 10. Aktif madde fiziğinde, matematiksel modelin parametreleri hem deneylerde hem de simülasyonlarda kontrol edilebilir, bu da birleşik açıklamaları tanımlamak için bu modelin doğrulanmasını sağlar. Genetik, kolektif davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamak için kullanılır11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Solucanların hazırlanması

NOT: Vahşi tip N2 Bristol suşu12 ve ZX899 suşunu hazırlayın (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 sırasıyla kolektif davranışların ve optogenetik deneylerin gözlemlenmesi için. ZX899 gerginliğini karanlık koşullarda koruyun.

  1. Agar ile 14 mL nematod büyüme ortamı (NGM) içeren ve E. coli OP5012 ile tohumlanmış 60 mm'lik bir plaka üzerine dört iyi beslenmiş yetişkin solucan biriktirin.
  2. F1 solucanlarını NGM plakasında 7 gün boyunca 23 °C'de açlıktan ölün. F1 solucanlarının verimi bu noktada yaklaşık 100 solucan/plakadır. Solucanların aşamaları, karışık bir dauer ve aç L1 larvası popülasyonu içerir.

2. Köpek maması agar (DFA) orta boy plakalarının hazırlanması

  1. 2 g toz köpek maması ve 5 mL %1 agar ortamı içeren bir cam şişeyi otoklavlayın ve oda sıcaklığına soğutun (Şekil 1A).
    NOT: Bu deneyde farklı üreticilerin diğer köpek mamaları kullanılabilir.

3. Solucanların DFA orta plakalarına aşılanması

  1. E. coli OP50 ile tohumlanmış bir NGM plakasının merkezine küçük miktarlarda (yaklaşık 0.5 g) DFA ortamı aktarın (Şekil 1B). Optogenetik deneyler için, solucanların aşılanmasından önce kanal rodopsin 2'nin kofaktörü olan 40 μL 50 μM all-trans-retinal dökün.
  2. Açlıktan ölen solucanları otoklavlanmış su kullanarak dört NGM plakasından toplayın.
  3. DFA ortamına, tabağın kapağından yaklaşık 0.5 mm uzağa küçük bir köpek maması parçası (yaklaşık 2 g) yerleştirin.
  4. Kontaminasyonu önlemek için NGM plakasını temiz bir tezgah içinde 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla aydınlatın.
  5. Toplanan solucanları (yaklaşık 400 solucan) NGM plakaları üzerindeki DFA ortamına aşılayın. Petri plakasının içindeki nemin artmasını ve solucanları bir kapakta hapseden su damlacıkları oluşturmasını önlemek için plakayı parafilm ile kapatmayın.
  6. Solucanları 23 °C'de çoğaltın ve yaklaşık 10-14 gün boyunca plakanın kapağına kadar tırmanmalarına izin verin.
    NOT: Kapaklardaki solucanların sayısı 10-14 gün sonra neredeyse hiç artmadığından, solucanların muhtemelen yiyeceklerinin bittiği varsayılmıştır.

4. Kolektif davranışın gözlemlenmesi

  1. Deney gününde, E. coli ve köpek maması agar ortamı içermeyen yeni bir NGM plakasını, bir makro zoom mikroskobu sahnesinde bir alüminyum plaka üzerine yerleştirin (Şekil 2A). Bu yeni NGM plakasının altını bir Peltier sıcaklık kontrol ünitesi kullanarak en az 23 dakika boyunca 5 °C'de tutun (Şekil 2B). Ardından, bu yeni NGM plakasının kapağını, solucanların tırmandığı plakanın kapağıyla değiştirin. Düşük büyütmeli objektif olarak objektif lensi (x2, NA = 0.5) kullanın (Şekil 2A).
  2. Petri plakasının içindeki nemi değiştirmek için Petri plakasının tabanının sıcaklığını 23 °C'den 26 °C'ye yükseltin (Şekil 2).
  3. Kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini 20 kare s−1'de alın (Ek Video S1).
  4. Alınan görüntüleri Etiketli Görüntü Dosyası biçiminde kaydedin.

5. Optogenetik deney

  1. Mavi ışık vermek için bir filtre seti ile filtrelenmiş 100 W cıvalı bir lamba kullanın. Elektromanyetik bir deklanşör sistemi kullanarak aydınlatma süresini hassas bir şekilde kontrol edin (Şekil 2B).
  2. ZX899'u bu koşullar altında DFA'da mavi ışık aydınlatmasından önce 5 dakika koruyun.
  3. 23 °C'de tutulan mikroskop aşamasında bir Petri plakasının kapağına takılan ZX899 solucanlarını aydınlatın.
  4. 20 kare s−1'de bir kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini alın (Ek Video S2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, kolektif davranış gözlemleri için vahşi tip dauer solucanları kullanılmıştır. Solucanlar yaklaşık 10-14 gün boyunca 23 ° C'de yetiştirildi ve bir DFA orta plakasının kapağının iç yüzeyine tırmandı. Deney gününde, sadece kapak E. coli ve DFA besiyeri olmayan yeni bir NGM plakasına aktarıldı. Bu Petri plakasının tabanı başlangıçta Peltier sistemi kullanılarak 23 °C'de tutuldu ve daha sonra sıcaklığı 26 °C'ye çıkarıldı. Mikroskop altında bir film çekildi. Şekil 3'te filmin anl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, C. elegans'ın laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışı için bir sistem hazırlamak için bir protokol gösteriyoruz. DFA tabanlı yöntem ilk olarak, her ikisi de model olmayan hayvanlar olan Caenorhabditis japonica14 ve Neoaplectana carpocapsae Weiser15 ile kurulmuştur. Ancak bu yöntem kolektif davranışların araştırılmasında uygulanmamıştır. C. elegans, genetik olarak izlenebilir bir model hayvandır11,1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmada kullanılan suşları sağladığı için Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu yayın, JSPS KAKENHI Bilimsel Araştırma Hibesi (B) (hibe numarası JP21H02532), JSPS KAKENHI Yenilikçi Alanlar Yardım Hibesi "Yumuşak Robot Bilimi" projesi (hibe numarası JP18H05474), JSPS KAKENHI Dönüştürücü Araştırma Alanları için Yardım Hibesi B (hibe numarası JP23H03845), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan PRIME (hibe numarası JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Programı (hibe numarası JPMJMI22G3), ve JST-FOREST Programı (hibe numarası JPMJFR214R).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Escherichia coli< / em> ve C. elegans< / em > suşlar< / strong>
E. coli < / em > OP50 Caenorhabditis < / em > Genetik MerkeziOP50C elegans.< / em> Urasil oksotrofi. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) mec-4 ve unc-122 promotörün kontrolü altında ChR2 ve RFP eksprese eden genleri taşıyan mutant, sırasıyla
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics CenterWild-type C. elegans suşu
Solucan yetiştiriciliği için< / güçlü >
Agar saflaştırılmış, tozNakarai tesque01162-15NGM plakalarının hazırlanması için
All-trans retinalSigma-AldrichR2500Optogenetik için
Bacto peptonBecton Dickinson211677NGM plakalarının hazırlanması için
Kalsiyum klorürWako036-00485NGM plakalarının hazırlanması için
KolesterolWako034-03002NGM plakalarının hazırlanması için
di-Photassium hidrojenfosfatNakarai tesque28727-95NGM plakalarının hazırlanması için
Köpek mamasıNihon Pet FoodVITA-ONEKöpek maması hazırlamak için agar ortamı
LB suyu, LennoxNakarai tesque20066-95E. coli OP50
Magnezyum sülfat susuzTGIM1890NGM plakalarının hazırlanması için
Petri kapları (60 mm)Nunc150270NGM plakalarının hazırlanması için
Potasyum DihidrojenfosfatNakarai tesque28720-65NGM plakalarının hazırlanması için
Sodyum KlorürNakarai tesque31320-05İçin NGM plakalarının hazırlanması
Gözlem
BilgisayarCT çözümüCS6229Windows10 Pro, Intel Xeon Gold 6238R CPU ve 768 GB RAM
ile CMOS KameraHamamatsu fotonik ORCA-Lightning C14120-20PVeri toplama için
CMOS KameraOlympusDP74Veri toplama için
SZX-MGFP setli mikroskopOlympusMVX10Veri toplama için
x2 Objektif lensOlympusMV PLAPO 2XCÇalışma mesafesi 20 mm ve sayısal diyafram 0.5
Deklanşör kontrolü< / güçlü>
DeklanşörOptoSigmaBSH2-RIXIşık aydınlatmasının zamansal modelini kontrol etmek için
Deklanşör kontrolörüOptoSigmaSSH-C2B-AIşık aydınlatmasının zamansal modelini kontrol etmek için
Sıcaklık kontrolü< / güçlü >
Peltier sıcaklık kontrol ünitesiVICSWLVPU-30Petri plakası içindeki nemi kontrol etmek için
UNI-THEMO KONTROL CIHAZIAmpereUTC-100Petri plakası içindeki nemi kontrol etmek için
Veri toplama yazılımı
HCImageHamamatsu photonicsVeri toplama için

Kaynaklar

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nematod K lt rKolektif DavranCaenorhabditis ElegansS r lleme Davranevresel Manip lasyonOptogenetik DeneylerSolucan o altmaMakrozoom MikroskobuNem KontrolMolek ler Genetik
Kolektif davranışlarını incelemek için nematodların büyük ölçekli ekimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.