Method Article

İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi

DOI:

10.3791/65570

⸱

July 7th, 2023

 ,  , 
1Ksilink

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PH), orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybına neden olan bir dizi hücre biyolojik süreciyle bağlantılıdır. Mevcut birçok in vitro PD hücresel modeli karmaşıklıktan yoksundur ve çoklu fenotipleri hesaba katmaz. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı mDA nöronlarındaki fenotipik profilleme, PD ile ilgili bir hücre tipinde bir dizi nöronal fenotipi paralel olarak aynı anda ölçerek bu eksiklikleri giderebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen insan mDA nöronlarından fenotipik profiller elde etmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Nükleer, α-sinüklein, Tirozin hidroksilaz (TH) ve Mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) ile ilgili fenotipleri görselleştirmek için nörona özgü bir floresan boyama paneli kullanılır. Açıklanan fenotipik profilleme protokolü, 384 oyuklu plakalar, otomatik sıvı işleme ve yüksek verimli mikroskopi kullandığından ölçeklenebilir. Protokolün faydası, Lösin açısından zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) geninde PD'ye bağlı G2019S mutasyonunu taşıyan sağlıklı donör mDA nöronları ve mDA nöronları kullanılarak örneklendirilmiştir. Her iki hücre hattı da LRRK2 kinaz inhibitörü PFE-360 ile tedavi edildi ve fenotipik değişiklikler ölçüldü. Ek olarak, çok boyutlu fenotipik profillerin kümeleme veya makine öğrenimine dayalı denetimli sınıflandırma yöntemleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini gösteriyoruz. Açıklanan protokol, özellikle nöronal hastalık modellemesi üzerinde çalışan veya insan nöronlarındaki kimyasal bileşik etkilerini inceleyen araştırmacıların ilgisini çekecektir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığında (PH) çeşitli hücre biyolojik süreçleri bozulur. Örneğin, mitokondriyal disfonksiyon, oksidatif stres, protein yıkım kusurları, veziküler kaçakçılığın bozulması ve endolizozomal fonksiyon, orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybı ile ilişkilendirilmiştir ve PD1'de yaygın olarak gözlenir. Bu nedenle, PH, birbiriyle etkileşime girebilen ve birbirini kötüleştirebilen çoklu hastalık mekanizmalarını içeriyor gibi görünmektedir. Bu mekanik etkileşimi araştırmanın yararlı bir yolu, kapsamlı bir fenotipik parmak izinin veya orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlarının profilinin oluşturulmasıdır.

Fenotip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nöron tohumlaması için besiyeri ve plakaların hazırlanması (1. Gün)

  1. Plakaları Gün-1'de nöron tohumlamasına hazırlamak için, kullanmadan hemen önce Laminin'i oda sıcaklığına (RT) ısıtın. Laminin stok çözeltisini (0.1 mg / mL) soğuk PBS + / + (Ca 2 + ve Mg2 + ile) 1/10 oranında seyrelterek Laminin çözeltisini hazırlayın.
    NOT: Tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Çözeltilerin ve tamponların bileşimleri Tablo 1-4'te açıklanmıştır.
  2. Daha sonra, önceden kaplanmış 384 oyuklu bir Poli-D-Lizin (PDL) plakasının her bir oyuğuna 25 μL Laminin çözeltisi ekleyin ve gece bo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mDA nöronlarında fenotipik profilleme, hücresel biyolojinin birçok yönünü ve deneysel modülasyon sırasındaki değişikliklerini ölçmenin etkili bir yoludur. Bu metodolojiyi örneklemek için, bu çalışmada kriyoprezervasyonlu LRRK2 G2019S ve sağlıklı donör mDA nöronları kullanılmıştır. Bu nöronlar yaklaşık 37 gündür farklılaşmıştır, post-mitotik ve eksprese nöronal belirteçlerdir (TUBB3 ve MAP2) ve FOXA2 ile kombinasyon halinde tirozin hidroksilaz (TH) dahil olmak üzere dopaminerjik nöron belirteçleridir, glial belirteç Glial.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotipik profilleme, floresan boyama, mikroskopi ve görüntü analizi uygulayarak hücrelerdeki çok sayıda fenotipi ölçmek için kullanılan bir tekniktir3. Fenotipik profiller, hücresel biyolojide tek bir okuma kullanıldığında fark edilmeyebilecek karmaşık değişiklikleri anlamak için hücre hatları veya diğer deneysel koşullar arasında elde edilebilir ve karşılaştırılabilir. Burada, PD hücresel biyolojisini modellemek için sıklıkla kullanılan bir hücre tipi olan insan iPSC'den türetilmiş mDA nöronları.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar Ksilink tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, sunulan protokolün tasarımına yol açan değerli yardımları ve tartışmaları için Ksilink'teki tüm meslektaşlarına teşekkür eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-tavuk – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155İmmünofloresan
Anakondahttps://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213İmmünofloresan
Anti-fare - Alexa 488Thermo FisherA11001İmmünofloresan
Anti-tavşan - Alexa 555Thermo FisherA21429İmmünofloresan
Anti-TirozinHidroksilazMerck T2928İmmünofloresan
Anti-&alfa;-sinükleinAbcam138501İmmünofloresan
Bravo 384ST kafa AgilentSıvı işleyici yoksa, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir.
Konfokal mikroskop YokogawaCV7000Görüntü kalitesi tutarlılığını sağlamak için otomatik bir konfokal floresan mikroskobu kullanılması önerilir.
Kontes Otomatik hücre sayacıInvitrojenTohumlamadan önce hücre sayımı. Manuel bir sayma odası kullanılarak da yapılabilir.
DPBS +/+Gibco14040-133Yıkama Dispenseri için Tampon
nbsp;BioTek (Agilent) Sıvı işleyici yoksa, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir.
Formaldehit Çözeltisi (PFA %16)EuromedexEM-15710-SBoyama öncesi fiksasyon
Hoechst 33342InvitrogenH3570Nükleer boyama
iCell Baz Ortamı 1FujifilmM1010Nöronlar için temel ortam
iCell DPN, Donör # 01279, Fenotip AHN, lot # 106339, 1MFujifilmC1087Görünüşe göre sağlıklı donör
iCell DPN, Donör # 11299, Fenotip LRRK2 G2019S, fenotip PD lot # 106139FujifilmC1149LRRK2 G2019S mutasyonu taşıyan donör 
iCell Sinir Sistemi TakviyesiFujifilmM1031Temel ortam için
iCell Nöral Ek BFujifilmM1029Temel ortam
Jupyter Python NotebookHam verilerden fenotipik profil görselleştirme ve sınıflandırma gerçekleştirmek içinşirket içi geliştirmehttps://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling
LamininBiolaminaLN521Plaka kaplama
PFE-360MedChemExpressHY-120085LRRK2 kinaz inhibitörü
PhenoLinkanalizi içinşirket içi geliştirmehttps://github.com/Ksilink/PhenoLink
PhenoPlate 384w, PDL kaplıPerkin Elmer6057500Hücre kültürü ve görüntüleme için önceden kaplanmış plaka. Bu plaka, Yokogawa CV7000 mikroskobunun tüm amaçlarını kullanarak tüm kuyucukların görüntülenmesini sağlar.
Depolama plakaları Abgene 120 & mikro; LThermo ScientificAB-0781Vprep pipetleme sistemi kullanılarak bileşik dağıtım için gereklidir. Mevcut değilse, elektronik çok kanallı pipet kullanılması önerilir.
TritonSigmaT9284Lizis öncesi geçirgenlik
Tripan MaviSigmaT8154-20MLCanlı hücrelerin belirlenmesi
Vprep Pipetleme Sistemi AgilentOrtam değişimi ve bileşik dağıtımı. Alternatif olarak, elektronik çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
ile Otomatik Sıvı İşleme Platformu EL406 & ek için ek Notebook. Görüntü Yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phenotypic ProfilingDopaminergic NeuronsHuman Stem CellsParkinson s DiseaseMidbrain NeuronsHigh Throughput MicroscopyFluorescent StainingLRRK2 MutationImage SegmentationMachine Learning Classification

Related Articles