Method Article

Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

DOI:

10.3791/65572

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), klinik ve preklinik gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır. rAAV'ler için yeterince takdir edilmeyen bir kullanım, kültürlenmiş hücrelerin saflaştırmaya gerek kalmadan sağlam bir şekilde aktarılmasıdır. rAAV'ye yeni başlayan araştırmacılar için, transgen kaset klonlama, ham vektör üretimi ve hücre kültürü transdüksiyonu için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant adeno ile ilişkili viral vektörler (rAAV), çok çeşitli doku tiplerine entegrasyon olmaksızın güçlü ve dayanıklı transgen ekspresyonu sağlayabilir, bu da onları hayvan modellerinde ve klinik ortamlarda gen iletimi için popüler bir seçim haline getirir. Terapötik uygulamalara ek olarak, rAAV'ler, kültürlenmiş hücrelerde araştırmacının deneysel ihtiyaçlarına ve bilimsel hedeflerine göre uyarlanmış transgenler sağlamak için yararlı bir laboratuvar aracıdır. Bazı örnekler arasında eksojen muhabir genleri, aşırı ekspresyon kasetleri, RNA girişimi ve genom çapında ekranlar için olanlar da dahil olmak üzere CRISPR tabanlı araçlar bulunur. rAAV transdüksiyonları, hücreler için elektroporasyon veya kimyasal transfeksiyondan daha az zararlıdır ve üretmek için herhangi bir özel ekipman veya pahalı reaktifler gerektirmez. rAAV'leri içeren ham lizatlar veya şartlandırılmış ortam, birçok hücre tipini dönüştürmek için daha fazla saflaştırma yapılmadan doğrudan kültürlenmiş hücrelere eklenebilir - rAAV'lerin yeterince takdir edilmeyen bir özelliği. Burada, temel transgen kaset klonlaması için protokoller sağlıyoruz ve ham rAAV preparatlarının kültürlenmiş hücrelere nasıl üretileceğini ve uygulanacağını gösteriyoruz. Prensip kanıtı olarak, rAAV uygulamalarında henüz bildirilmemiş üç hücre tipinin transdüksiyonunu gösteriyoruz: plasental hücreler, miyoblastlar ve ince bağırsak organoidleri. Ham rAAV preparatları için uygun kullanımları, gen iletimi için rAAV'lerin sınırlamalarını ve kapsid seçimine ilişkin hususları tartışıyoruz. Bu protokol, araştırmacıların zahmetli titrasyon ve saflaştırma adımlarına ihtiyaç duymadan rAAV kullanarak hücre kültüründe verimli DNA iletimi elde etmeleri için basit, düşük maliyetli ve etkili bir yöntemi özetlemektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel fonksiyonların moleküler bazlarının aydınlatılması genellikle hücre kültüründe transgenik DNA'nın ekspresyonunu gerektirir. İfade edilebilmesi için, transgenlerin bir hücrenin seçici zarından geçmesi ve çekirdeğeulaşması gerekir 1,2. Bu nedenle, hücrenin fiziksel engellerini etkili bir şekilde atlama ve merkezi süreçlerini manipüle etme yeteneği, yeni biyolojik fenomenleri ortaya çıkarmak için transgenez uygulamak için bir gerekliliktir. Bir yaklaşım, virüslerin yabancı DNA'yı iletme ve ifade etme konusundaki içsel yeteneğinden yararlanır 3,4.

Adeno-ilişkili virüs (AAV) en küçük memeli virüslerinden biridir: 4.7 kilobaz (kb), tek sarmallı DNA genomu, 25 nm'lik 60 mer'lik bir ikosahedral kapsidin içinde paketlenmiş rep (replikaz için) ve cap (kapsid için) olmak üzere iki gen içerir. Rep/cap genleri, viral replikasyon, üretim ve paketleme için gerekli olan en az dokuz benzersiz proteini kodlayan birden fazla promotöre, okuma çerçevesine ve ekleme ürününe sahiptir 5,6. Ek olarak, genomun her iki ucu, transdüksiyon 7,8,9,10 sırasında DNA replikasyonu, genom paketleme ve aşağı akış işleme için gerekli olan ters terminal tekrarları (ITR'ler) adı verilen ikincil yapılar içerir. ITR'ler, genomun kapsid içine paketlenmesi için gerekli olan tek DNA elementleridir ve bu nedenle AAV, viral rep/cap genlerini bir araştırmacının seçtiği düzenleyici elementler ve/veya ilgilenilen genlerle değiştirerek transgen iletimi amacıyla klonlanabilir6. Ortaya çıkan rekombinant AAV (rAAV), tasarlanmış bir vektör genomu (VG) ile, klinikte insan gen terapisi için yaygın olarak kullanılmaktadır ve başarılar toplamıştır11. Vektörün yeterince takdir edilmeyen bir kullanımı laboratuvardadır; rAAV'ler, bir araştırmacının deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için kültürlenmiş hücrelerde transgen ekspresyonunu verimli bir şekilde sağlayabilir12.

rAAV üretmek için en yaygın yöntem, HEK293 veya 293T hücrelerine üçlü plazmit transfeksiyonudur (Şekil 1). Yaygın olarak cis plazmidi olarak adlandırılan ilk plazmit, ITR'ler (pAAV) ile çevrili istenen transgeni içerir. Uygulamaya bağlı olarak, güçlü destekleyiciler veya CRISPR tabanlı araçlar gibi ortak elementlere sahip cis plazmitleri satın alınabilir. İkincisi, trans halinde sağlanan vahşi tip AAV rep ve cap genlerini içeren pRep/Cap plazmididir - yani, daha sonra cis plazmidi ile etkileşime giren düzenleyici ve yapısal unsurları ifade eden ayrı, ITR içermeyen bir plazmid üzerinde - ve bu nedenle trans plazmid olarak adlandırılır. VG'yi fiziksel olarak çevrelemeye ek olarak, kapsid hücresel tropizmietkiler 12,13. Araştırmacılar, serotipe özgü kapak genini trans halinde sağlayarak, verilen hedef hücre için optimize edilmiş bir kapsid serotipi seçerek transdüksiyon verimliliğini kolayca en üst düzeye çıkarabilirler. Son olarak, bir Dependoparvovirus olarak AAV, pAdΔF614,15 gibi üçüncü bir plazmit üzerinde sağlanan adenoviral yardımcı genler tarafından elde edilen viral promotörlerinden rep/cap ekspresyonunu aktive etmek için bir yardımcı virüs gerektirir. 72 saatlik üçlü plazmit transfeksiyonundan sonra, vektör, tekrarlanan donma/çözülme döngüleri ile üretici hücrelerden kültür ortamına salınabilir. Tüm plaka içeriği daha sonra toplanır ve büyük hücresel kalıntılar santrifüjleme ile çıkarılır; Ortaya çıkan medya süpernatanı, aşağı akış transdüksiyonları için hazır ham bir rAAV preparatıdır.

HEK 293(T) hücre transfeksiyonu, vektör hasadı, transdüksiyon süreç diyagramı, gen ekspresyon analizi.
Şekil 1: Ham rAAV vektör üretimine genel bakış. Ham rAAV üretimi ve iletimi 5 gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

rAAV, elektroporasyon veya kimyasal/lipid bazlı transfeksiyon gibi hücresel toksisite, düşük verimlilik ve pahalı reaktifler ve ekipmanlarla yaygın olarak ilişkilendirilen diğer transfeksiyon yöntemlerine kıyasla transgen iletimi için daha uygun olabilir16,17. rAAV bu engelleri aşar ve genellikle minimum toksisite ve minimum uygulama süresi ile güçlü transgen ekspresyonu sağlar. Daha da önemlisi, rAAV'nin üretilmesi ve hücre kültürüne uygulanması basittir ve nadiren vektörün kültür ortamından saflaştırılmasını gerektirir (Şekil 1). Ek olarak, rAAV, Lentiviral transgen iletiminin aksine, VG'sini konakçı genomuna entegre etmez ve böylece insersiyonel mutajenezriskini azaltır 18. Transgen iletimi için rAAV kullanmanın potansiyel faydalarına rağmen, sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Daha da önemlisi, ITR'ler de dahil olmak üzere transgenin boyutu, kapsidin fiziksel kısıtlamaları nedeniyle 4.9 kb'yi geçmemelidir, böylece bir araştırmacının büyük düzenleyici unsurları ve transgenleri etkili bir şekilde sunma yeteneğini sınırlar. Ayrıca, rAAV entegre olmayan bir virüs olduğundan, transdüksiyon, bölünen hücrelerde geçici transgen ekspresyonu ile sonuçlanır ve kararlı ekspresyon için pratik olmayabilir. Bununla birlikte, çift rAAV ile verilen Cas9 ve homolojiye yönelik onarım (HDR) şablonlarını kullanan yöntemler, bir araştırmacı isterse, belirli genomik lokuslara dizileri kararlı bir şekilde eklemek için kullanılabilir19.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plazmit edinimi

NOT: Bu protokol, ilgilenilen bir geni (GOI) bir sitomegalovirüs (CMV) promotörü ve bir SV40 poli-adenilasyon dizisi (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40) ile ITR içeren bir plazmide klonlayacaktır. Bununla birlikte, bu plazmit, rAAV'ler üretmek için daha fazla klonlama yapılmadan, uygun bir çift EGFP ve Lusiferaz raportörünü paketleyerek kullanılabilir. Farklı düzenleyici unsurlara sahip veya CRISPR tabanlı deneyler gibi farklı uygulamalar için plazmitler çevrimiçi olarak mevcuttur ve aşağıdakilere benzer klonlama adımlarını izleyecektir (ek klonlama adımları için tartışmaya bakın). Ek olarak, farklı serotipler için rep/cap veya trans, plazmitler kullanılabilir - bu protokol AAV serotip 2 için rep/cap kullanacaktır.

  1. ITR içeren bir cis plazmid, bir adenovirüs yardımcı plazmidi, bir rep/cap plazmidi ve bir GOI içeren bir plazmit içeren bakteri bıçakları satın alın. Bakterileri, her bir plazmidin direncine özgü antibiyotikler içeren ayrı agar plakalarına sürün. Bakterileri büyümek için gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.
    NOT: GOI'li bir plazmit satın alınamıyorsa, sentetik bir DNA parçası (Malzeme Tablosuna bakınız) çevrimiçi olarak satın alınabilir. Ek olarak, istenirse tüm PCR sürecini atlamak için sentetik bir DNA parçası kullanılabilir.
  2. Her plakadan tek bir koloni seçin ve gece boyunca 30 ° C'de karşılık gelen antibiyotikle desteklenmiş 3 mL Luria Bertani (LB) tamponunda 180 rpm'de çalkalayarak büyütün. 1 mL bakteriyi, karşılık gelen antibiyotikle desteklenmiş 50 mL LB tamponu içeren steril bir 250 mL Erlenmeyer şişesine aktarın. Gece boyunca 30 °C, 180 rpm'de çalkalayın.
  3. Bakterileri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 3.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Üreticinin talimatlarına göre endotoksin içermeyen veya içermeyen bir midiprep kiti kullanarak plazmidi izole edin.
    NOT: ITR'ler kararsız yapılardır. ITR delesyonlarını veya mutasyonlarını önlemek için, hücresel bölünmeyi yavaşlatmak ve replikasyondaki hataları azaltmak için bakteri hücreleri 30 °C'de büyütülmelidir. Plazmit verimini ve saflığını artırmak için bir midiprep veya maxiprep kiti idealdir. Hücrelerin aşağı akış endotoksin kontaminasyonunu azaltmak için endotoksin düşük veya içermeyen bir kit kullanılması önerilir. Standart bir tezgahta yapıldığında plazmit preparatının kontaminasyonu olası olmadığından, laminer akış başlığı içinde plazmit izolasyonu yapmak gerekli değildir.

2. İlgilenilen genin AAV ITR içeren plazmide klonlanması

  1. GOI'yi içeren plazmid haritasını bir DNA görüntüleme yazılımında açın.
    NOT: ITR'ler de dahil olmak üzere tam kaset, kapsidin fiziksel paketleme sınırlamaları nedeniyle 4.9 kb'yi geçmemelidir. Ek olarak, ikincil yapılar nedeniyle ITR'ler aracılığıyla PCR amplifikasyonu sağlanamaz. Bu nedenle, Gibson derlemesi rAAV transgen klonlaması için önerilmez.
    1. Plazmidin tam dizisini ortaya çıkarmak için Sıra sekmesine tıklayın. GOI dizisinin en 5' bölgesine gidin ve ileri bir primer oluşturmak için gen gövdesine doğru içe doğru sürüklerken İlk Nükleotid'e tıklayın. ~55 °C'lik bir erime sıcaklığına (Tm) ulaşıldığında bırakın.
    2. İleri Primer'a tıklayın. Astar dizisinin 5' en ucundaki bir EcoRI kısıtlama bölgesi (5' GAATTC 3') için sırayı manuel olarak ekleyin. Ek olarak, enzimin DNA ile verimli bir şekilde etkileşime girmesine izin vermek için bu kısıtlama bölgesinin 5' ucuna altı ekstra rastgele baz ekleyin. Astar Ekle'ye tıklayın. Temsili bir örnek için Şekil 2'ye bakın.
    3. Saç tokası veya astar dimerleri oluşturamayacağından emin olmak için astarı kontrol edin (palindromik olan kısıtlama bölgesi hariç). Saç tokaları oluşursa, altı ekstra tabanın rastgele sırasını değiştirin. Ek olarak, astarın plazmit üzerinde başka hiçbir yere bağlanmadığından emin olun.
    4. GOI'nin gen gövdesinin içine doğru en fazla 3' bölgesinde bir ters primer oluşturmak için adımları tekrarlayın. Reverse Primer'a tıklayın ve bir NotI kısıtlama sitesi ekleyin (5' GCGGCCGC 3').
      NOT: GOI, EcoRI veya NotI kısıtlama bölgelerini içeremez - eğer öyleyse, farklı kısıtlama enzimlerinin kullanılması gerekecektir.
  2. GOI'yi 50 μL'lik bir PCR reaksiyonunda amplifiye edin. Tablo 1'deki gerekli bileşenleri kullanın.
    1. Reaksiyonu bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve programlama için Tablo 2'deki döngü parametrelerini izleyin. Primerler farklı T m'ye sahipse, program için alt Tm'yi kullanın.
    2. 5 μL PCR reaksiyonuna 1 μL jel yükleme boyası (6x) ekleyerek doğru PCR fragmanının amplifikasyonunu doğrulayın. Etidyum bromür içeren %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde bir DNA merdiveni ve PCR karışımı çalıştırın ve UV ışığı ile görselleştirin.
      DİKKAT: Etidyum bromür bilinen bir mutajendir.
    3. Jel üzerinde tek, spesifik bir bant belirirse, üreticinin talimatlarına göre kolon bazlı bir PCR temizleme kiti kullanarak PCR şerit tüpünde kalan PCR ürününü saflaştırın. Birden fazla bant ortaya çıkarsa (spesifik olmayan amplifikasyon nedeniyle), istenen bandı kesin ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın.
  3. Saflaştırılmış PCR ürününü ve pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 omurga plazmidini, 37 °C'de 1 saat boyunca Tablo 3'teki gerekli bireysel bileşenlerle 50 μL'lik bir reaksiyonda sindirin. Jel ekstraksiyonunu takiben beklenen verimsiz iyileşme nedeniyle daha büyük miktarda pAAV plazmit DNA'sı gereklidir.
    NOT: Kullanılan restriksiyon enzimleri yüksek sadakatli (HF) versiyonlardır. Normal NotCutSmart arabelleği ile kullanılamaz. Farklı enzimler kullanılıyorsa, farklı bir inkübasyon sıcaklığı ve tampon gerekebilir.
    1. Sindirilmiş PCR ürününü, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı bir PCR temizleme kiti ile saflaştırın.
    2. 50 μL sindirim reaksiyonuna 10 μL jel yükleme boyası (6x) ekleyerek jel elektroforezi için sindirilmiş pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 omurga plazmidini hazırlayın. Geniş dişli kuyucuklara sahip etidyum bromür içeren% 0.8 agaroz jel üzerine bir DNA merdiveni, sindirim reaksiyonu ve 250 ng sindirilmemiş plazmit (negatif kontrol) yükleyin. UV ışığı ile görselleştirin, istenen parçayı (~ 4.5 kb) kesin ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın.
  4. Sindirilmiş PCR ürününü ve sindirilmiş pAAV omurga plazmidini, Tablo 4'teki gerekli bireysel bileşenlerle 20 μL'lik bir ligasyon reaksiyonunda bağlayın. İhtiyaç duyulan PCR ürünlerinin miktarını hesaplamak için Formül 1'i kullanın. Tipik olarak, 50 ng omurga kütlesi ile 3:1 molar PCR ürünü (insert) / omurga (pAAV) oranı kullanın.
    Kütle formülü ekle, \( \text{Kütle ekle (ng)} = \frac{\text{omurga kütlesi (ng) × kesici uç uzunluğu (kb) × Ratio}}{\text{omurga uzunluğu (kb)}} \), moleküler klonlama hesaplamaları için denklem.Formül 1
  5. PCR ürününü suyla değiştirerek negatif kontrol gerçekleştirin. Ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca 16 °C'de veya oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  6. Yetkin, rekombinasyon eksikliği olan bakteri hücrelerinden (Stbl3 hücreleri gibi) oluşan bir şişeyi buz üzerinde çözdürün ve 50 μL'yi 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 3 μL ligasyon reaksiyonunu doğrudan hücrelere ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: ITR'ler kararsız yapılardır ve bu nedenle ITR delesyonu ve rekombinasyon olaylarını sınırlamak için rekombinasyon eksikliği olan bakteri suşları gerektirir. DH5α hücreleri, çoğaltma için aralıklı olarak kullanılabilir (bir veya iki kez), ancak uzun süreli kullanım için önerilmez. Midiprep saflaştırmasından sonra ITR bütünlüğü düzenli olarak kontrol edilmelidir.
    1. Bakterileri 42 °C'lik bir su banyosunda 30 saniye boyunca ısı şoku uygulayın, ardından hemen 2 dakika boyunca buza aktarın. 200 μL LB tamponu ekleyin ve 30 °C, 180 rpm'de 1 saat çalkalayın.
    2. Karışımın 125 μL'sini karşılık gelen antibiyotikle bir agar plakasına yayın ve gece boyunca (~ 18 saat) 30 ° C'de inkübe edin. Birden fazla klon seçin ve her birini karşılık gelen antibiyotiği içeren 3 mL LB içeren steril bir plastik kültür tüpüne yerleştirin. Gece boyunca 30 °C, 180 rpm'de çalkalayın.
      NOT: ITR delesyonlarını veya mutasyonlarını önlemek için, hücresel bölünmeyi yavaşlatmak ve replikasyondaki hataları azaltmak için bakteri hücreleri 30 °C'de büyütülmelidir. Ek olarak, ITR'leri olmayanlar diğerlerine göre büyüme avantajına sahip olabileceğinden daha küçük koloniler seçilmelidir.
    3. Her kültürün 1.8 mL'sini 2 mL'lik bir tüpe pipetleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Bir miniprep kiti kullanarak DNA'yı izole edin. Kalan 1.2 mL kültürü 4 °C'de saklayın. DNA dizilimi veya tanısal kısıtlama enzim sindirimi ile doğru klonları doğrulayın.
      NOT: Kesici ucun Sanger dizilimi önerilir, ancak ITR'ler aracılığıyla işlenebilirlik standart yöntemlerle elde edilemez. ITR'ler, aşağıda açıklandığı gibi kısıtlama özeti ile doğrulanmalıdır.
    4. Steril bir 250 mL Erlenmeyer şişesine karşılık gelen antibiyotiği içeren 50 mL LB tamponu ekleyin. Şişeye 500 μL kalan kültürü ekleyin ve 30 °C, 180 rpm'de 0.2-0.5'lik bir OD600'e ulaşılana kadar (~18 saat) çalkalayın. Bakterileri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 3.000 x g, 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Endotoksin içermeyen veya içermeyen bir midiprep kiti kullanarak DNA'yı izole edin.
    5. XmaI (veya SmaI) kullanarak 20 μL tanısal kısıtlama enzim sindirimi ile ITR bütünlüğünü kontrol edin. 500 ng plazmid, 0.5 μL enzim ve 1x tampon içeren bir reaksiyon hazırlayın; 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Reaksiyonu %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın. ITR'ler sağlamsa, sindirim ~ 2.9 kb'de bir bant ve kaset boyutunda başka bir bant verecektir. Bu belirgin bant gözlenmezse, ITR bozulmamış olabilir ve klonlamanın yeniden yapılması gerekecektir.
      NOT: XmaI (veya SmaI) kısıtlama bölgeleri içeren plazmitler (ITR'lerdekilere ek olarak) jel üzerinde ek bantlar görünecektir.

PCR primer tasarım diyagramı, DNA dizisi açıklaması, ileri ve geri primerler, gen gövdesi.
Şekil 2: Astar tasarımı için temsili örnek. Bir mScarlet transgeni için ileri ve geri astar tasarımı (temsili örnek). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

MiktarParça
X μLŞablon DNA (25 ng)
1 μLF astar (10 μM)
1 μLR astar (10 μM)
1 μLdNTP (10 mM)
10 μLPhusion Tamponu (5x)
1 μLPhusion Polimeraz
X μLSu
50 μLSon Cilt

Tablo 1: PCR amplifikasyon reaktifleri. Başarılı bir PCR reaksiyonu için gerekli bileşenler.

AdımSıcaklıkSaat
İlk denatürasyon98 °C1 dk
30 Döngü98 °C10 sn
Astarın Tm'si30 saniye
72 °CKB başına 30 sn
Son Uzatma72 °C10 dk
Tutmak4 °CSonsuza kadar

Tablo 2: PCR amplifikasyon programlaması. Başarılı bir PCR reaksiyonu için gerekli döngü parametreleri.

MiktarParça
X μLPCR ürünü (1μg) veya pAAV plazmidi (3μg)
5 μLTampon (10x)
1 μLEcoRI-HF Serisi
1 μLNotI-HF
X μLSu
50 μLSon Cilt

Tablo 3: Sindirim reaktifleri. Başarılı bir sindirim reaksiyonu için gerekli bileşenler.

MiktarParça
X μLEkle (X ng)
X μLOmurga (50 ng)
2 μLT4 DNA Ligaz Tamponu (10x)
1 μLT4 DNA Ligaz
X μLSu
20 μLSon Cilt

Tablo 4: Ligasyon reaktifleri. Başarılı bir ligasyon reaksiyonu için gerekli bileşenler.

3. Üçlü plazmid transfeksiyonu ile vektör üretimi

NOT: Aşağıdaki değerler, 2 mL'lik bir nihai ham hazırlama hacmi veren 6 oyuklu bir plakanın tek bir kuyusu için optimize edilmiştir. Tüm değerler, 20 mL'lik bir nihai hacim veren 15 cm'lik bir plaka için 10 kat büyütülebilir veya 500 μL'lik bir nihai hacme sahip 24 oyuklu bir plaka için 4 kat küçültülebilir.

  1. 100 mg PEI MAX'ı 100 mL damıtılmış suda çözerek 1 μg/μL'lik bir polietilenimin hidroklorür (PEI) MAX stoğu yapın. NaOH ile pH'ı 7.1'e ayarlayın. Filtre: Karışımı 0,22 μm'lik bir filtre ile sterilize edin ve uzun süreli saklama için -20 °C'de 1 mL alikotları dondurun. Çözüldükten sonra reaktifi 4 °C'de 1 ay saklayın.
  2. 3 x 10 5 HEK293 veya HEK293T hücreleri, önceden ısıtılmış Dulbecco'nun modifiye edilmiş kartal ortamı (DMEM,4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) ile 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir. 37 °C ve %5CO2'ye ayarlanmış bir inkübatörde ~u-90 birleşmeye kadar büyür (Şekil 3).
    NOT: Penisilin / streptomisin (P / S) ile kültürlenen hücrelerin vektör üretim verimini azalttığı gözlenmiştir. Uygun steril tekniğin kullanılması P / S kullanma ihtiyacını ortadan kaldırır ve bu nedenle HEK293 hücrelerinin antibiyotik20 ile kültürlenmemesi önerilir. Aşağı akış transdüksiyonlarında P/S gerekiyorsa, hasattan sonra ham preparasyona P/S eklenmesi önerilir.
  3. 2 mL'lik bir tüpte, 1.3 μg pAAV2 / 2 (Rep / Cap, serotip 2), 1.3 μg pAAV.GOI, 2.6 μg pAdΔF6 ve serumsuz (SF) DMEM (4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) içeren bir karışım hazırlayın toplam 100 μL hacme (uygun hesaplamalar için Ek Tablo 1'e bakın).
  4. pRep / Cap'i herhangi bir ilgisiz plazmit ile değiştirerek ayrı bir tüpte negatif bir kontrol hazırlayın. Negatif kontrol, nadir de olsa, transdüksiyon sırasında hücreleri transfekte edebilen ham preparatta bulunan paketlenmemiş pAAV.GOI plazmidini açıklar.
    NOT: Endotoksin içermeyen veya içermeyen maxiprep veya midiprep plazmid, üçlü transfeksiyon için idealdir ve genellikle miniprep DNA'ya kıyasla daha yüksek titre vektörü üretir, ancak miniprep DNA'sı hızlı ve kirli ön testler için kullanılabilir.
  5. Plazmid karışımına 5.2 μL PEI MAX ekleyin; Bu, 1:1 oranına sahip bir plazmit:PEI karışımıdır. 7'ye ayarlanmış bir vorteks karıştırıcıda 10-15 kez vurarak iyice karıştırın. Birden fazla vektör preparatı üretilirse, kuyucukları aspire etmek ve aşağıdaki adımlarda reaksiyonu seyreltmek için yeterli zamanlamaya izin vermek için her bir plazmit karışımına 1 dakikalık kademeli zaman aralıklarında (yani, t = 0 dakikada preparat 1, t = 1 dakikada preparat 2, vb.) PEI ekleyin.
    NOT: 1:1 plazmit:PEI oranının optimal olduğu gözlemlenmiştir. Ancak, bireysel kullanıcılar maksimum verimlilik için bu oranı optimize edebilir. PEI optimizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini öğrenmek için tartışmaya bakın (ayrıca Ek Tablo 2'ye bakınız).
  6. Her tüpü tam olarak 15 dakika inkübe edin ve ardından reaksiyonu 2 mL'lik bir son hacim için 1.9 mL SF DMEM (4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) ile seyreltin. Karıştırmak için 2 kez hafifçe pipetleyin. Aşırı karıştırma, Plazmid/PEI komplekslerini bozacak ve daha düşük transfeksiyon verimliliğine neden olacaktır.
  7. Ortamı kuyudan aspire edin ve hücresel ayrılmayı önlemek için plazmid: PEI karışımını kuyu taraflarına hafifçe ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 72 saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında hücre parçalanması ve ayrılması, rAAV üretiminin normal bir sürecidir (Şekil 4).

Mikroskop görüntüsünde hücre kültürü; Hücresel morfoloji analizi.
Şekil 3: HEK293 hücreleri transfeksiyona hazır. Üçlü plazmit transfeksiyonu için gerekli olan HEK293 hücrelerinin ideal birleşimi (% 75 -% 90). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dört gün boyunca hücre kültürü büyümesi; mikroskop görüntüleri Gün 0-3; hücre proliferasyon gözlemi.
Şekil 4: Transfeksiyon sonrası HEK293 hücreleri. HEK293 hücrelerinin pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 ve 1:1 plazmid:PEI oranı ile transfeksiyondan 1, 2 veya 3 gün sonra görünümü. Ölçek çubukları: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Ham vektör preparatlarının toplanması

  1. Transfekte edilmiş hücrelerin tüm plakasını -80 °C'de 30 dakika dondurun, ardından 37 °C'de 30 dakika çözün. Toplam üç donma/çözülme döngüsü için tekrarlayın. Kapağı çıkarmayın - plaka içeride steril kalmalıdır. Plakalar sonraki adımlara geçmeye hazır olana kadar -80 °C'de kalabilir.
    NOT: Nemlendirilmemiş bir inkübatör, çözdürme için en iyi sonucu verir, bu da plakaların dışında kazara kirlenmeye yol açabilecek yoğuşmayı en aza indirir.
  2. Aseptik teknikler kullanarak laminer akış başlığında aşağıdaki iki adımı gerçekleştirin. Hücrelerin maksimum bozulmasını sağlamak için her bir kuyuyu pipetleyerek karıştırın. Lizatı 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için oda sıcaklığında 15.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı dikkatlice yeni bir 2 mL'lik tüpe aktarın. Bu ham preparat, titrasyon veya saflaştırma olmadan hemen kullanılabilir. Vektör 4 ° C'de birkaç ay veya -20 ° C'de yıllarca saklanabilir.
    NOT: Gerekirse, titreler, DNaz'a dirençli partiküllerin içindeki vektör genomlarının (VG) sayısını ölçerek kantitatif PCR (qPCR) ile hesaplanabilir. Bu nedenle, titreler VG/mL birimlerinde verilir. 4 ° C'de birkaç ay saklanan vektör, kullanılmadan önce yeniden titre edilmelidir, çünkü vektör tüp duvarlarını toplayabilir ve / veya bağlayabilir, bu da preparatın titresini azaltabilir.

5. İletim

  1. İstenen hücre tipini (örneğin, Huh7) 96 oyuklu bir plakada, transdüksiyon süresine bağlı olarak% 50 -% 75'lik bir hedef birleşmede plakalayın. Daha fazla birleşme, AAV iletim verimliliğinin azalmasına neden olabilir.
  2. Yeni bir hücre tipinde transdüksiyon için bir kapsid panelinin test edilmesi gibi, dozun ilgili olmadığı uygulamalar için ham preparatın titresini bilmeden hücrelere vektör (örneğin, CMV.mScarlet) ekleyin. Uygulama için gereken optimum vektör miktarını elde etmek için serumsuz (SF) ortamda ham preparatın 1:3 seyreltme serisini gerçekleştirin. 96 oyuklu plakadan ortamı aspire edin ve kuyucuklara 50-100 μL seyreltilmiş ham preparat ekleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    NOT: Serum, AAV vektörünü nötralize edebilen ve transdüksiyon verimliliğini azaltabilen antikorlar içerebilir. Bununla birlikte, hassas hücre tipleri için transdüksiyon sırasında serum kullanılabilir.
  3. Transdüksiyondan 48 saat sonra (hpt) vektörü çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın. Vektörler ayrıca hassas hücre tipleri için 2 hpt kadar kısa sürede çıkarılabilir ve serum içeren ortamla değiştirilebilir. Birçok uygulama için, hücreleri dönüştürmek için gece boyunca inkübasyon yapın ve sabahları kuyucukları taze serum içeren ortamla değiştirin. Huh7 ve U2-OS gibi sağlam hücre tipleri, ortam değişikliği gerektirmez.
  4. Hücreleri 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyerek transdüksiyonu sonlandırın. Uygulamaya bağlı olarak çeşitli sonlandırma yöntemleri de kullanılabilir (örn. lizis). Çoğu hücre tipi için, tepe ekspresyonu 48 hpt ile gerçekleşir ve bu nedenle yaygın bir deneysel son noktadır.

6. Hücre tipine göre transdüksiyon yöntemindeki varyasyonlar

NOT: Farklı hücre tipleri, farklı kültür koşulları gerektirir. Bu nedenle, transdüksiyon için vektör ilavesi, hücre tipinin ihtiyaçlarına göre optimize edilmelidir. Aşağıda, bir araştırmacının kendi ihtiyaçları için denemek isteyebileceği bazı transdüksiyon protokolleri varyasyonlarını gösteren, temsili sonuçlara dahil edilen hücre tipleri için çok spesifik transdüksiyon protokolleri bulunmaktadır.

  1. Fare ince bağırsak organoidleri
    1. Fare ince bağırsak organoidlerini (mSIO'lar) C57BL / 6J farelerinden ince bağırsak kript preparatından türetin. Organoidleri% 90 bazal membran matrisine gömün ve organoid büyüme ortamı (antibiyotiksiz) veya ön transdüksiyon ortamı (% 50 Wnt3a şartlandırılmış ortam [organoid büyüme ortamında L Wnt-3A hücreleri kullanılarak kurum içinde üretilir], 10 mM nikotinamid, 10 μM ROCK inhibitörü ve 2.5 μM CHIR99021) 37 ° C ve% 5 CO2'de transdüksiyondan önce bir geçiş (5-7 gün) için.
    2. Transdüksiyondan önce, organoidleri D-PBS ile durulayın, pipetleme yoluyla bazal membran matris kubbelerini bozun ve organoidleri ayrışma ortamında 37 °C'de 10 dakika inkübe ederek ve daha fazla pipetleyerek küçük hücre kümelerine ayırın.
    3. 15 mM HEPES ile DMEM / F-12'ye %5 FBS ekleyerek hücre ayrışma sürecini durdurun, hücre kümelerini santrifüj tüplerine aktarın ve 1000 x g, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleme ile hücre kümelerini toplayın.
    4. Hücre kümelerini transdüksiyon ortamında (10 μg/mL polibren içeren ön transdüksiyon ortamı veya 10 μg/mL polibren içeren organoid büyüme ortamı) yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu plakalara aktarın, ardından AAV ham preparatları ambalajı CMV.mScarlet'in eklenmesi transdüksiyon için.
    5. Plakayı 600 x g ve 37 ° C'de 1 saat santrifüjleyerek organoidlerin transdüksiyonunu gerçekleştirin ve ardından 37 ° C'de 6 saat daha inkübe edin. Dönüştürülmüş organoidleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın, 1000 x g, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin ve buza koyun.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlgilenilen kültürlenmiş hücrelerin transdüksiyonu için en uygun kapsidin bulunması
Çeşitli kapsid serotiplerinin tropizmini belirlemek için çeşitli hücre tipleri transdüksiyon yapılmıştır (Şekil 5). Doğal serotipler AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 ve tasarlanmış kapsid varyantları Anc80 25, DJ26,LK03 27 veKP1 28, bu protokolde sağlanan yöntemler kullanılarak klonlanan bir CMV promotörü altında mScarlet'i eksprese eden bir vektör genomu ile paketlendi. Titre edilmemiş ham vektör preparatları uygun kültür ortamında seyreltildi ve hücreler 24+ saat boyunca transdüksiyona tabi tutuldu ve görüntülendi (Şekil 5B). Transdüksiyon verimliliği, mScarlet + olan toplam hücrelerin oranı veya mScarlet + olan tek bir z düzlemindeki hücrelerin oranı ile hesaplandı (fare ince bağırsak organoidleri için; Şekil 5C). Transdüksiyon verimlilikleri (mScarlet+ hücreleri) farklılaşmış C2C12 ve HSkMC miyotüpleri için değil, farklılaşmamış C2C12 ve HSkMC miyoblastları için sağlanır (Şekil 5A).

AAV2 ve KP1, test edilen hücre hatları arasında en güçlü serotiplerdi (Şekil 5A). Farklı türlerden kaynaklanan benzer hücre tiplerinin farklı verimliliklerde transdüksiyona uğradığı da gözlenmiştir. Örneğin, Hepa1-6 (murin kaynaklı bir karaciğer hücresi hattı), AAV2 kullanıldığında Huh7'ye (insan kaynaklı bir karaciğer hücresi hattı) kıyasla transdüksiyonda belirgin bir azalma sergiler (Şekil 5B). Ayrıca, transdüksiyon sırasında farklı medya koşulları önemli bir rol oynar. Transdüksiyon öncesi ortamda kültürlenen fare ince bağırsak organoidleri (mSIO'lar), organoid büyüme ortamında kültürlenenlere kıyasla daha az etkili bir şekilde transdüksiyona uğrar (Şekil 5C). Ek olarak, AAV2, farklılaşmamış HSkMC miyoblastlarını ve farklılaşmış HSkMC miyotüplerini verimli bir şekilde dönüştürür (Şekil 5B), ancak miyotüplerin kantitatif analizi zordur ve bu nedenle sağlanmaz.

Şekil 5'te çeşitli hücre tipleri için gözlemlenen yüksek transdüksiyon verimlilikleri, ham vektör preparatlarının, saflaştırma ve titrasyon gibi daha ileri adımlar olmadan çeşitli hücre tiplerini transdüksiyon etmek için etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, transgen iletimini en üst düzeye çıkarmak için bir kapsid seçerken dikkatli bir şekilde düşünülmelidir. Diğer birçok hücre dizisi ve kapsid daha önce test edilmiş ve saflaştırılmış vektör preparatları ile birlikte yayınlanmıştır12.

Ortam koşullarının vektör parçacığından bağımsız bir etkisi, iletimin verimliliğini etkileyebilir. Bununla birlikte, tropizmin (yani, vektörün hücre tipine özgü alımı ve ekspresyonu) kapsid spesifik bir özellik olduğu genel olarak kabul edilmektedir29. Doz uyumlu ham ve saflaştırılmış preparatlar arasındaki karşılaştırmanın hücresel tropizmi etkilediği henüz gözlenmemiştir. Bu nedenle, ham vektör preparatları, hücre kültüründe saflaştırılmış vektörlere benzer şekilde kullanılabilir.

Hücre hatlarında AAV vektör iletim verimliliği; veri tablosu, floresan mikroskobu görüntüleri.
Şekil 5: Çeşitli hücre tiplerinin ham vektör iletimi . (A) Bir mScarlet transgeni içeren çeşitli AAV vektörlerinin eklenmesini takiben mScarlet + yüzdesi. (B) AAV serotip 2'den verilen mScarlet'i eksprese eden hücreler. Ölçek çubukları: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 ve HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Kısaltmalar: hpt = transdüksiyondan sonraki saat. (C) Fare ince bağırsak organoidleri (mSIO'lar) ya transdüksiyon öncesi ortamda ya da organoid büyüme ortamında rAAV ile tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Üçlü plazmit transfeksiyonu çalışma sayfası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: PEI optimizasyon çalışma sayfası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonlama
Klonlama protokolü, yukarıda kullanılan pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 plazmidi ile sınırlı değildir ve bir araştırmacının deneysel ihtiyaçlarına göre kolayca değiştirilebilir. ITR içeren birçok plazmit, satın alınmak üzere çevrimiçi olarak kolayca temin edilebilir. Örneğin, hem Cas9 hem de bir sgRNA klonlama bölgesi içeren plazmitler mevcuttur, ancak oligonükleotid tavlama ve PNK tedavisi30 gibi birkaç ek adım gerektirir. Ek olarak, yalnızca ITR'leri olan ve hiçbir iç düzenleyici elemanı olmayan bir çoklu klonlama bölgesi (MCS) içeren plazmitler bulunabilir31. Farklı plazmitler kullanılacaksa, sindirim için kullanılan kısıtlama enzimleri (RE) tipik olarak bu protokolde değiştirilmesi gerekebilecek tek elementlerdir. Bununla birlikte, rAAV'nin bir sınırlaması, sınırlı kargo kapasitesidir. Kapsidin fiziksel sınırlamaları nedeniyle, vektör genomu ITR'ler dahil 4.9 kb'yi geçmemelidir.

Plazmidi bakterilerden izole ederken, üçlü plazmit transfeksiyonu veya transdüksiyonu sırasında hücrelere verilen zararı azaltmak için endotoksin düşük veya içermeyen bir midiprep veya maxiprep kiti kullanmak çok önemlidir. Miniprep kitlerinden elde edilen plazmid genellikle daha yüksek safsızlıklar, azaltılmış konsantrasyonlar ve daha az süper sarmal DNA içerir ve bunların tümü rAAV'nin aşağı akış üretimini etkileyebilir ve bu nedenle önerilmez.

Klonlama sırasında ITR'lerin yapısını ve özelliklerini anlamak çok önemlidir. İlk olarak, PCR'yi ITR aracılığıyla kullanmak son derece zordur. ITR'ler aracılığıyla PCR amplifikasyonu gerektiren klonlama tasarımlarından kaçınılmalı ve ayrıca Gibson montaj klonlama tekniğinin kullanımı sınırlandırılmalıdır. Bu nedenle, restriksiyon enzimi klonlaması, ITR içeren plazmitlere klonlama için tercih edilen yöntemdir. Ayrıca, dizilenen bölge ITR'yi içeriyorsa, Sanger dizilemesi için belirli primerler uyumlu olmayabilir. Bunun yerine, daha kesin dizileme sonuçları elde etmek için ITR'lerden uzağa ve vektör genom gövdesine dizilenen primerlerin kullanılması önerilir. İkincisi, ITR'ler plazmit amplifikasyonu için bakterilere dönüştürüldüğünde delesyonlara, yeniden düzenlemelere ve mutasyonlara eğilimlidir32,33. Bu olayları hafifletmek için, Stbl3 gibi rekombinasyon eksikliği olan yetkin bakteri suşlarının kullanılması ve hücresel bölünmeleri yavaşlatmak için 30 °C'de inkübe edilmesi önerilir. Son olarak, ITR'leri olmayanlar bir büyüme avantajı sağlayabileceğinden ve daha büyük olabileceğinden, daha küçük kolonilerin yeniden düzenleme veya silme olmaksızın klonlara karşılık gelebileceği gözlemlenmiştir. Bu nedenle, küçük kolonilerin seçilmesi önerilir.

Vektör üretimi
rAAV vektörünün başarılı üretimi birden fazla unsurdan etkilenebilir. Kritik bir faktör, transfeksiyon için kullanılan HEK293 veya 293T hücrelerinin sağlığıdır. Genel olarak, düşük pasaj sayıları idealdir, çünkü yüksek pasajlı hücreler rAAV titrelerini azaltabilen genotipik ve fenotipik varyanslar sergileyebilir. Ek olarak, etkili üretim için tohumlanan hücrelerin yoğunluğu u-90 oranında olmalıdır. Seyrek hücreler düşük vektör verimi üretir, çünkü vektör üretmek için daha az hücre bulunurken, aşırı büyümüş hücreler verimli bir şekilde transfekte edilmeyecektir.

Reaktif lotları, hücre stokları ve genel laboratuvardan laboratuvara değişkenlik arasındaki farklılıklar, transfeksiyon verimlilikleri ve üretim titresindeki farklılıklara katkıda bulunur. Titre iyileştirmelerine yol açabilecek optimize edilebilir bir faktör, transfeksiyon reaksiyonlarındaki plazmid:PEI oranıdır. Taze (<1 aylık) PEI MAX kullanmak çok önemlidir. Başlangıç noktası olarak 1:1'lik bir plazmid:PEI oranının kullanılması ve transfeksiyon veya transdüksiyon verimliliği zayıf görünüyorsa, birkaç farklı oranı test etmeniz önerilir. Burada klonlama için başlangıç materyali olarak kullanılan CMV.Luc.IRES.EGFP raportör trangene gibi görsel bir okumaya sahip bir transgen kullanılıyorsa, titre optimizasyonu en kolay yoldur. Optimizasyonu gerçekleştirmek için, 12 oyuklu bir plaka kullanarak ve plazmit kütlelerini ve reaktif hacimlerini ikiye küçültün (nihai plazmit kütlesi 2,6 μg'dir) protokol adımı 3'ü izleyin. PEI hacmini, 0,25'lik artışlarla 1:0,75 ila 1:3 arasında değişen oranlara karşılık gelecek şekilde ayarlayın (Şekil 6). Her reaksiyonu 15 dakika sonra 950 μL SF ortamı ile seyreltin. Kolaylık sağlamak için, üçlü plazmitleri içeren bir ana karışım yapılabilir ve PEI eklenmeden önce 1,5 mL'lik tüplere ayrı ayrı pipetlenebilir - Ek Dosya 2'ye bakın. Vektörü hasat edin, ilgilenilen hücreleri ve görüntüyü dönüştürün. En yüksek transdüksiyon verimliliğine (GFP + hücrelerinin oranı) sahip kuyu, PEI: DNA'nın en yüksek titresine ve en optimal oranına karşılık gelir.

Plazmid transfeksiyon proses diyagramı: Ana karışımı hazırlayın, PEI oranlarını değiştirin, hücreleri dönüştürün, vektörü hasat edin.
Şekil 6: PEI optimizasyon iş akışı. PEI optimizasyonu için gerekli adımların şeması. Çoklu plazmit oranları: Optimal oranı belirlemek için PEI test edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hasat ve titre hususları
rAAV vektörünü hasat etmek için kullanılan donma/çözülme tekniği, HEK293 hücrelerini, kültürlenmiş hücreleri dönüştürmek için arıtılmış lizatın doğrudan kullanımıyla uyumlu bir şekilde etkili bir şekilde parçalar. AAV1, AAV8 ve AAV9 gibi belirli rAAV serotipleri, vektör üretimi sırasında hücrelerden salınır ve donma/çözülme döngüleri34 olmadan kültürlenmiş hücre ortamından hasat edilebilir. Burada açıklanan yöntem tipik olarak AAV2 kapsidleri kullanılırken 1 x 10 10 VG/mL ve AAV8 için 1 x10 11 VG/mL mertebesinde titreler verir. Deterjan veya diğer kimyasal bazlı lizis ile daha yüksek titreler elde edilebilirken, bunlar aşağı akış kullanımında hücreler için zararlıdır ve rAAV'lerin lizattan daha fazla saflaştırılmasını gerektirir. Düşük titre, bir araştırmacının ham preparatların araştırma ihtiyaçları için uygun olup olmadığını belirlerken göz önünde bulundurması gereken bir ödünleşimdir, ancak burada açıklanan yöntemlerle üretilen marjinal olarak daha düşük titreler birçok hücre tipini çok iyi bir şekilde dönüştürebilir (temsili sonuçlara bakınız). Transfeksiyon verimliliği ve hücre sağlığına ek olarak, vektör titreleri, rAAV üretimi sırasında kullanılan kapsid ve VG35 içindeki transgenin boyutuna ve dizisine bağlı olarak değişir.

Ham vektör preparatları hasat edilirken, üçlü plazmit transfeksiyonu sırasında kullanılan plazmit DNA mevcut olabilir ve nadir olmasına rağmen, transdüksiyon sırasında aşağı akış transfeksiyonuna neden olabilir. Ayrıca, paketlenmemiş VG'ler kapsidlerin dışına bağlanabilir ve çıplak ve yabancı tek sarmallı DNA'ya doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir36,37. Bu nedenle, hassas hücre tipleri, paketlenmemiş VG'leri ve plazmidi uzaklaştırmak için vektör preparatlarının DNaz sindirilmesini ve saflaştırılmasını gerektirebilir.

Ham bir preparatın titresi hesaplanmak istenirse, DNaz-dirençli partiküller (DRP) içindeki paketlenmiş VG sayısını ölçmek için qPCR gerçekleştirilebilir. Kısaca, az miktarda ham preparat, plazmit DNA'yı, kontamine nükleik asitleri veya kısmen paketlenmiş VG'yi uzaklaştırmak için DNaz ile sindirilir. Numune daha sonra qPCR'ye tabi tutulur ve DRP'lerin içindeki korumalı VG ölçülür, bu da ham preparatın mL başına vektör genomu birimlerine sahip bir titreile sonuçlanır 38. Kapsid titrelerini ölçen ELISA tabanlı tahliller kullanılarak vektör titrasyonu yapılması önerilmez. Vahşi tip AAV virüsü ile karşılaştırıldığında, rAAV, boş ve kısmen paketlenmiş kapsidlerin bir kısmından muzdariptir39. ELISA, genom içeriklerine bakılmaksızın tüm kapsidleri ölçecek ve paketlenmiş bir VG gerektiren bir preparatta bulunan transdüksiyon birimlerini abartacaktır.

Transdüksiyonla ilgili dikkat edilmesi gerekenler
rAAV transdüksiyonlarını birçok faktör etkiler ve herhangi bir yeni deney için uygun değerlendirmeler yapılmalıdır. Transgen ekspresyonunu yönlendiren promotöre bağlı olarak, ekspresyon başlangıcı transdüksiyondan 4 saat sonra (hpt) kadar erken bir zamanda ortaya çıkabilir ve pik ekspresyon tipik olarak 48 hpt ile elde edilir. Hücrelerin ilk tohumlanmasından deneysel son noktaya kadar geçen süreyi akılda tutmak önemlidir. Bu, hücrelerin başlangıçtaki birleşmesini tahmin etmek ve deneyin sonunda aşırı büyümemelerini sağlamak içindir. Hücreler aşırı birleşirse, bir stres tepkisi nedeniyle hücresel davranış değişebilir ve deneysel sonuçları karıştırabilir. U2-OS gibi bazı hücre tipleri, aşırı büyümeyi / temas inhibisyonunu oldukça iyi tolere edebilir. Ek olarak, bu üretim protokolünün ürünü olan serumsuz şartlandırılmış ortamda uzun sürelere (48 saat +) dayanabilirler. Bununla birlikte, hassas hücre tipleri, transdüksiyon sırasında sağlığı korumak için serum ilavesini veya ham preparatın özel büyüme ortamı ile seyreltilmesini gerektirebilir. Serum içeren ortamın kullanılmasından kaynaklanan biraz azaltılmış transdüksiyon verimliliği, hücre sağlığı için potansiyel bir değiş tokuştur ve araştırmacı tarafından dikkate alınmalıdır.

Tipik olarak, hızla bölünen hücreler için, 48 hpt sonlandırılacak uygulamalar için yaklaşık% 50'lik bir başlangıç birleşimi en uygunudur. Bununla birlikte, izdiham, deneyin ihtiyaçlarına göre buna göre ayarlanabilir. Transdüksiyon verimliliğinin azalması nedeniyle tek katmanlı tip ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının u'in üzerinde birleşme özelliğinin iletilmesi önerilmez. Kültürlenmiş hücre tiplerinin çoğu, ham rAAV preparatları ile gece boyunca inkübasyondan sonra başarılı bir şekilde transdüksiyon ve sağlıklıdır, ardından sabahları taze serum içeren besiyerine geçilir.

Kapsid serotipi, bir hedef hücreyi dönüştürmek için rAAV üretirken dikkate alınması gereken önemli bir faktördür, çünkü kapsid, hücresel tropizmin ve müteakip transgen ekspresyonunun birincil belirleyicisidir13. AAV2, birçok kültürlenmiş hücre tipini etkili bir şekilde dönüştürme kabiliyeti nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir serotiptir12. AAV2'nin bu özelliği, AAV2 için birincil bağlanma faktörü olarak hizmet eden heparin sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) ve bir tabaktaadaptasyondan büyümeye kadar kültürlenmiş hücreler üzerindeki yüksek HSPG seviyelerine atfedilebilir 40. AAV9 gibi diğer kapsidler, geniş hücre tiplerini dönüştürmede daha az etkilidir ve bu ayarda ifade edilmeyen güven bağlanma faktörleri ile açıklanabilir41. Bu nedenle, istenen bir hedef hücre literatürde daha önce rAAV ile test edilmemişse, kültürlenmiş hücrelerde ilk tercih edilen kapsid olarak AAV2'yi öneriyoruz.

Ham vektör preparatlarının önemli bir sınırlamasının, hayvan modellerinin dönüştürülmesi için uygun olmamaları olduğunu lütfen unutmayın. İn vivo çalışmalar, preparatların saflaştırılmasını ve kalite değerlendirmesinden geçmesini gerektirir.

Transgen ekspresyonu ve potansiyel entegrasyon hususları
rAAV'ler, transgenin kalıcı ekspresyonuna güvenilir bir şekilde yol açmaz. Zamanla, VG'ler susturulabilir ve transgenik ekspresyon birkaç pasajdan sonra kapatılabilir42. Ek olarak, VG'lerin çoğunluğu epizomal kalır ve rAAV'ler, vahşi tip viral lizojenik bir enfeksiyonda olduğu gibi konakçı genomuna sık sık entegrasyona aracılık edecek veya VG'lerin replikasyonunu teşvik edecek viral Rep proteinlerini içermez43. Sonuç olarak, transdüksiyon hücrelerindeki epizomlar, sonunda bölünmeler yoluyla yavru hücreler arasında seyreltilecektir.

Bazal seviye entegrasyon, teslim edilen tüm transgenik DNA materyali için bir olasılıktır. Bununla birlikte, ITR içeren VG'ler daha yüksek bir frekanstaentegrasyona eğilimlidir 44. Bu nedenle, küçük bir hücre alt kümesinde bir transgenin kalıcı ekspresyonu gözlemlenebilir. Kullanıcılar, özellikle Cas9 gibi DNA kesici enzimler vermek için rAAV kullanırken bu olasılığı göz önünde bulundurmalıdır, çünkü çift sarmallı kırılmalar daha da büyük bir entegrasyon sıklığı ve kalıcı ekspresyon45 ile sonuçlanabilir. Bu, rAAV'yi endojen etiketleme veya gen ilavesi için homolojiye yönelik onarım şablonları sunmak için iyi bir aday haline getirirken, Cas9 yerleştirme olasılığı göz önünde bulundurulmalıdır19,46.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C.M., Janssen Pharmaceuticals'ın danışmanıdır ve NewBiologix için SAB'de hizmet vermektedir. Diğer tüm yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Robert Tjian ve Xavier Darzacq'a destekleri ve laboratuvar ekipmanlarını kullandıkları için teşekkür ederiz. KP1 ve LK03 rep/cap plazmidleri hediyesi için Mark Kay'e ve AAV4 rep/cap plazmidi için Luk Vandenberghe'ye teşekkür ederiz. Finansman, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (34430, RT) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü Eğitim Programı EDUC4-12790 tarafından sağlandı. N.W., Berkeley Kök Hücre Merkezi'nden Siebel doktora sonrası bursu ve Alman Araştırma Vakfı'ndan (DFG) Walter Benjamin bursu aracılığıyla fon aldığını kabul ediyor.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Snapgene DNA görüntüleme yazılımıSnapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40AddGene105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)AddGene104963
pAdΔ F6AddGene112867
LB Agar KarbenisilinSigma-AldrichL0418
Boekel Bilimsel Ekonomi Dijital İnkübatörBoekel Scientific133000
LB orta, tozMP Biyomedikal113002042
Karbensilin (Disodyum)GoldBioC-103-5
New Brunswick I26 ÇalkalayıcıEppendorfM1324-0000
50 mL Santrifüj TüpleriCorning430828
Santrifüj 5810 REppendorf22627040
QIAGEN Plazmid Plus Midi KitiQiagen12945
PCR ÇEKİLEBİLİR 8 TÜP ŞERİTLERABD Bilimsel1402-3900
Mastercycler bağlantınoktası Eppendorf6333000022
dNTPThermo Fisher Scientific18427013
5x Phusion BufferNEBB0518SPhusion Polimeraz
Phusion satın alındığında sağlanır  Yüksek Kaliteli DNA PolimerazNEBM0530S
Jel Yükleme Boyası, Turuncu (6X)NEBB7022S
DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı-100ZymoD4029
Zymoclean Jel DNA Kurtarma KitiZymoD4001
NotI-HFNEBR3189S
EcoRI-HFNEBR3101S
CutSmart Tampon (10x)NEBB6004SRestriksiyon enzimi
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific16500100 satın alındığında sağlanır
Etidyum BromürSigma-AldrichE1510
T4 DNA LigazNEBM0202S
T4 DNA Ligaz Reaksiyon TamponuNEBB0202ST4 Ligaz
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri (1.5 mL)Eppendorf22363204
Hassas Mikroişlemci Su BanyosuThermo Scientific51221046
Steril Plastik Kültür TüpleriFisher Scientific149566B
2.0 mL Mikrosantrifüj TüpüThomas Scientific1149Y01
ZR Plazmid Miniprep - KlasikZymoD4015
Xma1NEBR0180S
Sma1NEBR0141S
HEK 293T hücreleriATCCCRL-3216
Falcon 6 kuyuluCorning353046
Gibco  DMEM, yüksek glikoz, piruvatThermo-Fisher11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 İnkübatörüMarshall ScientificMCO-18AIC
PEI MAX (Polietilenimin Hidroklorür)Polysciences24765-100
Mikser Vortex Genie 2Elektron Mikroskobu Bilimleri102091-234
Sanyo Ultra Düşük DondurucuSanyo14656-15267-16219
INCU-Line IL 10, şeffaf pencereliVWR390-0384
Eppendorf MikrosantrifüjlerEppendorf05-400-005
Falcon 96 kuyuluCorning353072
C57BL/6J farelerJAXsuşu #000664
organoid büyüme ortamıKÖK HÜCRE Teknolojileri6005
L Wnt-3A hücreleriATCCCRL-2647
nikotinamidSigmaN0636-100G
KAYA inhibitörüKÖK HÜCRE Teknolojileri72302
CHIR99021KÖK HÜCRE Teknolojileri72052
Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal MembranFisher356231
24 kuyulu plakaFisher08-772-1
D-PBSThermo Fisher Scientific14-190-250
TrypLE ExpressFisher12604013
DMEM/F-12, 15 mM HEPESKÖK HÜCRE Teknolojileri36254
polibrenMillipore SigmaTR-1003-G
48 kuyulu plakalarFisher08-772-3D
Termo Bilimsel  Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak CamıFisher12-565-470
BeWo hücreleriATCCCCL-98
F-12K OrtaATCC30-2004
Hepa1-6ATCCCRL-1830
Huh7UC Berkeley BSD Hücre Kültürü TesisiHUH-7
C2C12ATCCCRL-1772
HSkMCATCCPCS-950-010
İskelet Kası Hücresi Büyüme OrtamıSigmaC-23060
İskelet Kası Farklılaşma OrtamıSigmaC-23061
Invitrogen  EVOS Dijital Renkli Floresan MikroskobuFisher Scientific12-563-340
Perkin Elmer Opera PhoenixPerkin ElmerHH14001000
PhenoPlate 96 kuyuluPerkin Elmer6055302
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok, fenol yok kırmızıThermo-Fisher31053028
GlutaMAX TakviyesiThermo-Fisher35050079
Sodyum PiruvatThermo-Fisher11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)Addgene104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)Addgene112864
pAAV2/9n (Rep/Cap)Addgene112865
pAnc80L65AAPAddgene92307
KP1 (rep/cap)Profesör Mark Kay (Stanford Üniversitesi)
edildiLK03 (rep/cap)Profesör Mark Kay (Stanford Üniversitesi)
(rep/cap)Profesör Luk Vandenberghe (Harvard Tıp Okulu)
Addgene61591
pAAV.MCSAddgene46954
gBlock (sentetik DNA fragementi)IDT
satın alındığında sağlanır pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)Addgene 130878 tarafından hediye tarafından hediye edildipAAV4 tarafından hediye edildipAAV.Cas9.sgRNA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456(2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42(2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662(2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85(2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV TransductionRecombinant AAVTransgene ExpressionGene DeliveryCrude AAV PreparationCultured CellsViral VectorsDNA DeliveryCell Culture TransductionReporter Genes

Related Articles