Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Summary

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Abstract

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC'lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO'yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.

Introduction

Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit ^5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik m....

Protocol

Bu protokolde 4 haftalık çıplak erkek fareler kullanılır. Dört fareyi 22−24 °C ve %50−%70 bağıl nemde 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında bir kafeste barındırın. Tüm hayvan deneyleri, Tokyo Tıp ve Diş Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir (onay kimliği: A2019-204C, A2020-116A ve A2021-121A).

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. MSC büyüme ortamının ek kitini MSC bazal ortamına ekleyerek mezenkimal kök hücre büyüme ortamını (MSC büyüme ortamı) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
2. Ortama %10 fetal sığır serum....

Results

MSC kapsüllü HA hidrojeller, kondrogenez^41'in bir indükleyicisi olan TGFβ3 ile takviye edilmiş kondrojenik ortamda kültürlendi (adım 4.1). HA'nın özelliklerini, daha önce tarif edildiği gibi, endokondral kemikleşme için MSC bazlı yapay kıkırdak greftleri oluşturmada etkili olduğu gösterilen kollajen özellikleriyle karşılaştırdık³⁸. Farklılaşmamış MSC'ler bu çalışmaya negatif kontroller olarak dahil edilmemiştir, çünkü farklılaşmamış MSC'lerin osteojenik farklılaşma (yani me.......

Discussion

Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA'nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz ³⁸. Ayrıca, in.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Tripsin-1mmol/L EDTA.4Na Çözeltisi	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
askorbat-2-fosfat	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
temel fibroblastik büyüme faktörü	Reprocell	RCHEOT002
sığır serum albümini	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	012-23881	7.5 w/v%
Kontes Otomatik Hücre Sayacı, hücre sayma odası slaytları ve Tripan Mavisi lekesi ile %0.4İnvitrojen		C10283
deksametazon	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta	Merck	D6429	yüksek glikoz
Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta/Besin Karışımı F-12 Jambon	Merck	D6421
Fetal sığır serumu	Hyclone	SH30396.03
Gentamisin sülfat	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	1676045	10 mg/mL
Haccpper Jeneratör	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hipokloröz asitli su
İnsan Mezenkimal Kök Hücreleri	Lonza	PT-2501
HyStem Hücre Kültürü İskele Kiti	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G takviyesi	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	090-06741	ve zamanlar; 100
L-Alanil-L-Glutamin	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	016-21841	200mmol/L (&kez; 100
)L-prolin	Nacalai Tesque	29001-42
L-Tiroksin	Merck	T1775
MSCGM Mezenkimal Kök Hücre Büyüme Ortamı BulletKit	Lonza	PT-3001
parafin	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Merhem	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-gliserofosfat	FUJIFILM Wako Saf Kimyasal	048-34332