Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Özet

Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), ana bakterilerden miras alınan proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi biyoaktif molekülleri aktaran, bakteri-bakteri ve bakteri-konakçı iletişiminde aktif rol oynayan bakterilerden türetilen nanoveziküllerdir. Bağırsak mikrobiyotasından türetilen BEV'lerin gastrointestinal sistem içinde etkileri vardır ve uzak organlara ulaşabilir, bu da fizyoloji ve patoloji için önemli etkilere neden olur. İnsan dışkısından elde edilen BEV'lerin türlerini, miktarlarını ve rollerini araştıran teorik araştırmalar, bağırsak mikrobiyotasından BEV'lerin salgılanmasını ve işlevini anlamak için çok önemlidir. Bu araştırmalar aynı zamanda BEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için mevcut stratejide bir iyileştirme gerektirmektedir.

Bu çalışma, iki yoğunluk gradyanlı santrifüj (DGC) modu oluşturarak BEV'lerin izolasyon ve saflaştırma sürecini optimize etti: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya. BEV'lerin zenginleştirilmiş dağılımı 6 ila 8 (F6-F8) fraksiyonlarında belirlendi. Yaklaşımın etkinliği, partikül morfolojisi, boyutu, konsantrasyonu ve protein içeriğine göre değerlendirildi. Partikül ve protein geri kazanım oranları hesaplandı ve iki DGC modunun geri kazanımını ve saflığını karşılaştırmak için spesifik belirteçlerin varlığı analiz edildi. Sonuçlar, Yukarıdan aşağıya santrifüj modunun daha düşük kontaminasyon seviyelerine sahip olduğunu ve Aşağıdan yukarıya modelinkine benzer bir geri kazanım oranı ve saflığa ulaştığını gösterdi. 10⁸ / mg'lık bir fekal BEV konsantrasyonu elde etmek için 7 saatlik bir santrifüj süresi yeterliydi.

Bu yöntem, dışkı dışında, bileşenlerdeki ve viskozitedeki farklılıklara göre uygun modifikasyonla diğer vücut sıvısı tiplerine de uygulanabilir. Sonuç olarak, bu ayrıntılı ve güvenilir protokol, BEV'lerin standartlaştırılmış izolasyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştıracak ve böylece sonraki multi-omik analiz ve fonksiyonel deneyler için bir temel oluşturacaktır.

Giriş

Bağırsak, insan vücudunda en bol bulunan mikrobiyal toplulukları barındıran organ olarak kabul edilmektedir ve bakterilerin %90'ından fazlası kolonizasyon ve çoğalmada^{rol oynar 1,2}. Kapsamlı kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının bağırsak mikroçevresini modüle ettiğini ve aynı zamanda, öncelikle bozulmuş bir bağırsak bariyeri ^3,4 yoluyla uzak organlardaki işlev bozukluğu ile etkileşime girdiğini göstermiştir. Artan kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının dengesizliği ile inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu ^{göstermektedir5,6} ve ayrıca bağırsak-beyin ekseni 5,6,7,8 yoluyla bilişsel bozukluklar. Bakteriler tarafından üretilen bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler) bu patolojik süreçlerde önemli rol oynar.

BEV'ler, çapları 20 ila 400 nm arasında değişen, bakteri türevlerini kapsülleyen nano ölçekli parçacıklardır. Bakteriler ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşimleri kolaylaştırdıkları gösterilmiştir ^9,10. Görünmez olmalarına rağmen, bu parçacıklar, tanısal biyobelirteçler, terapötik hedefler ve ilaç dağıtım araçları olarak ileriye dönük geniş uygulamaları nedeniyle araştırmacıların artan ilgisini çekmiştir¹¹. Ağırlıklı olarak bağırsak bakterilerinden elde edilen BEV'leri incelemek için genellikle biyonumune olarak kullanılan insan dışkısı, diğerleri arasında su, bakteri, lipitler, proteinler, sindirilmemiş gıda artıkları ve pul pul dökülmüş epitel hücrelerinin karmaşık bir karışımını içerir. Karmaşık dışkı bileşimi, BEV'lerin izolasyonu ve saflığı için zorluklar yaratır ve böylece BEV'lerin kapsamlı, objektif ve gerçekçi bir analizini engeller. Bu nedenle, kirletici bileşenlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek ve BEV'lerin verimini artırmak için etkili stratejiler, derhal ilgilenilmesi gereken kritik konular olarak ortaya çıkmıştır.

Mevcut izolasyon stratejileri büyük ölçüde ultra yüksek hızlı santrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi tekniklere dayanmaktadır12,13,14,15,16,17. Şu anda DGC, numunenin ilk yükleme konumu tarafından belirlenen "Yukarıdan aşağıya" ve "Aşağıdan yukarıya" olmak üzere iki sedimantasyon-yüzer modu kapsayan, BEV ayırma alanında en yaygın olarak uygulanan yöntemlerden biridir. Bu metodolojiler, hücre dışı vezikülleri (EV'ler) boyut ve yoğunluk eşitsizliklerine dayalı olarak diğer bileşenlerden ayırarak değişken saflık ve geri kazanım oranları sağlar. Önceki araştırmalar, EV'leri kandaki^{lipoprotein 18} ve idrardaki Tamm-Horsfall proteini¹⁹ gibi vücut sıvısı örneklerinde çözünür proteinlerden yeterince ayırmak için tek yaklaşımlı stratejilerin yetersiz olduğunu göstermiştir. Ek olarak, ökaryotik hücre dışı veziküllerin (EEV'ler) boyut dağılımı genellikle BEV'lerinkiyle örtüşür ve bu nedenle BEV verimini optimize etmek için daha fazla metodolojik geliştirme gerektirir. Sonuç olarak, BEV'lerin çalışmasını ilerletmek, etkili ayırma ve saflaştırma metodolojilerinin geliştirilmesine bağlıdır. Özellikle, Tulkens ve ark.¹⁵, fekal BEV'leri EEV'lerden ayırmak için ortogonal bir biyofiziksel strateji kullandılar, burada Aşağıdan yukarıya DGC modunun santrifüjleme süresi 18 saate kadardı. Buna karşılık, bu çalışma bunu 7 saate düşürdü, gradyan-ultrasantrifüj süresinden büyük ölçüde tasarruf sağladı ve süreci basitleştirdi.

Bu çalışmada, BEV'leri düşükten aşırı yüksek hıza kadar bir dizi diferansiyel santrifüj hızıyla zenginleştirdikten sonra, optimize edilmiş tampon koşulları altında iki DGC modu kullanan fekal BEV'leri izole ettik ve saflaştırdık. Morfolojiye, partikül boyutuna ve konsantrasyona dayalı değerlendirmeler, bu gelişmiş yöntemle övgüye değer bir performans gösterdi. Bu çalışma, gelecekteki araştırmalar için temel oluşturabilir, uygulamalarını daha geniş bir alana genişletebilir ve insan vücudundaki BEV'lerin heterojenliği hakkında fikir verebilir. Ayrıca BEV ayırma ve analiz tekniklerinin standardizasyonuna da katkıda bulunur.

Protokol

Güney Tıp Üniversitesi Nanfang Hastanesi Etik Kurulu, katılımcıların bilgilendirilmiş onamıyla yürütülen bu çalışmayı onayladı. Burada kullanılan tüm yöntemler, Uluslararası İnsan Mikrobiyom Standartları (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/) tarafından sağlanan standart çalışma yönergelerine bağlı kalmıştır. Sonraki tüm sıvı işleme prosedürlerinin bir biyogüvenlik kabini veya ultra temiz bir tezgah içinde gerçekleştirilmesi zorunlu kılındı.

1. Dışkı örneklerinin toplanması ve alıntılanması

1. Bir dışkı örnekleyici, kapalı bir torba ve bir buzlu kutu dağıtın ve katılımcılara örneklerin nasıl temin edileceği ve korunacağı konusunda kapsamlı talimatlar verin.
2. Her katılımcıya, sağlanan örnekleyiciyi kullanarak dışkı örneğini toplamasını ve 24 saatlik bir pencere içinde 4 °C sıcaklıkta laboratuvara taşımasını söyleyin.
3. Laboratuvarda alındıktan sonra, önceden tartılmış 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 3,5 g'dan daha az dışkıyı ayırmak için steril bir kaşık kullanın. Sonraki ön işlem prosedürleri için dışkı örneğinin ağırlığını tüp üzerine not edin.
   DURAKLAMA NOKTASI: Numunelerin hemen işlenmesi mümkün değilse, numuneyi uygun notasyondan sonra -80 °C'de uzun süreli depolama için tahsis edin.

2. Dışkı numunesi hazırlama

1. 500 mL fosfat tamponlu salini (PBS) 4 °C'de soğutun. Önceden soğutulmuş PBS'yi 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm Polietersülfon (PES) filtresinden on adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne filtreleyin.
2. Her biri 3,5 g dışkı örneği içeren iki adet 50 mL'lik tüpü buz üzerine yerleştirin. Her tüpe 35 mL PBS ekleyin.
   NOT: Dışkı çözünmesi için gerekli PBS miktarını hesaplayın ve maksimum numune konsantrasyonunun %10 (a/h) olmasını sağlayın. Ek numuneler işliyorsanız, gerektiğinde daha fazla tüp kullanın.
3. S'yi çalkalayınamps 300 rpm'de 2 °C'de 4 saat veya dışkı tamamen görünür şekilde tamamen süspanse olana kadar en az 4 °C'de 8 saat yerleştirin.

3. Diferansiyel hızlı santrifüjleme

1. Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
2. Adım 2.3'te hazırlanan numuneleri içeren iki tüpün ağırlığını PBS ile toplam 0.1 g ağırlığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
3. Numuneleri 3.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanı, peletin yaklaşık 1 mL üzerinde bırakacak şekilde iki temiz 50 mL santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin. Bu işlem için tek kullanımlık plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
5. Toplam ağırlığa ± 0,1 g içinde ulaşmak için PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
6. Transfer edilen süpernatanı 12.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatanı 20 mL'lik bir şırınga kullanarak aspire edin, şırınga iğnesini çıkarın ve 0.22 μm filtrelerden 50 mL'lik tüplere süzün. Bu noktada, süpernatan hacmi yaklaşık 30 mL olmalıdır.
   NOT: 12.000 × g santrifüjlemeden sonra hala önemli miktarda kirlilik görünüyorsa, santrifüj adımını 12.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika tekrarlamak gerekir. Bunun yapılmaması, filtrasyon sırasında gözenek tıkanması nedeniyle önemli bir BEV kaybına neden olabilir.

4. Ultra yüksek hızlı santrifüjleme

1. Kalan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için rotoru ve kovayı %75 (h/h) alkolle silerek temizleyin.
2. Tüp tutucuya 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin.
   NOT: Numune hacmine göre uygun ultrasantrifüj tüpünü seçin. Ürün kılavuzunda belirtildiği gibi santrifüj tüpleri sterilize etmek için ultraviyole radyasyondan ve uygun olmayan kimyasal reaktiflerden kaçının.
3. Filtrelenmiş fekal süpernatantın yaklaşık 30 mL'sini Adım 3.7'den ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
4. Ultrasantrifüj tüpünü, tüpün açıklığından 3 mm boşluk bırakarak yaklaşık 8 mL PBS ile doldurun.
5. İki ultrasantrifüj tüpünü numunelerle birlikte karşılıklı ultrasantrifüj kovalarına yerleştirin, örneğin kova 1, 4 (1-4), 2-5, 3-6'ya karşılık gelir.
6. Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki kovanın ağırlığını ayarlayın.
7. Boruların yüklü olup olmadığına bakılmaksızın tüm kovaları rotora takın.
8. Vakumu başlatın ve numuneleri 160.000 × g'da 4 °C'de 70 dakika santrifüjleyin.
9. Hazne vakumunu serbest bırakın ve cihazın Ana sayfasında Hazır görüntülendiğinde kapıyı açın.
10. Rotoru ultrasantrifüjden çıkarın.
11. Kovaları rotordan rafa taşıyın ve bir pense kullanarak boruları alın.
12. Altta görünür kahverengi topaklar içerecek olan süpernatanı atın.
13. Peletleri, tamamen askıya alınana kadar 1 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Tüpü yaklaşık 37 mL PBS ile doldurun ve açıklıktan 3 mm boşluk bırakın.
14. Kısmen bağlı kirletici bileşenleri tüp duvarlarından çıkarmak için 4.5 ° C'de 4.11 dakika boyunca 160,000 × g'da 4-4 adımlarını izleyerek başka bir ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
15. Süpernatanı atın, iki ultrasantrifüj tüpünü 5 dakika ters çevirin ve iç duvarda kalan çözeltiyi silecekler ile temizleyin.
    NOT: İç duvarın temizlenmesi, ultrasantrifüj tüpü duvarına yapışan artık kontaminasyondan kaynaklanan paraziti en aza indirir. Özellikle partikül boyutu ile ilgili olarak BEV analizini etkilemeyecek silecekleri seçin.
16. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 1,2 mL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS ile yukarı ve aşağı pipetleyerek her tüpteki peletleri yeniden süspanse edin.
17. 1.2 mL PBS / BEV çözeltisini bir ultrasantrifüj tüpünden temiz bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın.
    DURAKLAMA NOKTASI: Bir ultrasantrifüj tüpünden toplanan PBS/BEV çözeltisi Adım 6'ya geçebilir. Diğer tüpteki çözeltiyi -80 °C'de saklayın.

5. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için çözelti hazırlama

1. 0,02 M HEPES tamponunun hazırlanması
   1. 0.477 g HEPES tozu ve 0.8 g NaCl'yi 90 mL otoklavlanmış deiyonize su ile birleştirin.
   2. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Deiyonize su ile hacmi 100 mL'ye getirin ve çözeltiyi 0.22 μm PES membranlarından süzün.
      DİKKAT: Sodyum hidroksit güçlü bir kostik alkalidir. Operatörler bunu bir çeker ocakta dikkatli bir şekilde tutmalı ve hazırlamalıdır.
2. Yoğunluk gradyan tamponunun hazırlanması
   1. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için ultrasantrifüj tüplerinin sayısına bağlı olarak her bir yoğunluk gradyan tamponunun gerekli hacmini hesaplayın (Adım 6) (Bu protokolde, %60, %50, %40, %20 ve %10 gradyan çözeltileri için hacimler sırasıyla 2.5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL ve 6 mL idi).
   2. % 50 (a / h) iyodiksanol çalışma çözeltisinin hazırlanması için, 0.02 M HEPES tamponunu ve% 60 (a / h) iyodiksanol stok çözeltisini 1: 5 (0.5 mL: 2.5 mL) hacim oranında karıştırın.
      NOT: İodiksanol stok çözeltisini geri çekmek ve hava girmesini önlemek için tek kullanımlık 20 mL'lik bir şırınga kullanın.
   3. Farklı konsantrasyonlarda iyodiksanol tamponları hazırlamak için, Adım 5.2.2'deki %50 iyodiksanol çalışma solüsyonunu, Tablo 1'de gösterilen oranlara göre 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 5.1'de elde edilen HEPES tamponu ile birleştirin.
      NOT: Adım 5'i ışıklar kapalıyken ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin. Bakteri üremesini önlemek için açılmış iyodiksanol stok çözeltisini buzdolabında 4 °C'de saklayın. İodiksanol çözeltisini ve HEPES tamponunu ışıktan koruyun.

6. Yoğunluk gradyanlı santrifüj sisteminin kurulması

1. Yukarıdan aşağıya DGC modu
   1. Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS / BEV çözeltisini 3 mL PBS ile birleştirin. 3,5 mL PBS/BEV çözeltisi elde etmek için çözeltileri 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.
   2. 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünü delikli bir köpük plaka üzerine yerleştirin ve "↓" olarak etiketleyin.
   3. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüpün dibine dikey olarak 3 mL% 50 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   4. Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
   5. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   6. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL% 20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   7. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %10 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   8. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine Adım 6.1.1'den 3,5 mL PBS / BEV çözeltisi ekleyin.
   9. Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
      NOT: Pipetlemeden sonra tabakalaşma görünür olmalıdır.
2. Aşağıdan yukarıya DGC modu
   1. Delikli bir köpük plaka üzerine 31 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve "↑" olarak etiketleyin.
   2. Tüpün dibine dikey olarak 2.5 mL% 60 iyodiksanol stok çözeltisi ekleyin. 3 mL %50 iyodiksanol/BEV çözeltisi elde etmek için 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak Adım 4'ten izole edilen 500 μL PBS/BEV çözeltisi ile hafifçe karıştırın.
   3. Tüpü 70°'lik bir açıyla eğin ve köpük plaka seviyesinin biraz üstüne, tüpün açıklığının altına bir tüp tutucu veya başka bir destek yerleştirin.
   4. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak %50 iyodiksanol/BEV çözeltisinin üzerine 3 mL %40 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   5. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak %40 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3 mL %20 iyodiksanol çözeltisi ekleyin.
   6. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak% 20 iyodiksanol çözeltisinin üzerine% 10 iyodiksanol çözeltisinden 3 mL ekleyin.
   7. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak% 10 iyodiksanol çözeltisinin üzerine 3,5 mL PBS ekleyin.
   8. Tüpleri yavaşça dik konuma getirin.
   9. Bu noktada, Adım 4.17'de elde edilen süspansiyonun 200 μL'si kaldı ve bu daha sonra "UC" adlı bir grup olarak analiz edilebilir.
      NOT: Adım 6'da çözeltileri aktarırken, pipet ucunu her zaman tüpün eksenine dik olarak ultrasantrifüj tüpü duvarına karşı tutun.

7. Yoğunluk gradyan santrifüjleme ve fraksiyon toplama

1. Toplam ağırlığı ± 0,005 g olacak şekilde PBS ile iki tüpün ağırlığını ayarlayın.
2. Tüpleri Adım 4.5'e göre kovalara yerleştirin ve 4 °C'de 7 saat boyunca 160.000 × g'da santrifüjlemeye tabi tutun.
3. Fraksiyonları bir pipetleyici (1000 μL) kullanarak yukarıdan aşağıya yan duvara şu sırayla toplayın: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1.5 mL ve 3 mL, 38.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünde.
   NOT: Görüş hattını sıvı yüzeyiyle aynı seviyede tutun.
4. Adım 4'e göre Adım 7.3'te elde edilen her fraksiyon için 160.000 × g'da 4 ° C'de 70 dakika boyunca ultrasantrifüjleme gerçekleştirin.
5. Süpernatanı çıkarın ve ultrasantrifüj tüplerini 5 dakika boyunca ters çevirin.
6. Peletleri 200 μL'lik bir pipet kullanarak 200 μL önceden soğutulmuş (4 °C) PBS'de yeniden süspanse edin.
7. PBS/BEV çözeltisini temiz bir 1,5 mL mikrotüpe aktarın.
8. F1'den F10'a kadar olan kesirleri etiketleyin ve Adım 8'e göre analiz edin.
   DURAKLAMA NOKTASI: Adım 7.8'de elde edilen numuneler hemen işlenemiyorsa, -80 °C'de saklayın.

8. Toplanan kesirlerin karakterizasyonu ve kantitatif analizi

1. Karşılık gelen yoğunluklarını hesaplamak için boş kontrollü bir mikroplaka dedektörü kullanarak her bir fraksiyonun absorbans değerlerini (OD 340 nm) belirleyin.
   NOT: Boş bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözümünü (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) PBS ile değiştirin.
   1. Sırasıyla 1.0058 g/mL, 1.0318 g/mL, 1.058 g/mL, 1.0708 g/mL ve 1.111 g/mL yoğunluklara karşılık gelen standartlar olarak %50 stok çözeltisine (Adım 5.2.2) dayalı olarak 0,%5, %10, %12,5 ve %20 iyodiksanol çözeltisinin her biri 100 μL hazırlayın.
   2. 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını çoğaltmak için boş kontrolden (Adım 7.3'te hazırlanan) her fraksiyondan 50 μL ve her standart çözeltiden (Adım 8.1.1'de hazırlanan) 50 μL ekleyin.
   3. Dalga boyunu 340 nm'ye ayarlayın, uç nokta optik yoğunluğunu ölçün ve her bir fraksiyonun yoğunluğunu hesaplayın.
   4. F4-F9'u yoğunluklarına göre BEV kesirlerinin aralığı olarak tanımlayın.
2. Bikinkoninik asit tahlili (BCA) kullanarak BEV fraksiyonlarının protein konsantrasyonunu belirleyin.
   1. 0.5 μg / μL standart protein çözeltisi hazırlamak için üretici tarafından sağlanan PBS'deki maddeyi on kat seyreltin.
   2. Reaktif talimatlarına göre değişen hacimlerde standart protein çözeltisini (Adım 8.2.1'de hazırlanan) ekleyin ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu PBS ile toplam 20 μL hacme tamamlayın.
   3. Her bir kuyucuğa Adım 7.8'de hazırlanan numunelerden 20 μL ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneler ilave edilir.
   4. A ve B reaktiflerini 50:1 oranında karıştırın ve her bir oyuğa 200 μL aktarın.
   5. Plakayı 37 °C su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
   6. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans değerini ölçün, protein konsantrasyonunu (μg/μL) hesaplayın ve Adım 8.2.2'de seyreltilmiş standart çözeltilerin değerlerinden üretilen standart eğriye (x: optik yoğunluk; y: protein konsantrasyonu) dayalı olarak numunelerin protein içeriğini (μg) belirleyin.
3. BEV'lerin varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin. Aşağıdaki tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
   1. Adım 7.8'den izole edilen her bir F4-F9 fraksiyonundan 10 μL uygulayın ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri 20 dakika boyunca Formvar/Karbon destekli bakır ızgaralara uygulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
   2. Numuneleri 100 μL PBS ile her biri 1 dakika boyunca üç kez durulayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
   3. Numuneleri 100 μL %1 (a/h) glutaraldehit ile 5 dakika sabitleyin ve filtre kağıdı ile kurulayın.
   4. Izgaraları 100 μL PBS ile her biri 2 dakika boyunca on kez yıkayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
   5. Izgaraları 50 μL% 1.5 (a / h) uranil asetat ile 10 dakika boyayın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
      DİKKAT: Uranil asetat radyoaktiftir ve cilt ile temas ettiğinde veya solunduğunda son derece toksiktir. Uranil asetat içeren çözeltileri bir çeker ocakta tutun ve uygun güvenlik önlemlerini alın.
   6. Izgaraları 5 dakika boyunca %1 (a/h) metilselüloz damlasına aktarın ve filtre kağıdı ile kurulayın.
   7. Havayla kurutulmuş ızgaraları gözlemleyene kadar karanlık, tozsuz bir ortamda saklayın.
   8. Görüntüleri yakalayın ve bir TEM kullanarak analiz edin.
4. Partikül sayısını saymak için nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak Adım 8.1.4'te tanımlanan BEV fraksiyonlarını karakterize edin.
   1. Sistemi 110 nm polistiren parçacıkları kullanarak kalibre edin.
   2. Numune havuzunu PBS kullanarak yıkayın.
   3. Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan alınan numuneleri ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, optimize edilmiş 10⁷ partikül / mL konsantrasyonla 10^{5-10 9} partikül / mL aralığında bir konsantrasyona seyreltin.
   4. Sıcaklığı 23-30 °C civarında tutarak üç çoğaltma ile 11 konumda kaydedin ve analiz edin.
5. Örneklerin protein içeriklerini coomassie parlak mavi boyama (CBBS) ve batı lekeleme (WB) ile analiz edin.
   1. Adım 7.8'de elde edilen farklı fraksiyonlardan BEV numunelerini ve Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra kalan numuneleri, PBS ve 5 × yükleme tamponu kullanarak 0.5 veya 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, miktar tayini gerekiyorsa, Adım 8.5.2'de her bir kuyucuktan 20 μL (10 μg veya 20 μg) yeterli numune yüklemesi sağlayın. Numuneleri 95 °C'de 10 dakika kaynatın.
   2. Prefabrike poliakrilamid jeli elektroforez tankına monte edin ve numuneleri kuyucuklara aktarın.
   3. Aşağıdaki parametrelerle dikey elektroforez yapın: 50 dakika boyunca 160 V.
   4. Jeli Coomassie parlak mavi solüsyonunda 1 saat boyayın, mavi arka plan aydınlanana kadar deiyonize suda durulayın ve bir kamera ile görüntü yakalayın.
   5. Aşağıdaki parametrelerle diğer jeller için protein lekeleme prosedürleri uygulayın: 20 dakika boyunca 400 mA.
   6. Kurutma membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 (a/h) BSA çözeltisi ile bloke edin.
   7. Membranları TBST tamponunda her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   8. Membranları primer antikorlarla inkübe edin (BEV belirteçleri: LPS, OmpA, LTA; EEV belirteçleri: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Diğer kontaminasyon belirteçleri: Flagellin, Calnexin) 4 ° C'de 8-12 saat.
   9. Membranları TBST tamponunda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   10. Membranları oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin.
   11. Adım 8.5.9'u gerçekleştirin.
   12. Bir kemilüminesans aparatı kullanarak lekelemeyi geliştirin.
   13. Pozitif bir kontrol oluşturmak için PBS/BEV çözeltisini (Adım 6.1.1 ve Adım 6.2.2) Escherichia coli'den elde edilen BEV'lerle değiştirin (ham E. coli-BEV'leri izole etme prosedürü için Malzeme Tablosuna bakın) ve BEV'leri karakterize etmek için yukarıdaki tüm deneyleri gerçekleştirin.
       DURAKLAMA NOKTASI: Fekal BEV'ler için yukarıda açıklanan karakterizasyonun sonuçlarına dayalı olarak FEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımı olarak F6-F8'i belirleyin ve sonraki analizler için bu daraltılmış aralığı kullanın.
6. İki DGC modunun verimliliğini değerlendirmek için geri kazanım oranlarını parçacıklar ve proteinler açısından hesaplayın. Aşağıdaki sonuçlar yüzde olarak sunulmuştur.
   1. Yukarıdan aşağıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
   2. Aşağıdan yukarıya modda parçacıkların geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam parçacıklar/Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonraki parçacıklar.
   3. Yukarıdan aşağıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
   4. Aşağıdan yukarıya modda proteinlerin geri kazanım oranlarını hesaplayın: F6-F8'deki toplam protein içeriği (μg)/Adım 6.2.9'da (μg) tanımlanan UC'den sonraki protein içeriği.
7. UC ve iki DGC modunun geleneksel olarak tanımlanan saflığını değerlendirmek için parçacık/protein oranını hesaplayın ve aşağıdaki sonuçların tümü yüzde olarak sunulmuştur.
   1. Adım 6.2.9'da tanımlanan UC'den sonra parçacık/protein oranı: UC'den sonra partiküller/UC'den sonra protein içeriği (μg).
   2. Yukarıdan aşağıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
   3. Aşağıdan yukarıya modda parçacık/protein oranı: F6-F8'deki toplam parçacık/F6-F8'deki protein içeriği (μg).
8. Fekal BEV saflaştırması ve gelecekteki analizler için en uygun santrifüj modunu (protokolde yukarıdan aşağıya mod seçilmiştir) seçin.

Sonuçlar

BEV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların dağılımını belirleyin
Bakteriyel hücre dışı veziküllerin (BEV'ler) zenginleştirilmiş fraksiyonlarının dağılımını belirlemek için, OD 340 nm'deki absorbans değerlerini ölçmek için boş bir kontrol kuruldu ve her fraksiyonun yoğunluğu ölçümlere ve iyodiksanol yönergelerine göre hesaplandı (Adım 8.1). Tablo 2 , F4 ila F9 fraksiyonlarının, tipik olarak hücre dışı veziküllerle ilişkili aralıkta yoğunluklar sergilediğini gösteren yoğunluk sonuçlarını ...

Tartışma

Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV'ler), bakteriler tarafından salgılanan, çok sayıda protein, lipit, nükleik asit ve diğer biyoaktif molekülleri taşıyan, bakterilerin fonksiyonel etkilerine aracılık etmeye katkıda bulunan lipid-çift katmanlı nanopartiküllerdir²⁰. Bağırsaktan elde edilen BEV'lerin inflamatuar bağırsak hastalığı, Crohn hastalığı ve kolorektal kanser gibi hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ve ayrıca genel metabolizmayı etkilediği ve bozulmuş bilişsel işleve aracılık ettiği do...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%1 (a/h) glutaraldehit (deiyonize suda %2,5 stok çözeltisinden hazırlanır)	ACMEC	AP1126	Adım 8.3.3'te TEM kullanılarak BEV'ler için morfolojik gözlem
%1 (a/h) metilselüloz (deiyonize suda orijinal tozdan hazırlanır)	Sigma-Aldrich	M7027	Adım 8.3.6'da TEM kullanan BEV'ler için morfolojik gözlem
%1,5 (a/h) uranil asetat (deiyonize suda orijinal tozdan hazırlanır)	Polysciences	21447-25	Adım 8.3.5 1000 & mu'da TEM kullanan BEV'ler için morfolojik gözlem
; L, 200 μ L, 10 & mu; L Pipet	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Çözeltiyi
%5 (a/h) sığır serum albümin çözeltisine aktarın (TBST tamponundaki orijinal tozdan hazırlanır)	Fdbio science	FD0030	Adım 8.5.6 5 & kez blokaj için batı buçlamada kullanılır
; yükleme tamponu	Fdbio bilimi	FD006	Adım 8.5.1'de batı lekeleme ve Coomassie parlak mavi lekesinde kullanılır
%75 (h/h) alkol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Yüzey dezenfeksiyonu
96 oyuklu plaka	Rar	A8096	Absorbans değerlerini ölçün
Anti-Kalneks antikoru	Abcam	ab92573	Western blotting (Birincil Antikor)
Anti-CD63 antikoru	Abcam	ab134045	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-CD9 antikoru	Abcam	ab236630	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-Flagellin antikoru	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-İntegrin beta 1 antikoru	Abcam	ab30394	Western blot (Primer Antikor)
Anti-LPS antikoru	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-LTA antikoru	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-OmpA antikoru	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-Syntenin antikoru	Abcam	ab133267	Western blotting (Primer Antikor)
Anti-TSG101 antikoru	Abcam	ab125011	Western blotting (Primer Antikor)
Otoklav	ZEALWAY	GR110DP	Deneyde kullanılan malzemeler ve ortamlar için sterilizasyon
	Mettler Toledo	AL104'ü	ile yüklenen tüp numunesini dengeleyin
	Fdbio science	FD2001	Adım 8.2'de BEV'lerin protein içeriğini ölçün
BioRender		https://app.biorender.com	Şekil 1'de gösterilen BEV'lerin izolasyonu ve saflaştırılmasının şematik iş akışını yapın
Biyogüvenlik kabini	Haier	HR1200- II B2	Dışkı numunesi işleme ile ilgili prosedürleri uygulayın
Santrifüj 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adaptör: 5804774000	BEV'ler için Ön İşlem (Adım 3)
Kemilüminesans Aparatı	BIO-OI	OI600SE-MF	Adım 8.5.12'de sinyal tespiti için western blotlamada kullanılır
Cytation 5	BioTek	F01	Absorbans (Adım 8.1) ve floresan (Şekil 6) değerlerini ölçmek için mikroplaka dedektörü
Dil-labled düşük yoğunluklu lipoprotein	ACMEC	AC12038	Enterferans yapan bileşenlerin dağılımının tanımlanması
Elektroforez ekipmanı	Bio-rad	1658033	Adım 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5'te protein ayırma ve transferi için batı blotlamada kullanılır
Kemilüminesans kiti HRP & nbsp;	Fdbio bilimi	FD8020	sinyal tespiti için batı blotlamada kullanılır
;	Amerikan Tipi Kültür Toplama	ATCC8739	BEV'leri pozitif kontrol olarak izole edin. Protokol: 25 g LB tozunu 1 L deiyonize suda çözün ve otoklavda çözün. 800 &mu'yu aktarın; L korunmuş Escherichia coli ortama. 37 ° C'de yetiştirin; Kuluçka makinesi çalkalayıcısında C. Daha sonra 3.000 > 4 & ° C'de 20 dakika g; C, 12, 000 ve kez; 4 & ° C'de 30 dakika boyunca g; C, süpernatanı 0.22 & mu ile filtreleyin; m membran ve 160.000 & kez ultra hızlı santrifüjleme gerçekleştirin; Escherichia coli'den ham BEV'ler olarak tanımlanan pelet, 1.2 mL PBS'de süspanse edildi (Adım 3, 4).
Falcon tüpleri 50 mL	KIRGEN	KG2811	BEV'ler için Ön İşlem (Adım 3)
Feto Protein Boyama Tamponu	Absci	ab.001.50	Adım 8.5.4'te Coomassie parlak mavi boyama
Filtre kağıdı	Biosharp	BS-TFP-070B	Adım 8.3'te TEM kullanan BEV'ler için morfolojik gözlem (Çözeltinin lekelenmesi
)Formvar/Karbon destekli bakır ızgaralar	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Adım 8.3'te TEM kullanılarak BEV'ler için morfolojik gözlem
HEPES tozu	Meilunbio	MB6078	Yoğunluk gradyanı santrifüjlemesi için farklı konsantrasyonlarda iyodiksanol tamponları hazırlayın
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L)	Fdbio bilimi	FDM007	Western blotting (İkincil Antikor)
HRP AffiniPure Goat Anti-Tavşan IgG (H + L)	Fdbio bilim	FDR007	Batı lekeleme (İkincil Antikor)
Kuluçka çalkalayıcı	Qiangwen	DHZ-L	Yetiştirmek Escherichia coli
Kimmendil ve ticaret; Hassas Görev Mendilleri	Kimtech Science	34155	Ultrasantrifüj tüpünün iç duvarını Adım 4.15'te silin
LB et suyu	Hopebio	HB0128	Escherichia coli 'yi yetiştirin;
Düşük sıcaklıklı dondurucu (-80 ° C; C)	Haier	DW-86L338J	Numuneleri saklayın
Methanol	Alalddin	M116118	Adım 8.5.5'te PVDF membranını aktive etmek için batı blotlamada kullanılır
Mikro tüpler 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Yoğunluk gradyan santrifüjlemeden sonra fraksiyonları geri kazanın
Mikro tüpler 2 mL	KIRGEN	KG2911	Yoğunluk gradyan santrifüjlemeden sonra fraksiyonları geri kazanın
Mikro tüpler 5 mL	BBI	F610888-0001	Yoğunluk gradyan santrifüjlemeden sonra fraksiyonları geri kazanın
Mikroplaka okuyucu ve nbsp;	Termo Balıkçı	Multiskan MK3	mu'da BEV'lerin protein içeriğini ölçün
; m	Merck kırlangıç	SLGP033RB	Filtrasyon sterilizasyonu; Malzeme: polietersülfon, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Yoğunluk gradyan santrifüj çözeltisi (pH ayarı)
Optima & trade; XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Adım 4, 7'de BEV izolasyonu için Ultrasantrifüj
OptiPrep & trade;	Serumwerk Bernburg AG	1893	Yoğunluk gradyanlı santrifüj stok çözeltisi
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Adım 2'de dışkıyı çözün
Fosfat tamponlu salin		Procell PB180327	Adım 2'de dışkıyı çözün
Pipetleyici	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Çözeltiyi aktarın
Plastik pastör pipeti	ABCbio	ABC217003-4	Adım 3.4'te ön işlemede süpernatanı çıkarın
Poliviniliden diflorür (PVDF) membranları	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Adım 8.5.5'te protein transferi için batı lekelemede kullanılır
Prefabrike poliakrilamid jel, 4– % 20 15 Kuyu	ACE	F15420Gel	Adım 8.5.2, 8.5.3'te protein ayrımı için batı lekelemede kullanılır
Birincil antikor seyreltici	Fdbio bilimi	FD0040	Adım 8.5.8'de batı lekelemede kullanılır
Protein merdiveni	Fdbio bilimi	FD0672	Adım 8.5'te batı lekeleme ve Coomassie parlak mavi lekede kullanılır
protein lekeleme çözeltisi	UBIO	UW0500	Step 8.5.5'te protein transferi için western blotlamada kullanılır
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Adım 4'te BEV'lerin izolasyonu için Ultrasantrifüj, 7
Şırınga 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer tamponları amd ön işlemede süpernatanı çıkarın
TBS tozu	Fdbio bilimi	FD1021	Adım 8.5'te batı lekelemede kullanılır
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)	Hitachi	H-7650	Adım 8.3'te BEV'ler için morfolojik gözlem
Ara-20	Fdbio bilimi	FD0020	Adım 8.5'te batı blotlamada kullanılır
Ultrasantrifüj tüpü	Beckman	326823, 355642	Adım 4, 7'de BEV'lerin izolasyonu için Ultrasantrifüjleme
Ultra temiz tezgah	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Sıvı işleme ile ilgili prosedürleri uygulayın
Su banyosu	Bluepard	CU600	Adım 8.2.5'te BEV'lerin protein içeriğini ölçmek için kullanılır
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Yazılım ZetaView (sürüm 8.05.14 SP7)	Adım 8.4'te BEV'lerin partikül boyutunu ve konsantrasyonunu ölçmek için nanopartikül izleme analizi (NTA)