Yöntem makalesi

Bilinçli Farelerde Hiperglisemik Kelepçe ve Hipoglisemik Kelepçe

2.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65581

⸱

26 Ocak 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Bu makalede

Özet

Daha yüksek kan şekeri konsantrasyonu ile insülin salınımını ölçmek için bir hiperglisemik kelepçe kullanılır. Hipoglisemik bir kelepçe, karşı düzenleyici yanıtların neden olduğu glikoz üretimini ölçmek içindir. Her iki yöntemde de aynı cerrahi prosedür kullanılır. Burada, sistemik glukoz metabolizmasını değerlendirmek için bir klemp tekniği sunuyoruz.

Özet

Diabetes mellitus (DM), pankreas β hücrelerinden yetersiz insülin salınımı (Tip1 DM) ve kas, karaciğer ve yağ dokularında insülin duyarlılığı (Tip2 DM) nedeniyle oluşur. İnsülin enjeksiyonu DM hastalarını tedavi eder, ancak yan etki olarak hipoglisemiye yol açar. Kortizol ve katekolaminler, karşı düzenleyici yanıtlar (CRR) adı verilen hipoglisemiyi iyileştirmek için karaciğerden glikoz üretimini aktive etmek için salınır. Kemirgen modelleri kullanılarak yapılan DM araştırmalarında, insülin salınımını ve CRR'yi ölçmek için sırasıyla glukoz tolerans testleri ve 2-deoksi-glukoz enjeksiyonu kullanılmıştır. Bununla birlikte, kan şekeri konsantrasyonları deneyler sırasında sürekli olarak değişir ve bu da net insülin salınımını ve CRR'yi değerlendirmede zorluklara neden olur. Bu makale, insülin ve CRR hormonlarının salınımını karşılaştırmak için bilinçli farelerde sırasıyla kan şekerinin 250 mg/dL veya 50 mg/dL'de tutulduğu bir yöntemi açıklamaktadır.

Polietilen tüp, farelerin karotis arterine ve juguler venine implante edilir ve farelerin ameliyattan sonra iyileşmesine izin verilir. Juguler ven tüpü, sabit ve değişken bir oranda insülin veya glikoz infüzyonunu sağlamak için bir şırınga pompası ile bir Hamilton şırıngasına bağlanır. Karotis arter tüpü kan toplama içindir. Hiperglisemik klemp için damar içine %30 glikoz verilir ve her 5 dakikada bir veya 10 dakikada bir arteriyel kandan kan şekeri seviyeleri ölçülür. Kan şekeri seviyesi 250 mg/dL olana kadar %30 glukoz infüzyon hızı arttırılır. İnsülin konsantrasyonlarını ölçmek için kan alınır. Hipoglisemik klemp için, 10 mU / kg / dak insülin, infüzyon hızı 50 mg / dL kan şekeri seviyesini korumak için değişken olan% 30 glikoz ile birlikte infüze edilir. Hem glikoz infüzyonu hem de kan şekeri sabit bir duruma ulaştığında karşı düzenleyici hormonları ölçmek için kan toplanır. Hem hiperglisemik hem de hipoglisemik klempler aynı cerrahi prosedüre ve deney düzeneklerine sahiptir. Bu nedenle, bu yöntem sistemik glikoz metabolizması araştırmacıları için yararlıdır.

Giriş

Glikoz, hücreler için önemli bir enerji kaynağıdır ve glikoz eksikliği çeşitli semptomlara ve komplikasyonlara yol açabilir. Düşük glikoz durumunda (hipoglisemi, açlık kan şekeri seviyesinde genellikle 70 mg/dL'den az, ancak tek bir değer1 ile belirlenmemelidir), en yaygın semptomlar arasında halsizlik, kafa karışıklığı, terleme ve baş ağrısı bulunur. Ayrıca serebral fonksiyonu bozabilir ve kardiyovasküler olay ve mortalite riskini artırabilir2. Tersine, hiperglisemi, plazma glukoz konsantrasyonunun normal seviyeleri aştığı tıbbi bir durumdur (genellikle açlık kan şekeri seviyesi3'te 126 mg / dL'>). Bu, insülin üretiminde veya kullanımında bir eksiklik olan diyabetli bireylerde ortaya çıkabilir. Hiperglisemi, vücut enerji için glikoz kullanamadığında, bunun yerine yakıt için yağ asitlerini parçaladığında ortaya çıkan diyabetik ketoasidoza yol açabilir. Hiperglisemik hiperosmolar durum da mortaliteyi artırır4. Uzun süreli hiperglisemi kan damarlarına, sinirlere ve organlara zarar vererek kardiyovasküler hastalık, retinopatiler ve böbrek hastalıkları gibi çeşitli kronik komplikasyonların gelişmesine yol açabilir. Bu nedenle, kan şekeri konsantrasyonu 100 mg/dL ile 120 mg/dL arasında dar bir aralıkta tutulmalıdır.

Kan şekeri, tek bölmeli bir modelde glikoz giriş ve çıkışı arasındaki denge tarafından düzenlenir (Şekil 1A). Glikoz girişi, gıdalardan emilen glikozu ve karaciğer, böbrekler ve ince bağırsaktan glikoz üretimini içerir. Glikoz çıkışı, dokularda glikoz alımını ve böbreklerden glikoz atılımını içerir. Hem glikoz giriş hem de çıkış miktarı endokrin hormonları tarafından düzenlenir. Örneğin, karşı düzenleyici hormonlar olarak bilinen glukagon, kortikosteron ve katekolaminler, kan şekeri seviyeleri düştüğündesalınır 5. Glikojenin parçalanmasını ve esas olarak karaciğerden glikoz sentezini uyarır; Bu süreçler sırasıyla glikojenoliz ve glukoneogenez olarak bilinir. Hiperglisemi, pankreas β hücrelerinden insülin salınımını artırır ve kaslarda, yağ dokularında ve kalpte glikoz alımını uyarır 6,7,8,9. Egzersiz, insülinden bağımsız glikoz alımını artırır10. Sempatik sinir sistemi, kaslarda ve kahverengi yağ dokusunda glikoz alımını artırır 6,11. Periferik dokularda glukoz metabolizmasını düzenleme yeteneğini ölçmek için, araştırmacılar tipik olarak glukoz tolerans testini (GTT) ve insülin tolerans testini (ITT) kullanırlar (Şekil 1B, C). GTT'de iki faktör göz önünde bulundurulmalıdır: insülin salınımı ve insülin duyarlılığı (Şekil 1B). Bununla birlikte, 120 dakikalık test sırasında glikoz konsantrasyon eğrisi her farede farklıdır ve bu da farklı miktarlarda hormon salınımını etkileyebilir. ITT'de kan şekeri hem insülin duyarlılığı hem de karşı düzenleyici hormonların salınımı ile düzenlenir. Bu nedenle, kan şekeri seviyelerinin sabit olmadığı durumlarda, GTT ve ITT'de glikoz metabolizmasının, insülin salınımının ve insülin duyarlılığının kesin anlamını belirlemek zordur.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, kan şekerini sabit bir seviyede (veya "kelepçe") tutmak arzu edilir. Hiperglisemik kıskaçta, kan şekeri seviyelerini belirli bir seviyeye yükseltmek için kan dolaşımına glikoz verilir ve daha sonra bir süre bu seviyede tutulur. İnfüzyon glikoz miktarı, sabit bir durumu korumak için her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerinin ölçümlerine göre ayarlanır. Bu teknik, klemplenmiş bir glikoz seviyesinde insülin sekresyonunun parametrelerini anlamak için özellikle yararlıdır. Hipoglisemik kelepçe, insülin infüze ederek düşük kan şekeri seviyelerini korumak için kullanılan bir yöntemdir. Glikoz, belirli bir kan şekeri seviyesini korumak için değişken bir oranda infüze edilir. Fare hipoglisemiden kurtulamazsa, daha fazla glikoz infüze edilmelidir.

Hiperglisemik ve hipoglisemik klemplerin uygulanmasının birçok avantajı olmasına rağmen, cerrahi ve deneysel prosedürler teknik olarak zor kabul edilir. Bu nedenle, az sayıda araştırma grubu bunları yapabilmiştir. Finansal ve işgücü kısıtı olan araştırmacıların bu deneyleri daha düşük bir bütçeyle başlatmaları için bu yöntemleri tanımlamayı amaçladık.

Protokol

Tüm prosedürler Kumamoto Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

NOT: Ağrının giderilmesi için ibuprofen 48 saat içme suyunda (0.11 mg/mL) ve ameliyattan 30 dakika önce buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg i.p.) verildi. Steril koşullar, hayvanlar arasında etilen oksit ile sterilize edilmiş eldivenleri, maskeleri ve otoklavlanmış aletleri içerir. Ameliyat, 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerinde gerçekleştirildi ve her hayvan için yeni bir laboratuvar matı ile kaplandı. Ameliyattan önce ameliyat bölgesi betadin solüsyonu ve alkol ile temizlendi. Tüm cerrahi aletler otoklav ile sterilize edildi (en fazla iki ameliyat için). Kesi yapılmadan önce, fareler tamamen uyuşturulduklarından emin olmak için kontrol edildi. Her fare için anestezi derinliği, ameliyattan önce ve ameliyat sırasında bir ayak parmağı tutamıyla değerlendirildi. İklimlendirme süresi her seferinde 5 dakikadan fazla değildi. İlgili kurumdaki IACUC'nin talimatlarını izleyin.

1. Juguler ven ve karotis arter için tüplerin hazırlanması

  1. Tüm hortumları, polipropilen malzemeleri (örn. pipet uçları) ve sütürleri otoklav veya etilen oksit ile sterilize edin. Şah damarı için 8 cm boru1 ( bkz. Malzemeler) ve 3 cm boru2 yapıştırıcı kullanarak bağlayın (Şekil 2A). Üstüne 2 mm boru1 koyun çünkü boru 2 (polietilen) çok serttir ve kan damarlarına zarar verebilir (Boru1.1).
  2. Glikoz ve insülini infüze etmek için juguler ven (Tubing1.2) için uzatma tüpü
    1. İki adet 30 cm'lik tüp ve bir adet 10 cm'lik tüplü tüp2 hazırlayın (Şekil 2A). 20 μL'lik bir pipet ucunun keskin ucunu (veya hortum 1.1 ile bağlantı kurmak için 0.5 mm OD < dar uçlu herhangi bir şeyi) kesin ve içine üç hortum2 (30 cm, 30 cm ve 10 cm) yerleştirin. Yapışkan yapıştırıcı ile kapatın.
    2. Borunun diğer ucuna 5 cm boru12 yerleştirin.
  3. Karotis arter için (Tubing1.3): Boruyu2 inceltmek için gerin. 8 cm boru1 ve gerilmiş borunun3 cm'sini2 yapıştırıcı kullanarak bağlayın (Şekil 2A). Uçtan 9 mm'lik bir işaret yapın.
  4. Boruyu şırıngaya bağlayan keskin olmayan uçlu iğne: Metal bir törpü ile iğnenin keskin ucuna (23 G) yakın bir yerde çizik yapın, pense ile birkaç kez hafifçe ileri geri bükün ve kırın. Bir parça metal konektör yapmak için iğnenin ortasında aynı kesimi yapın (Şekil 2A).
  5. Arterin kan alması için uzatma tüpü (Boru seti1.4): 10 cm'lik boruyu1 metal konektöre ve adım 1.4'te yapılan keskin olmayan iğneye bağlayın.
    NOT: Tüm borular ve sütürler otoklav veya etilen oksit ile sterilize edilmiştir.

2. Ameliyat

  1. Bir fareyi izofluran (% 1.5-2.0) veya ketamin / ksilazin (ketamin 10 mg / mL,% 0.9 steril salin içinde ksilazin 1 mg / mL, intraperitoneal [ip] enjeksiyonu yoluyla 0.1 mL / 10 g vücut ağırlığı (BW)) ile uyuşturun. Fiziksel stresi azaltmak için fareyi sıcak ped (37 °C) üzerinde tutun. Derin anestezi için 5-10 dakika bekleyin. Anestezi derinliğini pedal refleksi, solunum ve kalp atış hızı ile onaylayın ve ayak parmağını sıkıştırarak uyaranlara yanıt verin. Ameliyat sırasında, anestezinin sürekli solunması için burun kapağını ameliyat masasına sabitlemek için cerrahi bant kullanılmalıdır. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
  2. Heparinize salini (100 U / mL) tüp 1.1 ve 1.3'e doldurun ve bunları keskin olmayan bir iğne ile 1 mL'lik bir şırınga ile bağlayın (Şekil 2B). Borunun ucunu3 ( Malzeme Tablosuna bakın) boru1.1 ve boru1.3 için kapak olarak kullanılacak bir havya ile eriterek kapatın.
  3. Birinci (arkada interskapular) ve ikinci (önde boyun) kesi bölgesini üç döngü% 10 betadin ile tıraş edin ve silin, ardından steril% 70 alkol ile ameliyat öncesi bir hazırlık yapın. Sternuma 5 mm sefalik küçük bir dikey orta hat insizyonu yapın, dokuları künt diseke edin ve arteri ortaya çıkarın. Vagus sinirini arterden ayırın. Bu, vagus sinirinin çıkarılmasının glikoz metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerini azaltır.
    NOT: Ventral kesiden kateterin damar içine yerleştirildiği ve ipek dikişlerle sabitlendiği basamağa kadar olan adım mikroskop altında gerçekleştirilir.
  4. Arterin altına iki ipek dikiş yerleştirin. Bir sütürü kraniyal tarafa (Şekil 2C-1) ve diğerini kaudal tarafa gevşek bir şekilde (Şekil 2C-2) sıkıca bağlayarak kan akışını durdurun, bu da kan akışını durdurmak için yeterlidir, ancak daha sonra tekrar açmak için yeterlidir. Arterin altına bir dikiş daha yerleştirin (Şekil 2C-3).
  5. Şekil 2C-1'in yakınındaki arteri yaylı makasla kesin ve tüp1.3'ü artere yerleştirin. Hem arter hem de hortum üzerinde gevşek bir bağ yapın (Şekil 2C-3, sıkıca bağlamayın. Tüp arterin daha derinlerine yerleştirilecektir). Tüpü 9 mm işareti ortadaki düğüme ulaşana kadar yerleştirmek için kuyruk tarafındaki düğümü açın (Şekil 2C-3). Tüm bağları güvenli bir şekilde bağlayın ve heparinize steril salinle yıkayın.
  6. Sağ juguler veni, juguler kateter için sağ karotis arter ile aynı kesiden ortaya çıkarın. Kraniyal ucu izole edin ve ipek sütür ile bağlayın (Şekil 2D-1, Malzeme Tablosu). Açıkta kalan damarın kaudal ucuna başka bir dikiş parçası yerleştirin (Şekil 2D-2). Şekil 2D-1 işaretinin yakınındaki damarı yaylı makasla kesin.
  7. Kateteri yerleştirin (damarların nüfuz etmesini önlemek için çok derin değil), bağlayın ve kan örneği aldığını görsel olarak onaylayın. Heparinize steril salin (0.2 mL) ile yıkayın ve kateterde kan kalmadığını görsel olarak doğrulayın.
  8. İlk yaradan enfeksiyon oluşmasını önlemek için fareyi yeni steril cerrahi örtünün üzerine yerleştirin. Fareyi ters çevirin, üç döngü betadin ile silin, ardından steril alkolle ameliyat öncesi bir hazırlık yapın ve kürek kemikleri arasında küçük bir kesi yapın.
  9. Sırttaki kesiden ventral tarafa kadar derinin altına bir iğne tutucu geçirin. Kateterleri iğne tutucu ile sıkıştırın, derinin altından geçirin ve geri getirin. Kesi bölgesini temizleyin ve ventral insizyonları sentetik bir sütürle (çap 0.15-0.2 mm) kapatın. Venöz kateteri omuz bıçakları arasındaki insizyon bölgesinde mikro serrefine ile sıkıştırın.
  10. Kateteri kelepçenin 1 cm yukarısından kesin, heparinize salinle yıkayın ve bir kapakla kapatın (adım 2.4). Arteriyel kateter için aynı prosedürü izleyin. Dorsal insizyonu sentetik bir sütürle kapatın (çap 0.15-0.2 mm).
  11. Fareyi sıcak, temiz bir kafese yerleştirin (Şekil 2E). Ameliyat sonrası bakımı günlük olarak gerçekleştirin.

3. Kurtarma

  1. Fareyi tek başına barındırın, çünkü başka bir fare grup konutundaki kateteri ısırabilir.
    1. Sosyal izolasyon yoluyla stresi azaltmak için, fareleri çevresel zenginleştirmelerle (örneğin barınaklar) tutun. Ameliyat sonrası bakımı günlük olarak gerçekleştirin. Ağrıyı, sıkıntıyı ve rahatsızlığı gidermek için analjezi (içme suyunda ibuprofen (0.11 mg / mL) dahil olmak üzere ameliyat sonrası bakım sağlayın.
    2. Kesi bölgesinde iltihaplanma, uyuşukluk veya ağrı gibi enfeksiyon belirtileri için fareleri gözlemleyin. Sağlıklı farelerin çoğu ameliyattan yaklaşık 2 saat sonra yürümeye ve beslenmeye başlar. Kambur bir duruş, fırfırlı kürk ve azalmış yiyecek alımı ağrıya işaret edebilir. Bu belirtiler gözlenirse, fareleri derin anestezi veya karbondioksit boğulması altında keserek hemen ötenazi yapın.
  2. Kan, arterdeki katetere girecek ve bir pıhtı oluşturacaktır. Kateter hatlarını korumak için, 3-6 adımlarını izleyerek pıhtıyı günlük olarak çıkarın.
  3. 1 mL'lik bir şırınga ve 23 G iğneyi (keskin olmayan uç) heparinize salin (100 U / mL) ile doldurun. Bir indüksiyon odası kullanarak, fareyi izofluran (% 1.0 -% 1.5) ile hafifçe uyuşturun. Ardından, fareyi odadan çıkarın ve bir burun başlığı ile izofluran anestezisi altında pıhtı çıkarma işlemini gerçekleştirin.
  4. Farenin arkasındaki arter borusunu mikro serrefine ile sıkıştırın, kapağı çıkarın ve kanı ve pıhtıları çıkarın. Kateteri 23 G iğneli (keskin olmayan uçlu) başka bir 1 mL şırınga kullanarak heparinize salinle yıkayın ve tekrar kapatın. Şiddetli pıhtılaşma durumunda venöz hattı arteryel hat gibi temizleyin.
  5. Kateteri 3-5 gün boyunca günde bir kez temizlemek için aynı işlemi yapın.
  6. Farenin vücut ağırlığını kontrol edin. Vücut ağırlığı ameliyat gününden itibaren %10'dan fazla azalırsa, destekleyici bakım uygulayın ve normal vücut kondisyon skorunu iyileştirmeye çalışın ve fareyi başka bir deney için kullanın.
    NOT: Bu çalışmadaki deneylerde hayvanların kilo kaybı %10'dan azdı. Kilo kaybı, sistemik glikoz metabolizmasını güçlü bir şekilde etkileyecektir. Bu nedenle, vücut ağırlığının geri kazanılmasını beklemeniz veya kelepçe deneyinden çıkarmanız önerilir.

4. Pompa sistemini kurun (hipoglisemik kelepçe için)

  1. % 0.1 BSA salin,% 30 salin ve heparinize salin içinde 1 U / mL insülin hazırlayın.
  2. Farenin vücut ağırlığını ölçün. İnsülinin infüzyonunu yapmak için 1 U / mL insülin hacmini hesaplayın (10 mU / kg / dak). Kelepçe deneyinde farelere 1.7 μL/dk insülin çözeltisi infüze edin. 300 μL insülin infüzyonu yapmak için 1 U/mL insülin (μL) için gerekli hacim 2.647 (μL/g) x Vücut ağırlığıdır (g). 1 farede kelepçe deneyini bitirmek için 300 μL insülin infüzyonu hacmi yeterlidir. Tablo 1 , insülin infüzyonu yapmanın bir örneğini göstermektedir.
  3. Her Hamilton şırıngasına insülin infüzyonu ve %30 glikoz doldurun, bunları 1.2 tüpüne bağlayın ve şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin (Şekil 3A). Her çözeltiyi tüpe doldurun 1.2. 1 mL'lik bir şırınga ve boru setine 1.4 salin doldurun (Şekil 2A).
  4. Fareyi izofluran (%1.0-%1.5) ile uyuşturun ve tüpü bağlayın1.2 venöz katetere ve tüp seti1.4 arteriyel katetere (Şekil 3A). Tüpleri bir arada tutmak için selofan bant kullanın.
  5. Fareyi 500 mL'lik boş bir behere yerleştirin.
    NOT: Hiperglisemik klemp için 1 U/mL insülin yerine salin kullanın.

5. Hipoglisemik kelepçe

  1. Şekil 3B'de gösterildiği gibi her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerini ölçün ve -15 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 40 dakika, 60 dakika, 80 dakika, 100 dakika ve 120 dakikada hormon ölçümleri için kan örnekleri toplayın. Kan şekerini ölçmek için adım 5.2'yi izleyin.
    NOT: Kan şekerini her zaman noktasında ölçmek gerekli değildir, ancak en az 10 dakikada bir ölçülmesi önerilir. Kan şekerini, seviyesi ve glikoz infüzyon hızı sabit olmadığında her 5 dakikada bir ölçün.
  2. Boru setinin üst ucunu kelepçeleyin1.4 ve yeni bir şırınga bağlayın, 50 μL kan alın ve yıkama için 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Kan şekeri seviyesini ölçün.
    NOT: Bu, önceki örneklemeden sonra kateter yıkama nedeniyle tüpteki salin solüsyonu ile seyreltilen kandır. Seyreltilmiş kanı saf kanla değiştirmek için 50 μL'lik bir hacim yeterlidir.
  3. Seyreltilmiş kanı (kırmızı kan hücreleri) saklayın. Biriken kanı (~500 μL) salinle yıkayın (bkz. adım 5.11-5.12) ve hipoksiyi önlemek için vücuda geri dönün.
  4. Kateter, yüksek tansiyon ile artere bağlanır, bu nedenle kelepçe gevşetildiğinde kan dışarı akar ve kullanışlı bir glikoz ölçer ile glikozu ölçmek için kullanılır. Yeterli miktarda kan sıvısını tutmak için 50 μL salin infüzyonu yapın.
  5. Kan örneklemesi için, 50 μL daha kan alın ve buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. 100 μL (50 μL değiştirme + 50 μL örnekleme) salin demleyin.
  6. 0 dakikalık kan şekeri ölçümünden sonra insülin şırınga pompasını çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika (5.1 μL / dak) boyunca bolus içinde 30 mU / kg / dak, daha sonra sürenin geri kalanında 10 mU / kg / dak (1.7 μL / dak) infüzyon demleyin.
  7. Kan şekeri seviyesini ölçün ve glikoz infüzyon hızını 120 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir değiştirin.
  8. Glikoz infüzyon hızının değişmediği ve kan şekeri seviyesinin 50 mg / dL olduğu kararlı bir durum oluşturun.
  9. Kan örneğini t = 120 dakikada topladıktan sonra, juguler damara bir ötenazi ajanı aşılayın ve RNA veya protein analizi için dokuları toplayın.
  10. Kanı 5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin ve üreticinin protokolüne göre bir ELISA kiti kullanarak insülin veya c-peptid gibi hormon konsantrasyonunu ölçün.
  11. Kanı yıkamak için, kanı 3 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın, 500 μL heparinize salin ekleyin ve pipetleme yapın.
  12. Yıkamayı tekrarlayın ve yıkanmış kırmızı kan hücrelerini arter için 1 mL şırıngaya yerleştirin. Adım 5.2 ve 5.3'te 50 veya 100 μL salin infüze edildiğinde kan hücreleri otomatik olarak yeniden infüze edilecektir. Hipoksiyi önlemek için hematokritleri dikkatlice izleyin.
    NOT: Kan şekeri ölçümü için ticari bir kullanışlı glikoz ölçüm cihazı kullanılmıştır.

6. Hiperglisemik kelepçe

  1. Adımları hipoglisemik klemp tekniği olarak izleyin, ancak insülin infüzyonu olmadan ve kan şekeri 250-300 mg / dL'ye ayarlanmış. Şekil 3B'de gösterildiği gibi her 5-10 dakikada bir kan şekeri seviyelerini ölçün ve -15 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 40 dakika, 60 dakika, 80 dakika, 100 dakika ve 120 dakikada hormon ölçümleri için kan örnekleri toplayın.
  2. Boru setine yeni bir şırınga bağlayın1.4, 50 μL kan alın ve yıkama için 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. Kan örneklemesi için, 50 μL daha kan alın ve buz üzerinde 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. 100 μL (50 μL değiştirme + 50 μL örnekleme) salin demleyin.
  4. 0 dakikalık kan şekeri ölçümünden sonra, glikoz şırınga pompasını çalıştırın. İlk olarak, 2 dakika (5.1 μL / dak) boyunca bolus içinde 30 g / kg / dak, ardından sürenin geri kalanında 10 g / kg / dak (1.7 μL / dak) demleyin.
  5. Kan şekeri seviyesini ölçün ve glikoz infüzyon hızını 120 dakika boyunca her 5-10 dakikada bir değiştirin. Glikoz infüzyon hızının değişmediği ve kan şekeri seviyesinin 250-300 mg / dL olduğu, kenetlenmiş bir hiperglisemik durum olan kararlı bir durum oluşturun.

Sonuçlar

Hipoglisemik klemp çalışması, deneyin başlangıcında 3 saat aç kalan erkek C57BL / 6N farelerinde (8 haftalık, 25 g BW'den fazla) gerçekleştirildi (Şekil 4A, B). Başlangıç kan şekeri düzeyi 136 mg/dL (t = -15 dk) idi. 90 mg/dL'den azsa, bunun nedeni ameliyatın iyi gitmemesi veya arteriyel kateterin çok derine yerleştirilmesi veya kan pıhtılarının kan akışına girmesi olabilir. Ameliyat sonrası fare durumu, faredeki enerji metabolizmasını etkiler. Fizyolojik glukoz metabolizması kötü sağlık koşulları altında ölçülemez. C57BL ameliyattan sonra pıhtılaşmaya daha yatkındır; FVB veya ICR fareleri gibi daha yüksek vücut ağırlığına sahip farelerin ameliyat sonrası pıhtı yıkama nedeniyle kilo verme olasılığı daha düşüktür. Bu nedenle, yeni başlayanlar için kelepçe prosedürlerini uygulamak için FVB fareleri kullanmak daha iyidir. C57BL fareler daha yoğun bakım gerektirir. Atardamar içine 9 mm'lik kateter takılması, FVB ve ICR farelerinde bile kan toplamada bize herhangi bir sıkıntı yaşatmadı. İnsülin t=0 dk'da başlandı ve kan glukoz düzeyleri düştü (Şekil 4A). GIR, t = 0 dk ile t = 70 dk arasında stabil değildi. Daha sonra, 80 dakika sonra sabit bir duruma geldi.

Hiperglisemik klemp çalışması, deneyin başlangıcında 3 saat aç kalan erkek C57BL / 6N farelerinde (8 haftalık, 25 g BW'den fazla) da gerçekleştirildi (Şekil 4C, D). Kan şekeri ölçüldükten ve t = -15 ve t = -5 dk'da kan örnekleri alındıktan sonra, t = 0 dk'dan glukoz infüze edildi. Kan glukoz düzeyi t = 40 dk'da 250 mg/dL oldu. Kararlı durum t = 30 dakikadan sonuna kadar devam etti.

figure-results-1
Şekil 1: Kan şekeri seviyelerinin düzenlenmesi. (A) Vücuttaki kan şekerinin düzenlenmesini gösteren kavramsal diyagram. (B,C) (B) glukoz tolerans testi (GTT) ve (C) insülin tolerans testinde (ITT) glukoz metabolizmasının düzenlenmesi. Kan şekeri seviyelerini düzenleyen çeşitli faktörler vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Tüplerin hazırlanması ve ameliyatın adımları. (A) Karotis arter ve juguler ven için tüplerin görüntüleri. Boru numaraları, protokol adım numaralarıyla eşleşir. (B) Tüpleri ameliyat için hazırlama yöntemi. (C, D) Kateteri (C) arter ve (D) venine yerleştirmek için ipek ipliklerin bağlandığı numaralandırılmış pozisyonlar. İpek ipliklerin kraniyal (C-(1)) ve arterin kaudal tarafındaki (C-(2)) ve bunların ortasında bir tane daha (C-(3)) pozisyonları (prosedür 2-4). İpek ipliklerin kraniyal (D-(1)) ve damarın kaudal tarafındaki (D-(2)) ve bunların ortasında bir tane daha (D-(3)) pozisyonları (prosedür 2-6). (E) Arkadan çıkan arteriyel ve venöz kanüllerin şeması Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kelepçenin ayarlanması. (A) Boruların, pompaların, şırıngaların ve farenin kurulumunu gösteren şema. (B) Kan şekeri seviyelerini ve glikoz infüzyon hızını kaydetmek için sayfa. t = -15 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 40 dakika, 60 dakika, 80 dakika, 100 dakika ve 120 dakikada 50 μL kan toplanır. İnsülin infüzyon hızı t = 0 ila 2 dakika arasında 5.1 μL / dak idi ve t = 2 dakikada 1.7 olarak değiştirildi. Kan şekeri seviyesi her 10 dakikada bir ölçüldü. Kan şekeri, seviyesi stabil olmadığında her 5 dakikada bir ölçüldü. Kan şekeri her ölçüldüğünde glikoz infüzyon hızı değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Hipoglisemik klemp ve hiperglisemik klempin temsili sonuçları. (A) Kan şekeri seviyeleri ve (B) hipoglisemik klempin glikoz infüzyon hızı. (C) Kan şekeri seviyeleri ve (D) hiperglisemik klempin glikoz infüzyon hızı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ÇözümHesaplama20 g fare için
1 U/mL insülin(2.647 x vücut ağırlığı) μL52,9 μL
% 0.1 BSA salin300 μL - insülin hacmi (μL)247,1 μL

Tablo 1: İnsülin infüzyonu hazırlamak için örnek bir hesaplama.

Tartışma

Burada açıklanan yöntem, pipet uçları, şırıngalar ve sıradan laboratuvarlarda bulunan diğer öğelerle yapılabilecek basit bir yöntemdir. Araştırmacıların ek tüpler ve pompalar satın almaları gerekebilse de, pahalı ekipmanlara gerek yoktur. Bu nedenle, bu kateterizasyon ve klemp protokolünün başlatılması önceki raporlaragöre daha kolaydır 12,13,14.

Kelepçe tekniği 1970 civarında geliştirildi ve farelerde ve insanlardakullanıldı 15. Glikoz metabolizmasını doğru bir şekilde ölçmek için yararlı bir yöntemdir ve altın standart olduğu söylenir. Ancak birçok araştırmacı tarafından kullanılan yaygın bir teknik değildir. Hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe tekniği farelerde13 ve sıçanlarda14 bildirilmiştir, ancak buradaki kateterizasyon yöntemi farklıdır ve okuyucular deneyleri için daha kolay olanı seçebilirler. Bu makalenin amaçlarından biri, bir deneye başlamanın önündeki engeli azaltmaktır. Bu nedenle, el yapımı kateterlerin malzemeleri, cerrahi prosedürler ve deneysel zaman kursu örneği hakkında ayrıntılı bilgi verdik. Bunlar ilk kez klemp yapmaya çalışan araştırmacı için bilgilendiricidir.

Obezite ve diyabette insülin salgılanması evreye bağlıdır. Birçok rapor, insüline dirençli durumda kan şekerini azaltmak için obezitede insülin sekresyonununarttığını göstermektedir 16, ancak Tip 2 DM'de β hücre fonksiyonu zarar görecektir17,18. Aslında, pankreas adacıklarının ve insülin sekresyonunun sayısının ve alanının, yüksek yağlı bir diyetlebeslenen fareler 19 veya leptin eksikliği olan fareler20 gibi obezite fare modellerinde arttığı bildirilmiştir. Belirgin bir fenotipe sahip olan bu fare modellerinde, GTT'de glikoz uygulamasından 15-30 dakika sonra kan insülin seviyeleri incelenerek farklılıklar belirlenebilir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, insülin sekresyonundaki farklılıkları belirlemek kolay değildir. Örneğin, transgenik (Tg) farelerin kan şekeri seviyesi 500 mg / dL iken, bir WT faresi 300 mg / dL'ye sahipse ve her iki fare de aynı kan insülin seviyesine sahipse, Tg'de insülin sekresyonunun azaldığını söyleyebilir miyiz? Bu durumda, burada tanıtılan yöntemi kullanarak kan şekeri seviyeleri aynı olmadıkça insülin salgılama yeteneğini karşılaştıramayız. Bu, obeziteden diyabete geçişte β hücre fonksiyonunun ne zaman bozulmaya başladığına dair yerleşik bir teorinin olmamasının nedenlerinden biridir. İnsülin sekresyonunu pankreas21 veya ex vivo22'nin primer kültürü ile de ölçebiliriz. Bununla birlikte, vagus sinirinin innervasyonu ortadan kalkacağı için merkezi sinir sisteminin insülin salınımı üzerindeki etkisini bozacaktır. Emme sonrası insülin sekresyonu iyi bilinmektedir, ancak beyin ve otonom sinir sistemi de insülin salınımını düzenler23. İkincisini analiz etmek için yapılan deney, uyuşturulmamış, sınırsız, ağrısız bir kan alımında yapılmalıdır. Bu nedenle vagus siniri adım 2.3'te karotis arterden ayrılmalıdır.

Diabetes mellitus'un insülin direnci ve glukagon24 ve diğer karşı düzenleyici hormonların25 artan salgıları nedeniyle hiperglisemiye neden olduğu bildirilmiştir. Ek olarak, insülin dozajının başarısızlığı veya diğer nedenlerden dolayı diyabetli insanlarda tekrarlanan hipoglisemi atakları, hastaların hipoglisemiye yatkın olduğu tekrarlayan hipoglisemi adı verilen bir duruma yol açabilir26. Hipoglisemik klempte glisemideki düşüş hızının hipogliseminin periferik veya santral tespitini etkilediği ileri sürülmüştür27. Yavaş başlangıçlı hipoglisemi, portal-mezenterik venlerde glukoz sensörlerinin rolünü incelemek için uygun olabilirken, kan glukozunda çok hızlı bir düşüş, beyin glukoz sensörlerinin incelenmesi için olabilir27. Yağsız C57BL farelerde 1 U/mL İnsülin kullanılır. Ancak, obez farelerde insülin direncine sahip oldukları için daha yüksek bir insülin konsantrasyonuna ihtiyaç duyulacaktır ve 1 U / mL kan şekeri seviyelerini düşürmek için yeterli değildir.

Kan şekeri havuzunun tek bölmeli modelinde (Şekil 1A), emilen glikoz miktarı, glikoz giriş hızınıetkileyebilir 14. Bu nedenle, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçeyi ölçmenin temel amaçlarından biri olan glikoz üretim hızı, açlık süresinden etkilenebilir. Bununla birlikte, uzun açlık süresi, karşı düzenleyici hormonların salınımını artırabilir. Bu nedenle, araştırmacılar oruç süresini analiz amaçlarına göre belirlerler. Başka bir kelepçe yöntemi, kuyruktan kan örneklemesini içerir, bu basittir çünkü sadece intravenöz bir kanülün yerleştirilmesi gerekir14. Bununla birlikte, kan, orta derecede kısıtlama stresine ve plazma katekolaminlerinde ve diğer stres hormonlarında artışa neden olan bir kısıtlamada toplanır14. Ek olarak, ekstremitelerdeki kandan ziyade vücudun merkezindeki kan akışındaki hormon konsantrasyonlarının ölçülmesi tercih edilir. Bu nedenle, serbest hareket eden farelerde arterlerden kan örneklemesi, glikoz metabolizmasını fizyolojik olarak ölçmek için en iyisidir. Fareler hareket etmez ve deney ortamına alıştıklarında dönmeye gerek yoktur. Bununla birlikte, infüzyon ve örnekleme hatlarının dolaşmasını önlemek için bir döner kullanılması önerilir. Boru1.2 ve boru seti1.4 (Şekil 3A) döner kullanmak için iyi değildir. Araştırmacının bir fırdöndü kullanması gerekiyorsa sistem geliştirilmelidir. Kan hücrelerinin reinfüzyonu, kan şekeri ve insülinin yerleşik sabit durumunu etkilemez. Mevcut yöntem, izotopları kullanan metabolomik çalışmalara da uygulanabilir. Örneğin, damar içine sürekli olarak 13C-glukoz verilirse, sistemik metabolik devir hızı ve hücre içi ara metabolitler ölçülebilir28. Bu nedenle, bu glikoz metabolizmasını analiz etmek için yararlı bir yöntemdir.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Mükemmel Genç Araştırmacılar için Lider Girişim (MEXT'ten) tarafından desteklenmiştir; Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (B) (Hibe Numarası JP21H02352); Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED-RPIME, Hibe Numarası JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h999901); Uehara Memorial Vakfı; Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı; Suzuken Memorial Vakfı, Akiyama Yaşam Bilimleri Vakfı ve Narishige Sinirbilim Araştırma Vakfı. Ayrıca, bu makalenin bir taslağını düzenlediği için Dr. Nur Farehan Asgar'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yapıştırıcı tutkalHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA kiti (C-peptid)Morinaga Bilogical Science IncEnstitüsü M1304Fare C-peptid ELISA
Kiti ELISA kiti (insülin)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Fare İnsülini ELISA Kiti (U-tipi)
Kullanışlı glikoz ölçüm cihazıNipro Co.11-777Serbest Stil Freedom Lite
İnsülin (100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
FareJaponya SLC Inc.C57BL / 6NCrSlcC57BL
SütürNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Sterilize
Şırınga Pompası PompaSistemleri A.Ş.NE-1000
Sentetik sütürVÖ MELHR-17
Boru1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Silikon Tüp
Boru2Fisher Scientific427400BD Intramedic PE Boru
Borusu3IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.boyutu5Polietilen boru boyutu5

Kaynaklar

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330(2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141(2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188(2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432(2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109(2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068(2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183(2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728(2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709(2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699(2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kan Glikoz Reg lasyonuns lin Duyarl lKar D zenleyici Yan tlarGlikoz nf zyonuJuguler Ven KateteriKarotis Arter KateteriGlikoz Metabolizmas
Bilinçli Farelerde Hiperglisemik Kelepçe ve Hipoglisemik Kelepçe
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.