Yöntem makalesi

Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65590

⸱

23 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

Bu makalede

Özet

Burada sunulan, alıkonma sürelerini, hareketliliklerini ve parçalanmalarını kullanarak kararlı izotop etiketleme yoluyla lipid yapılarını taramak için bir yöntemdir.

Özet

Lipitler oldukça çeşitlidir ve lipit yapılarındaki ve bileşimindeki küçük değişikliklerin kritik biyolojik işlevler üzerinde derin etkileri olabilir. Kararlı izotop etiketleme (SIL), lipid dağılımı, mobilizasyonu ve metabolizmasının yanı sıra de novo lipid sentezi çalışmaları için çeşitli avantajlar sunar. SIL tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, endojen moleküllerden kaynaklanan girişimlerin giderilmesini gerektirir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden SIL lipidlerinin taranması için yüksek verimli bir analitik protokol tanımlanmıştır; Sivrisinek yumurtalık gelişimi sırasında lipid de novo tanımlama örnekleri gösterilecektir. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi tuzaklı iyon hareketlilik spektrometrisi ve kütle spektrometresinin kullanılması, tek bir numuneden tek bir taramada (<1 saat) ayırma ve lipit atamasına izin verir. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikimi ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışmayı kullanarak, veriye bağımlı edinim ve veriden bağımsız edinimdeki son gelişmelerden yararlanır. Yağ asidi zinciri düzeyinde SIL ölçümü, sivrisineklerin yumurtalık gelişimi sırasında lipit dinamiklerindeki değişiklikleri ortaya koymaktadır. Lipitler de novo yapıları, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Giriş

Lipid verilerini analiz ederken, kararlı izotop etiketleme (SIL), canlı organizmalardaki metabolik yolları değerlendirmek için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir analit içindeki atomlar, 13C veya 2H içeren kararlı izotoplarla değiştirilir. Bu izotoplar ayrıca, daha sonra yağ asitlerinin içine gömülen ve bulundukları alanları etiketleyen öncülere dahil edilir. Bu izotoplarla, etiketlenmemiş arka plan1 ile kontrast oluşturacakları için lipitlerin dağılımını ve metabolizmasını tanımlayabilirsiniz. Ortak kütle spektrometresi platformları, endojen moleküllerden gelen sinyali ayırt edemez2. SIL'in başarısı, ultra yüksek çözünürlüklü analitik araçların kullanılmasını gerektirir. Yüksek çözünürlüklü tuzaklanmış iyon hareketlilik spektrometrisi-paralel birikim sıralı parçalanma-uçuş zamanı tandem kütle spektrometrisi (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, etiketli ve etiketsiz türlerin ayrılmasına izin verir2. LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analizinin avantajı, MS sinyalinin alıkonma süresi (RT) ve hareketlilik ile filtrelenebilmesi, böylece endojen moleküllerin potansiyel girişimlerinin azaltılmasının yanı sıra istenen tüm türlerin nicelleştirilmesi ve ayrılmasıdır2. TIMS'de, bir iyon önce bir gaz-mobil faza karşı sabit tutulur ve daha sonra hareketliliğine göre serbest bırakılır. Bu, önceki IMS enstrümantasyonundan daha düşük bir voltajda çalışırken yüksek çözünürlüklü mobilogramlar sağlar3. Mobilogramlar, sürüklenme sürelerine ve örtüşme miktarına göre bileşikleri ayırt etmek için kullanılabilen, sürüklenme süresine karşı yüklenecek kütle grafikleridir4.

Ek bir PASEF tekniği kullanılarak, hassasiyetten ödün vermeden dizileme hızı büyük ölçüde artırılır5. PASEF teorisi, iyonların birikimini ve ardından hareketlilik sırasına göre sıralı salınımlarını içerir. Bu, iyonların hareketliliklerine paralel hizada birikmesiyle yapılır. Bu şekilde birikme iyon kaybını önler. Ayrıca, öncü iyon seçimi, iyonların birikmesi ve salınması ile eş zamanlı olarak gerçekleşir. Bu yöntemle PASEF, PASEF kullanmayan bir TIMS cihazının tipik özelliği olan tarama başına tek tek öncüler yerine, her TIMS taraması sırasında seri olarak birden fazla öncül seçer. Öncü iyonlar, çerçeve başına yaklaşık 2 ms'lik bir TIMS taraması içinde 100 ms'lik zirvelerde eşzamanlı olarak biriktirildiğinde ve serbest bırakıldığında, sinyal bir büyüklük sırasının üzerinde yükseltilir, bu nedenle sinyal-gürültü oranı3 artar. TIMS'e PASEF ilavesi, MS/MS'nin verimliliğini artırır. TIMS-PASEF, MS/MS ile birleştirildiği için daha verimli bir parçalanma mümkündür. Konvansiyonel MS/MS tespitinden farklı olarak, öncü sinyal TIMS-PASEF'ten sıkıştırılır ve parça iyonları, öncü3'ün TIMS elüsyon süresi ve iyon hareketliliği konumu ile aynı anda tespit edilir.

Bir kütle spektrometresinden veri alırken, istenen tarama modunda seçenekler vardır. Veriye bağlı edinim (DDA), MS1 taramasından öncü iyonları parçalamadan ve MS2 taramasını gerçekleştirmeden önce bolluklarına göre seçer. Bu tarama modu, mümkün olduğu kadar çok öncüyü parçalar. DDA yaklaşımı hedeflenmiştir ve sonuçlar iyon seçiminebağlı olacaktır 3. Bununla birlikte, DDA-PASEF genellikle replikasyonlar arasındaki tekrarlanabilirlik konusunda problemler yaşar. DDA, odaklanmış bir analizde harika bir araç olsa da, karmaşık karışımlar veri toplamada daha fazla zorluk çeker6. Bunun nedeni, aynı anda yalnızca küçük bir miktarda iyonun izlenebilmesidir3. Veriden bağımsız edinim (DIA), önceden seçilmiş m/z pencerelerinin yoğunluklarından bağımsız olarak parçalandığı ve tümünün7 aralığında tarandığı bir yöntemdir. Bu tarama modu ile, tüm iyon bulutları IMS'den kütle spektrometresi3'e iletilir. Proteomik çalışmalarda bu, DDA'ya kıyasla daha kısa bir zaman diliminde daha fazla miktarda proteinin ölçülmesine neden olur. Ek olarak, DIA, DDA'ya kıyasla daha az m/z değerini kaçırır. Bu nedenle, bu alternatif, sinyal-gürültü oranında veri tekrarlanabilirliğinde büyük gelişmeler ve DDA'dan daha iyi niceleme göstermiştir. Bu çalışmada amacımız, Tose ve ark.2 tarafından bildirilen yönteme DİA uygulamaktır. DDA ve DIA ediniminden yararlanarak biyolojik örneklerde SIL lipidlerinin mobilizasyonu, dağılımı ve metabolizması hakkında daha fazla ve daha kesin bilgi sağlayarak sinyallerin tekrarlanabilirliğini ve yoğunluğunu iyileştirdik.

Protokol

1. Numune hazırlama

  1. Böcek diseksiyonu
    1. Aedes aegypti sivrisinek yumurtalıklarını 7 günlükken mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisinde inceleyin.
    2. Mikroiğneler kullanarak fosfat tamponlu salin solüsyonundan sekiz yumurtalık toplayın ve -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
    3. Biyolojik kopyalarda yumurtalıkları toplayın.
  2. Lipid ekstraksiyonu
    1. Toplanan sekiz yumurtalığa 1 ppm'lik bir konsantrasyonda 10 μL iç standart (ISTD) ekleyin. ISTD, yedi döteryumlu 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin-D7 (15:15) içeren etiketli bir lipit karışımıdır. 0-18:1 (D7) PC), lizofosfatidilkolin-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol-D7 (18:1 MAG (D7)), kolesteril oleat-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).
    2. Oda sıcaklığında kuruyana kadar bekleyin. 100 μL bütanol/metanol ve 3 μL bütillenmiş hidroksitoluen ekleyin. 1,5 mL polipropilen tokmak ile 10 saniye boyunca manuel olarak homojenize edin.
    3. Havaneli 200 μL bütanol/metanol ile durulayın ve homojenize çözelti ile birleştirin.
    4. Mikrosantrifüj tüpünü oda sıcaklığında ve orta güçte 30 dakika boyunca sonikasyon.
    5. Tüpleri 20 °C'de 10 dakika boyunca 1600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 300 μL silanize cam ekler ile otomatik numune alma cihazına aktarın.

2. Enstrüman kurulumu

  1. Mobil fazın hazırlanması
    1. İlgili oran olarak asetonitril, su ve izopropanol kullanarak 30:40:30 (mobil faz A) ve 10:5:85 (mobil faz B) bileşimine sahip mobil fazı hazırlayın. Her iki mobil fazda da, bir tampon koşulu oluşturmak için suya 10 mmol/L amonyum format ve %0.1 formik asit ekleyin.
    2. 10 mL suda 3.15 g amonyum formatı tartın. Bu çözeltinin 500 μL'sini 12.5 mL suya ekleyin. Sırayla, 250 mL'lik hacimsel bir şişeye koyun ve şişenin yaklaşık 2 / 3'üne kadar izopropanol ile doldurun. Döndürerek karıştırın.
    3. 250 μL formik asit (% 85) ekleyin, 250 mL'lik doldurma hattına 25 mL asetonitril ve izopropanol ile doldurun ve karıştırın.
  2. MS sisteminde, MS ayarlarında ekranın sol tarafında, minimum tarama ayarı olarak 50'yi ve maksimum tarama ayarı olarak 1850'yi seçerek kütle aralığını belirleyin.
    1. Pozitif iyon modu olarak Polarite'yi seçin. Tarama modunu DIA-PASEF olarak seçin. Bunu yapmak için, aşağıdaki LC parametreleriyle önceki bir DDA yönteminden Analiz yöntemini ayarlayın ve açın'ı seçin.
      1. Degrade ayrımı için:
        Numune enjeksiyonu:% 0 B, tutma süresi 1 dak.
        %55 B'ye yükseltin, 6.4 dakikaya kadar basılı tutun.
        %65 B'ye yükseltin, 24 dakikaya kadar basılı tutun.
        %88 B'ye yükseltin, 40,8 dakikaya kadar basılı tutun.
        %95 B'ye yükseltin, 48,1 dakikaya kadar basılı tutun.
        % 35 B'ye düşürün, 56 dakikaya kadar basılı tutun.
        % 0 B'ye düşürün, 60 dakikaya kadar basılı tutun.
      2. HPLC koşulları için:
        Enjeksiyon hacmi: 5 μL
        Çözücü oranı: 0,25 mL/dak
        Toplam çalışma süresi: 60 dakika, bunun 5 dakikası sütunu ön koşullandırmak içindir.
      3. Kolonu sıvı kromatografına yerleştirerek sıvı kromatografını hazırlayın. Sütunu temizlemek ve sızıntı olup olmadığını test etmek için bir boşluk çalıştırın. Bu, cihazın basınç veya akış tutmamasında görülebilir.
  3. Yeni bir yöntem oluşturmak için aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin (Şekil 1 ve Şekil 2).
    1. Yazılımı açın ve Tüm enstrümanları bağla'ya tıklayın. Bağlantı başarılı olursa, LC sistemi bir kez bip sesi çıkarır ve kontrol ekranı, herhangi bir hata mesajı olmadan Durum kutusunda HyStar'ı listeler.
    2. Edinme sekmesine tıklayın. Örnek Tablo Gezgini'nde, etiket açılır menüsünü bulun ve önceki bir yöntemi seçin.
    3. En son örnek tabloyu ikiye katlayın. Farklı Kaydet... 'e tıklayın ve yeni örnek listeyi şu biçimde kaydedin: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) burada (XXXX) analizin kısa bir tanımlayıcısıdır.
    4. Ayırma yöntemine sağ tıklayın ve Yöntemi Düzenle'ye tıklayın. Modül Yöntemini Düzenle'ye tıklayın.
    5. İndir'e tıklayın. Başarılı olursa, İndirme başarılı oldu açılır pencere. Kaydetme yöntemi olmadan ekranı kapatın.
    6. MS ayarları altında TIMS ayarlarına gidin, 1/k0 başlangıcını 0,70'te ve 1/k0 bitişini 1,85'te seçin. Rampa süresini 150 ms olarak ayarlayın. Bununla, görev döngüsü ve rampa hızı otomatik olarak ayarlanır.
    7. Alt pencerede, Kaynak sekmesini seçin. Kaynak tipini ESI olarak seçin ve uç plaka ofsetini 800 V'a ve kılcal damarı 4500 V'a ayarlayın. Nebulizatör kutusunu kontrol edin ve basıncı 4,0 bar'a ayarlayın. Kuru gazı 4,0 L/dk'ya ve kuru sıcaklığı 250 °C'ye ayarlayın.
    8. Kaynak sekmesinin sağında, Ayar sekmesini seçin. Genel Alt sekmesine tıklayın ve aktarım başlığı altında aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun:
      Sapma 1 delta: 70 V
      Huni 1 RF: 250 vpp
      isCID enerjisi: 0 eV
      Huni 2 RF: 250 vpp
      Çok kutuplu RF: 500 vpp.
      1. Çarpışma hücresi başlığı altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        Çarpışma enerjisi: 6.0 eV
        Çarpışma RF: 1200 vpp.
      2. Dört kutuplu başlık altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        İyon enerjisi: 6 eV
        Düşük kütle: 250 m/z.
      3. Odak öncesi TOF sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        Aktarım süresi: 45 μs
        Darbe öncesi depolama: 5.0 μs.
    9. İşleme Alt sekmesine tıklayın. Kütle spektrumları tepe tespiti altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
      Mutlak eşik: 667
      Mutlak eşik (100 ms AccuTime başına): 445.
      1. Hareketlilik tepe algılaması altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        Mutlak eşik: 30.00.
    10. TIMS alt sekmesine tıklayın. Uzaklıklar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
      Δt1: -20 V
      Δt2: -150 V
      Δt3: 70 V
      Δt4: 150 V
      Δt5: 0 V
      Δt6: 150 V
      Çarpışma hücresi: 300 V.
    11. Ayar sekmesinin sağında, MS/MS sekmesine tıklayın. Öncü iyonlar sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
      PASEF rampa sayısı: 8
      Minimum şarj: 1
      Maksimum şarj:1.
      1. Planlama sekmesi altında, Gelişmiş'i tıklatın ve aşağıdaki parametrelerin sağlandığından emin olun:
        Yoğunluklar: 0,1500, 5000, 10000
        Tekrar: 1, 10, 5, 1
        Yoğunluk Eşiği: 1500.
      2. Etkin dışlama sekmesi altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        Etkin dışlama onay işareti
        Sonra bırakın: 0.4 dk.
      3. Çarpışma altında enerji ayarları aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        K0 (V-s/cm3): 0.70, 1.60
        Çarpışma enerjisi (eV): 20.00, 35.00.
      4. İzolasyon genişliği ayarları altında aşağıdaki parametrelerden emin olun:
        Kütle (m/z): 622, 1222
        Genişlik (m/z): 1.00 2.50.
    12. DIA -PASEF kurulumu: Soldaki MS ayarları tarama modundan DIA-PASEF'i seçin. MS/MS sekmesi altında Pencere Düzenleyicisi'ni seçin. Burada, aşağıdaki parametrelerin olduğundan emin olun (Şekil 3):
      Pencere ayarları: Kütle genişliği: 50 Da; Kütle örtüşmesi: 0.0 Da; Çokgenden hesaplayın: kütle adımları; Hareketlilik pencerelerinin sayısı: 1.

3. Kalibrasyon

  1. Cihaz kalibrasyonu (Şekil 4)
    1. Kalibrasyon alt sekmesi altında m/z'ye tıklayın, açılır kutudan Tuning Mix'i seçin ve sağ alt köşedeki Kalibre Et'e tıklayın.
    2. %100 puan elde edilene kadar Ayarla'ya tıklamaya devam edin.
    3. Şimdi Mobilite sekmesini seçin ve %100 kalibrasyon puanına ulaşılana kadar yukarıdaki adımların aynısını izleyin.
  2. Kalibrasyon eğrisi
    1. 10 μL döteryumlu iç standart karışım ile lipit iç standart karışımını birleştirin.
      0.1-500 ng / mL standart karışımdan 10 μL döteryumlu iç standart karışım ile yedi kalibrasyon noktası kullanın.
    2. 2'de daha önce açıklanan PASEF MS/MS modellerine dayalı olarak yağ asidi zincirlerine manuel olarak açıklama ekleyin.
  3. SIL etiketleme verimliliği
    1. SIL içeren izotopların alanının, SIL içermeyen izotopların alanına oranını hesaplayın.
    2. Herhangi bir yerde etiketli bir atom bulma olasılığını belirleyerek teorik patteni hesaplayın.
    3. Deneysel izotop profillerini veri analizi yazılımında simüle edilen teorik modelle uyumlu hale getirerek SIL zenginleştirmesini hesaplayın.
  4. Çalıştırmayı başlatma
    1. Termometre düğmesine tıklayarak sütun fırınını etkinleştirin. Vana düğmesine tıklayarak pompaları etkinleştirin.
    2. MS yöntemini daha önce kaydedilen yönteme ayarlayın. Enjeksiyon hacminin 5 μL olduğunu ve satır 1'in flakon 20:1'i hedefleyeceğini doğrulayın.
    3. Flakon 20:1'in %50 IPA/ACN'ye sahip olduğundan emin olun. Örnek listeyi kaydedin.
    4. Sırayı başlatın ve başarılı bir enjeksiyonun yapıldığını doğrulayın (sistemde enjekte edildiğini belirten bir mesajla onaylanır).
    5. Yeni bir satır oluşturmak için 1. satırı kopyalayın ve aşağıya yapıştırın. Mevcut deneye bağlı olarak satır 2'yi örneklerle doldurun. Otomatik örnekleyicide doğru konumun kullanıldığından emin olun.
    6. Mobil faz taze ise, önce üreticiden lipit karışım standartlarını enjekte ederek tepe şekli testini gerçekleştirin. Önceki sonuçlarla karşılaştırın. 2 Standartlar, 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (15:0-18:1 PC), lizofosfatidilkolin (18:1 Lyso PC), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil-glisero-3-fosfoetanolamin (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (18:1 Lyso PE), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadekanoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadekanoyl-3-oktadekenoil-sn-gliserol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadekanoil-2-oktadekenoil)-sn-gliserol (15:0-18:1 DAG), 2-oktadekenoil-sn-gliserol (18:1 MAG), kolesteril oleat (18:1 Chol Ester).
    7. Yeni satırların doğru ayırma yöntemine sahip olduğundan ve satır 1'de kullanılan ön koşullandırma yöntemine sahip olmadığından emin olun. MS yönteminin doğru olduğundan emin olun (mevcut günün yöntemi).
    8. Doğru işleme yönteminin yüklendiğini ve Otomatik İşlemi Çalıştır'ın etkinleştirildiğini kontrol edin.
    9. Geçerli çalışma bittikten sonra örneklerin analiz edildiğinden emin olmak için örnek listesini kaydedin.

4. Veri analizi

  1. Açık Veri Analizi yazılımı (Şekil 5). Sol üst köşede Dosya düğmesine tıklayın ve Aç'ı seçin...
  2. Tercih ettiğiniz dosyaları seçin. Dosya adına sağ tıklayın ve Özellikler'i seçin.
    1. Kalibrasyon durumunu seçin (Şekil 6). Açılır kutuda, kütle spektrometresi için İlk Kalibrasyon'u seçin. Tüm hataların 1 ppm'den az olduğundan emin olun.
    2. Ardından, İlk Hareketlilik Kalibrasyonu'nu seçin ve hatanın 1 ppm'den az olduğunu onaylayın.
    3. Kromatogram'a sağ tıklayın ve Kromatogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 6C). Type (Tür) bölümünde, açılır kutuya tıklayın ve Ekstrakte Edilmiş İyon Kromatogramı'nı seçin (Şekil 6D). Filtre altında, Tüm MS'yi seçin ve tarama modu ile Tümü'nü seçin. Bu, ilgilenilen molekülün yalnızca parçalarından ziyade zirvelerini görmek içindir.
      1. Bunun altında, molekül seçimi için iki filtre seçeneği vardır: Kütleler veya Formül. Kütleler seçilirse, ilgilenilen moleküllerin teorik m/z'si seçilebilir. Bu durumda 829.7985 m/z'yi seçin. Formül seçilirse, molekül için formülün yanı sıra kromatogram için ilgilenilen iyon formları da seçilebilir. Bu durumda, amonyum [M+NH4] seçin. Bunun nedeni, bu iyon formunda iyonlaşmayı destekleyecek olan mobil fazdaki amonyum tamponudur (Şekil 7).
      2. Genişlik için ±1'i seçin. Polarite için pozitif modu koruduğundan emin olun. Hareketlilik altında 1.455-1.465'i seçin. Bu, bu değerlere girmeyen molekülleri filtrelemek ve ilgilenilen molekülü izole etmek için yapılır.
  3. Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.
  4. İlgilenilen zirvenin başındaki taban çizgisine sağ tıklayın ve zirvenin sonuna kadar basılı tutarak sürükleyin. Bu manuel entegrasyon, bu tutma süresi içinde canlı bir parça kütle spektrumu sağlayacaktır.
  5. Mobilogram
    1. Mobilogram'da ekranın sol tarafına sağ tıklayın ve Mobilogramı Düzenle'yi seçin (Şekil 8). Edit Mobilogram Traces (Mobilogram İzlerini Düzenle) adlı bir pencere açılacaktır. C.e.i.1'den C.e.i.5'e kadar olan aynı adımları izleyin (Şekil 9).
    2. Saklama Süresinde, ilgilenilen zirvenin tutma süresini girin. Bu durumda, 37.45-37.55 dk.
    3. Parametreler seçildikten sonra, sağ üstteki Ekle > Tamam'ı tıklayın. Kısa bir süre sonra, yazılım seçimleri işleyecek ve bir kromatogram çıkaracaktır.
  6. Ekstrakte edilen iyonlar için, bir iyon listesi oluşana kadar 4.2.3.1-4.3.2.2 adımlarını tekrarlayın.
  7. MS penceresinin alt kısmında, MS Profili ve Parça MS'yi seçin. Bu, tam tarama ve PASEF'ten iyonların spektrum görünümüne izin verecektir.
    1. Spektrum görünümünde, sağ tıklayın ve Bileşik Spektrumları Kopyala'yı seçin. Sağda görünen spektrum verileriyle, çözünürlük çözme gücü, yoğunluk ve sinyal-gürültü oranı (S/N; Şekil 10).
  8. Işleme
    1. Verileri işlemek için, ilgilenilen molekül hakkında değerli bilgiler elde etmek için kromatogramı ve hareketlilik tepe noktalarını manuel olarak entegre edin (Şekil 10).
    2. Bul'a sağ tıklayın ve Yalnızca Entegre Et'i seçin kromatogram veya mobilogram (Şekil 11). Sol tıklayın ve istediğiniz zirveyi vurgulayın. Bu bilgiler saklama süresini, alanı, S/N'yi ve hareketliliği içerir.

Sonuçlar

Kararlı izotop etiketlemesi, dişi sivrisinek yumurtalıklarının lipid dinamiği çalışmalarında trigliseritlerin görselleştirilmesini kolaylaştırır. 2D mobilite alanında, trigliserid 48:1, mobilite 1/K0 ile ilgili olarak belirli bir alıkonma süresine sahip bir bölgede görüntülenir. Trigliseridin yoğunluğu daha koyu mavi bir çizgi ile görselleştirilebilir. Diğer noktalar, yumurtalık içinde bulunan ek trigliseritleri temsil eder. Tutma süreleri ve hareketlilikleri, kütle ve yapılardaki farklılıklar nedeniyle değişir, bu nedenle grafiğin farklı alanlarında ortaya çıkar. Bu farklılıklar, bir numunedeki trigliseritler arasında ayrım yaparken anahtardır (Şekil 12A,B). Bölgenin güçlendirilmiş kütle spektrumu projeksiyonu, 822 m/z'de bir amonyum iyonuna bağlı 48:1 trigliserit iyonunu gösterir. 50:2 ve 52:3 gibi diğer trigliseritler de görselleştirilir, ancak yapı, boyut ve parçalanmadaki farklılıklar nedeniyle daha yüksek m/z bölgelerinde (Şekil 12C,D). Bu örnekte, döteryum etiketli izotopları analiz etmekle ilgilendik. TG 48:1 bölgesi, izotopik olarak işaretlenmiş iyonları görselleştirmek için daha da büyütüldü. İyon üzerindeki döteryum miktarı arttıkça tepe noktasının yoğunluğu azalır. Bu, yüksek döteryum etiketli iyonların daha düşük oluşumları olduğu için olur. M/z oranı, kütle artışlarına bağlı olarak her döteryum ilavesiyle biraz artar. Bu yoğunluklar, numune içinde bulunan her bir izotopun miktarını daha da belirleyecektir.

Kütle spektrumundaki fragmanların yoğunluklarını değerlendirirken, etiketlenmemiş izotopları 2H ile etiketlenmiş olanlarla karşılaştırmak gerekir (Şekil 12E). Mavi, teorik yoğunluklar olarak kesikli siyah çizgilerle etiketlenmemiş yoğunluktur. Kırmızı renkte, izotop etiketli sonuçlar gözlenir. Hem etiketsiz hem de teorik yoğunluklardan daha büyük yoğunluklar gösterirler. Türlerin izotopik etiketleme ile zenginleştirilmesi, etiketlenmemiş teorik türlerden daha büyük bir yoğunluk verir. Daha büyük yoğunluklar, bölge tutarsızlıkları nedeniyle trigliseritlerin görselleştirilmesine izin verir. Parçalanma, lipitlerin tanımlanmasında da önemli bir rol oynar, çünkü PASEF, tam tarama MS/MS ile karşılaştırıldığında daha fazla parçalanma sağlayacaktır. Bunun nedeni, lipit zincirlerindeki yağ asitlerinin farklı modellerde parçalanabilmesidir, bu nedenle spektrumlardaki çizgiler, trigliseritin parçalanma sürecine bağlı olarak parçaların yoğunluğunu gösterir (Şekil 12F). Bu, yağ asidi hakkında yapısal bilgi sağlar ve bir türün hangi izomerinin mevcut olduğunu belirlemeye yardımcı olur. DIA yönteminden elde edilen verileri analiz ederken, parça sayısı artacak, bu nedenle tipik bir DDA yönteminden daha iyi bir MS/MS taraması ve üstün tanımlama ile sonuçlanacaktır.

figure-results-1
Şekil 1: Yazılımın tipik ana ekranı. Ana ekran, yöntem oluşturmaya ve enstrümanı başlatmaya izin verir. (A) TIMS ve MS/MS kontrol ayarlarını içeren yazılım ekranı. Ekranın alt kısmında, enstrümandaki bu kontrolleri düzenlemek için kaynak sekmesi bulunur. (B) Ayar sekmesinin açıldığı yazılım ekranı. (C) Burada, çalgı genel akort için hazırlanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Ayar sekmesinin açıldığı yazılım ekranı. Burada işleme ayar parametrelerini düzenleyebilirsiniz. (A) Ayar sekmesinin açık olduğu yazılım ekranı. Burada, enstrümanın TIMS kısmı için akort parametreleri düzenlenebilir. (B) Ekranın alt kısmında MS/MS sekmesinin seçili olduğu Yazılım ekranı. (C) Burada tandem kütle spektrometresi için parametreler düzenlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: DIA-PASEF pencere genişliklerini seçme ekranı. Burada, bolluk için renkleri düzenleyebilir ve veri toplama için pencerelerin boyutunu düzenleyebilirsiniz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kütle spektrometresinin kütle / yük oranına (m / z) göre kalibrasyonu. Kalibrasyon için referans listesi seçilir. (A) Sağ altta, kabul edilebilir bir değer görünene kadar Kalibre Et düğmesine tıklanır. İyon hareketlilik spektrometresinin hareketlilik ile kalibrasyonu. Kalibrasyon için referans listesi seçilir. (B) Sağ altta, kabul edilebilir bir değer görünene kadar Kalibre Et düğmesine tıklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Veri analizi yazılımı için tipik ana ekran. Bir dosyayı açmak için, seçeneklerin göründüğü açılır kutu için sol üstteki Dosya düğmesine tıklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Veri analiz yazılımı. (A) kalibrasyon sonuçlarının nasıl seçileceği ve (B) kalibrasyon kategorisinin seçileceği ile başarılı bir kalibrasyonu onaylayan yazılım ekranı. (C) Analiz etmek için bir kromatogramın seçilmesi ve (D) ekstrakte edilmiş bir iyon kromatogramının seçilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Açılır ekran. (A) kütle filtresi ve (B) formül filtresi ile iyon kromatogramını seçmek ve çıkarmak için açılır pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Veri Analizi yazılımı. Solda bulunan yazılım ekranı, analiz için bir mobilogram seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Webbogram için açılır ekran. (A) kütle filtresi ve (B) formül filtresi ile ekstrakte edilmiş bir iyon mobilogramı seçmek için açılır pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: Veri analizi ekranı. (A) Yazılım ekranı; Solda vurgulanan, çıkarılmış bir iyon listesi oluşturabilir. (B) Alt kısımda ekstrakte edilen iyonlardan bir bileşik spektrumun hazırlandığı veri analizi ekranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 11: Veri analizi ekranı. Bileşik spektrumların manuel entegrasyonunun sonuçlarını gösteren yazılım ekranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12
Şekil 12: LC-TIMS MS Sonucu. (A) LC-TIMS MS beslenmeden 4 gün sonra 2H etiketli sükroz diyeti ve böcek yumurtalıkları 2D mobilite alanında görülebilir. (B) Etiketli numuneden TG 48:1, TG 50:2 ve TG 52:3'e karşılık gelen sinyal için tipik MS projeksiyonları. (C) Etiketli TG profilini belirten güçlendirilmiş MS bölgesi 822 - 827 m/z . (D) Kırmızı renkli MS tepe noktalarının izotop profilini yükseltmesine özellikle dikkat edin. (E-F) 2H etiketli izotop profili kırmızı renkle vurgulanmıştır; Aşağıda etiketsiz izotop profili mavi renkle vurgulanmıştır. Teorik izotop profilleri çizgi çizgileri olarak gösterilir (siyah 13C; 2Yeşil H renginde). Trigliserit 48:3 için potansiyel bir yapı da sağ üstte görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolün kullanımını değerlendirirken, DIA-PASEF ve MS/MS parametrelerinin söz konusu trigliseritlere uygulanabilir olduğundan emin olmak önemlidir. Spesifik olarak, hareketlilik pencereleri ve pencere genişliği trigliseritlerin modelini takip etmelidir. Bu, DDA yöntemi kullanılarak önceki bir çalıştırma ile belirlenebilir. Dahili standartta trigliseritleri izlerken, DIA kurulumu için pencereler önceden tanımlanmış tüm ilgili molekülleri kapsamalıdır. Pencerelerin tümü eşit boyutlarda olmalı ve aralıklar istenen bileşiklerin m/z ve 1/k0'ı içinde olmalıdır (Şekil 7). Pencerelerin yanlış boyutlandırılmasıyla, parçalanacak iyonlar atlanacak ve verim spektrumları daha düşük tekrarlanabilirliğe sahip olacaktır. Esasen, lipidomikte bir pencere aralığının uygun optimizasyonu olmadan, DIA sonuçları DDA verilerini geliştirmeyecektir. Pencereler, veri toplama işlemi için adım adım bir şekli temsil etmelidir. Aksi takdirde, DIA-PASEF pencere kurulumu arasındaki parametreler, tam lipid profilini temsil edecek şekilde değiştirilmelidir. Bu adım olmadan, kritik yağ asitleri elde edilen verilerden çıkarılacaktır.

Enstrümantal sınırlamalar çoğunlukla LC-MS yöntemleriyle gelenleri içerir. Bu, tepe genişliğindeki çoğullama sınırlamalarını içerir. Bu nedenle, veri toplama sırasında seçiciliği teşvik eden uygun bir kantitasyon için pik elüsyonda bir optimizasyon olmalıdır. Tipik olarak bu, DDA gibi seçili öncülerle olur. Bununla birlikte, DIA ile hiçbir öncü seçilmez, bu nedenle araçsal seçicilikte sınırlamalar riski vardır8. DIA yöntemleri daha fazla parçalanma sağlarken, hala sınırlamalar mevcuttur. En belirgin sınırlama, öncü seçicilikteki azalmadır. Bir DIA yönteminin pencereleri, tipik bir DDA yönteminden 5 ila 10 kat daha geniştir. Sonuç olarak, daha fazla parçalanmaya izin verirken, görev döngüsünü ve seri edinimi azaltabilir. Bu, kademeli bir dört kutup kullanan kütle spektrometrelerinde gözlemlenebilir. Öncül seçimi olmadığından ve hangi iyonların parçalanması gerektiğinden, statik izolasyon pencereleri, m/z penceresini kaplamak için sırayla çevrilir. Pencere tipik bir DDA yönteminden çok daha büyük olduğundan, hassasiyet kazanmaya çalışmak için daha geniş aralıklar kullanmak gerekir9. Seri alımdaki sorun bu nedenle hassasiyeti azaltır. İkinci bir sınırlama kütüphane oluşturmayı içerir. Zaman alıcıdır ve formüle etmek için çok miktarda numune gerektirir. Harici kitaplıklar kullanılabilse de, parçalanma modelleri deneysel koşullar ve enstrümantasyon10 arasında farklılık gösterebilir.

Kararlı izotop etiketlemesi kullanarak lipit verilerini analiz ederken, organizmada bulunan diğer moleküllerden gelen paraziti en aza indirmek gerekir. Bu, LC-TIMS-TOF-MS/MS2 gibi yüksek çözünürlüklü analiz araçları kullanılarak yapılır. Şu anda, etiketli izotopları arka plan gürültüsünden ayırmak için bu yüksek çözünürlüklü araçların kullanımı, geleneksel yöntemlere kıyasla hala çok yenidir. Geleneksel enstrümantal hususlar, gaz kromatografisi ile ayırmayı ve ardından kimyasal veya elektron iyonizasyonunu gerçekleştirir. Bu, pentaflorobenzil bromür ile kimyasal türetmeye veya elektron iyonizasyonundan parçalanmaya izin verir. Daha yakın zamanda LC-MS'nin izotopik çalışmalarda kullanıldığı yerdir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrelerinin kullanılması, yüksek kütle doğruluğu ve tek bir izotop yerine birden fazla izotopik etiket kullanarak çoklu izleyici çalışması yapma yeteneği sağlar. Cihazın yüksek çözünürlüğü olmadan, 13C, 2 ve 13C gibi farklı etiketleme dereceleri arasında ayrım yapılamazdı. Bu, daha düşük çözünürlüğe sahip geleneksel enstrümantasyona kıyasla tek bir çalıştırmadan daha fazla bilgi sağlar10.

DIA, DDA'dan daha iyi tekrarlanabilirliğe sahip olsa da, ortaya çıkan diğer veri toplama yöntemleri karşılaştırılabilir. p-SMART gibi hibrit DIA-DDA stratejileri, hedeflenen kalitatif analizlerin yüksek seviyesini korurken, mükemmel tespit ve niceliklendirmeyi sürdürmek için her bir yöntemin güçlü yönlerini birleştirebilir. Bu yöntemde, eşleşen bir ürün iyonunun kullanılması, geniş bir hedeflenmemiş yaklaşıma kıyasla DIA pencerelerini daraltacağından, DIA duyarlılığını ve seçiciliğini artırabilir8. Lipidomikte, bir trigliseridin yapısı izomerik yapıya göre değişebilir. PASEF, çeşitli parçalanma modellerinin görselleştirilmesine izin vererek türlerin tanımlanmasını iyileştirir2. DIA-PASEF kullanımıyla, artan parçalanma, DDA yönteminin sınırlamaları nedeniyle normalde çözülemeyen diğerlerine benzer şekilde birçok parça olarak izomerler hakkında bilgi sağlar. Bu bilgi, sivrisinek yumurtalıklarında hangi yağ asitlerinin bulunduğuna dair kanıt sağlar. Bu yöntem, çeşitli organizmalarda yapılan diğer de novo lipid çalışmalarına uygulanabilir.

Açıklamalar

Matthew Willetts ve Melvin A. Park, timsTOF ticari enstrümanının üreticisi olan Bruker Daltonics Inc.'in çalışanlarıdır. Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Cesar Ramirez'in katkılarını kabul etmek isterler. Bu araştırma, FGN'ye R21AI167849 NIAID hibeleri, Çek Cumhuriyeti'ndeki Çek Bilim Vakfı'ndan MN'ye 22-21244S projesi tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Accucore C30 sütunThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Pusula Veri AnaliziBruker Daltonics Inc2363525870Sürüm 5.2
d-Glikoz-13C6Sigma-Aldrich 
eppendorf tüpleriFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
cam şişelerThermo Fisher Scientific11-417-236
ağır su (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
polipropilen tokmaklıFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultra hızlı sıvı kromatografıShimadzuL20234651907
silanize cam eklerThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Ayar Karışımı Kalibrasyon StandardıAgilent Technologies36
389374605417

Kaynaklar

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

De Novo Lipid SenteziLipid MetabolizmasLipidomikVeriye Ba l Kazan mVeriden Ba ms z Kazan mYa Asidi ZincirleriSivrisinek Yumurtal k Geli imiKromatogram Entegrasyonu
Kararlı İzotop Etiketleme LC-TIMS-TOF MS/MS kullanarak de novo Lipidlerin İzlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.