Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

Özet

Leishmania Translasyonel Ekstrakt (LTE), tek hücreli parazit Leishmania tarentolae'den türetilen ökaryotik hücresiz bir protein ekspresyon sistemidir. Bu optimize edilmiş protokol, LTE'nin üretimini basit ve uygun maliyetli hale getirir. Karmaşık ökaryotik proteinlerin ve bunların etkileşimlerinin çok paralel ekspresyonu ve çalışmasına odaklanan çeşitli uygulamalar için uygundur.

Özet

Bu protokol, Leishmania Translasyonel Özü veya LTE olarak adlandırılan tek hücreli kamçılı Leishmania tarentolae'den türetilen ökaryotik Hücresiz Protein Ekspresyon Sisteminin (CFPS) üretimini ve optimizasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu organizma başlangıçta bir kertenkele paraziti olarak evrimleşmiş olsa da, şişelerde veya biyoreaktörlerde kolay ve ucuz bir şekilde yetiştirilebilir. Leishmania major'dan farklı olarak, insanlar için patojenik değildir ve özel laboratuvar önlemleri gerektirmez. CFPS için Leishmania kullanmanın bir başka avantajı, CFPS'ye tek bir antisens oligonükleotidin eklenmesinin, tüm protein kodlayan RNA'ların 5'-ucunda korunmuş bir ekleme lideri dizisini hedeflemesinin, endojen protein ekspresyonunu baskılayabilmesidir. Önceki sürümlere kıyasla basitleştirilmiş ve geliştirilmiş hücre bozulması ve lizat işleme için prosedürler sunuyoruz. Bu işlemler basit şişe kültürleri ile başlar. Ek olarak, türden bağımsız translasyon başlatma bölgeleri (SITS) içeren vektörler kullanılarak genetik bilginin nasıl tanıtılacağını ve tutarlı protein ekspresyon kalitesini sağlamak için basit parti optimizasyonu ve kalite kontrolünün nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz.

Giriş

1960'larda, hücresiz protein ekspresyon sistemleri, genetik kodun ortaya çıkarılmasında çok önemli bir rol oynadı¹. Bununla birlikte, esas olarak E. coli'ye dayanan prokaryotik hücresiz protein ekspresyon sistemleri, şu anda hem laboratuvar hem de ticari uygulamalara hakimdir. E. coli bazlı sistemler maliyet etkinliği, ölçeklenebilirlik ve yüksek ekspresyon verimi gibi avantajlar sunarken, aktif formlarında çok alanlı proteinler üretirken ve protein komplekslerinin montajını kolaylaştırırken^zorluklarla karşılaşırlar ^2,3. Günümüzde, yaygın olarak kullanılan ökaryotik Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) formları arasında buğday tohumu özütü (WGE), tavşan retikülosit lizatı (RRL) ve böcek hücresi lizatı (ICL) ^bulunur4,5,6. Bu çalışma, tek hücreli kamçılı parazit Leishmania tarentolae'ye dayanan, hem basit hem de ölçeklenebilir alternatif bir ökaryotik hücresiz sistemi tanıtmaktadır.

Leishmania tarentolae , uygun maliyetli ortam kullanılarak şişelerde kolayca yetiştirilebilir ve ayrıca daha yüksek hücre yoğunluğu elde etmek için biyoreaktörlerde ölçeklendirilebilir. Hücre lizatında endojen mRNA'ların varlığı, aksi takdirde tanıtılan mesajlarla rekabet edebilecek, korunmuş Leishmania mRNA ek lideri dizisi^7'yi hedefleyen antisens oligonükleotidler kullanılarak nötralize edilebilir. İnsan hastalığına neden olan yakın akrabası Leishmania majörden farklı olarak L. tarentolae , mağribi kertenkeleyi (Tarentolae mauritanica) enfekte ederek, özel önlemlere ihtiyaç duymadan PC2 laboratuvar ortamlarında yetiştiriciliğe uygun hale getirir. Daha önce in vivo protein ekspresyonu⁸ için transgenik bir organizma olarak kullanılmıştır.

Hücresiz sistemlerde şablon hazırlamayı kolaylaştırmak için, translasyonel başlatmayı geliştiren polimerik RNA yapılarına dayalı olarak evrensel diziler tasarlanmıştır⁹. Bu türden bağımsız çeviri dizileri (SITS) hem prokaryotik hem de ökaryotik hücresiz sistemlere uygulanabilir ve genetik bilgiyi LTE'ye dahil etmek için uygundur. Bu protokol, LTE hücresi içermeyen protein ekspresyonu için vektör yapımının ayrıntılı bir açıklamasını sağlamasa da, optimizasyon ve kalite kontrolü, SITS bölgesinin aşağı akışında istenen ilgili proteinlerin florofor füzyonlarını içeren uygun vektörler gerektirir. Bu amaçla, Ağ Geçidi klonlama bölgeleri kullanılarak istenen ilgilenilen proteine bir N-terminal eGFP füzyonunu kodlayan pCellFree_G03 vektör gibi uygun LTE vektörleri Addgene gen deposu ile biriktirilmiştir.

LTE, protein kendi kendine montajının^{analizi 10,16}, insan integral zar proteinlerinin üretimi¹⁷, antiviral ilaç adayları^{üzerinde araştırma 18}, biyoteknolojik olarak yararlı enzimlerin geliştirilmesi¹⁹, protein biyosensörlerinin^{prototiplenmesi 20,21} ve kancalı kurtlardan elde edilen biyolojiklerin incelenmesi²² dahil olmak üzere protein ekspresyonu gerektiren çok çeşitli uygulamalarda değerini kanıtlamıştır. LTE, viroloji ve hücresel yapılar alanlarında Protein-Protein etkileşim ağlarının haritalanmasında da etkili olmuştur^21,32. LTE, daha uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim sunarken, tam uzunlukta, tek dağılmış ve toplanmamış proteinleri³³ ifade etmede diğer ökaryotik hücresiz sistemlere benzer şekilde performans gösterecek şekilde kıyaslanmıştır.

Bu protokol, konakçı organizmayı yetiştirmek ve bozmak, lizat hazırlamak ve birleştirilmiş transkripsiyon / translasyon protein ekspresyonu için bir besleme çözeltisi (FS) takviyesi için teknikler sağlar. Ek olarak, üretim partilerini optimize etmek için bir protokol içerir. Leishmania hücresiz sisteminin ilk versiyonunda, ekspresyon seviyelerinde, tam uzunlukta proteinlerin fraksiyonunda ve protein agregatlarının varlığında istenmeyen partiden partiye varyasyon gözlendi ve bu da partilerin^{atılmasına yol açtı 34}. Bu sorunu gidermek için daha sonraki protokol iyileştirmeleri yapıldı²⁵. Mevcut protokol, bu iyileştirmeler üzerine inşa edilmiştir ve bireysel partilerin en yüksek protein ekspresyonu ve boyutu için optimize edilmesine izin verir. Bunu, hücre bozucu yüklemeyi yakından kontrol ederek (600 nm'de optik yoğunluk olarak ölçülür; OD_600nm) ve 280 nm'de (Abs_280nm) absorbans kullanarak elde edilen lizat çıkışını normalleştirmek. Ayrıca, üretim sırasında lizatın kısmen rNTP ve magnezyum ile desteklenmesi için bir yöntem içerir ve daha sonra test ifadeleri sırasında bu besleme çözeltisi bileşenlerinin optimizasyonu yapılır. Bu optimizasyon protokolde bir seçenek olarak sunulsa da yazarlar tarafından şiddetle tavsiye edilmektedir.

Protokol

Bu protokol, kültürlemeyi, santrifüjlemeyi, çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansının ölçülmesini, OD_600nm kültürünün ölçülmesini ve lizat Abs_280nm'nin değerlendirilmesini içeren ayrıntılı ortam tariflerini ve adımlarını içerir. Ayrıca SDS-PAGE protein jellerinin kurulumunu ve görüntülenmesini de kapsar. Bu protokol için gerekli olan veya önerilen malzemeler, Malzemeler elektronik tablosunda listelenmiştir. Ortam bileşenleri, santrifüjler, tüpler, spektrofotometreler ve jel elektroforez kurulumları gibi tipik laboratuvar kaynaklarının, aksi belirtilmedikçe büyük olasılıkla birbirinin yerine kullanılabileceğini unutmamak önemlidir. Şekil 1 , LTE üretim sürecinin bir özetini sağlar.

Şekil 1: LTE üretim protokolüne genel bakış. Bu karikatür, LTE üretim protokolünün kısa bir özetini sunmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Leishmania tarentolae kültürlerinin büyümesi

1. En az 3 L TBGG büyüme ortamı hazırlayın (Baktotripton 12 g/L, Maya özütü 24 g/L, gliserol 8 mL/L, glikoz 1 g/L, KH₂PO₄ 2,3 g/L, K₂HPO₄ 2,5 g/L, bkz . Ortamı vakum veya benzer bir kurulum altında 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
2. Ortamı oda sıcaklığında (RT) saklayın, son ilaveler (Hemin, Antibiyotikler) L. tarentolae ile aşılamadan hemen önce eklenir. Hemin (% 50 trietanolamin içinde% 0.25 v / v),% 0.2 v / v, Penisilin (10.000 birim / mL) artı Streptomisin (10.000 μg / mL)% 0.5 v / v'de karıştırılır.
   NOT: Bu protokolün başlangıç noktası, bakımı yapılan 2 x 10 mL'lik yabani tip L. tarentolae kültürüdür. Bakım kültürleri 27 °C'de standart 50 mL'lik doku kültürü şişelerinde düşük çalkalama (75 rpm) ile büyütülür. Bu tür 10 mL kültürler, her 2-3 günde bir steril (TBGG + hemin, penisilin, streptomisin) içinde ~ 1/20 seyreltme ile süresiz olarak korunabilir. Bir PC2 laboratuvarında standart bir biyogüvenlik kabini tavsiye edilir; bununla birlikte, bakteriyel kontaminasyonlar eklenen antibiyotikler tarafından önlenme eğilimindeyken, mantar kontaminasyonları genellikle L. tarentolae tarafından büyütülür.
3. İki gün boyunca, L. tarentolae bakım kültürlerini 200 mL'ye (1. gün) ve daha sonra her gün artan hacimde TBGG + hemin / antibiyotik ile 1: 10 dilüsyon yoluyla 2 L'ye (2. gün) genişletin. Her iki seyreltmeyi de otoklavla sterilize edilmiş şaşkın 5 L'lik cam şişelerde (maksimum 1 L'ye kadar doldurulmuş) gerçekleştirin. İkinci seyreltme, ertesi gün saat 8-11 arasında lizat üretimine başlamak amacıyla öğleden sonra 3-6 arasında yapılmalıdır.
   NOT: Bu protokol, LTE üretimi için minimum başlangıç hacmini kullanır (2 x 1 L kültür). Ek bir genişletme adımı dahil ederek LTE üretimi için kültürü 10 L'ye kadar genişletmek de mümkündür (örneğin, Gün 1: 100 mL; 2. Gün: 1 L; 3. Gün: 10 L). Bu protokol, L. tarentolae'yi büyütmek için şaşkın şişeler (Malzeme Tablosuna bakınız) kullansa da, isteğe bağlı olarak, karıştırma hızının 100 rpm'nin altında tutulması koşuluyla, Rushton çarkları ile bakteri üremesi için tasarlanmış geleneksel biyoreaktörler kullanılabilir. Biyoreaktörlerde iyileştirilmiş havalandırma ve pH kontrolü genellikle L. tarentolae kültürlerinin log fazı büyümesini uzatır ve adım 1.4'te kullanılmak üzere_{600 nm'lik} daha yüksek bir hasat OD 10'a izin verir.
4. Kültürün OD_600nm'sini doğrudan spektrofotometre küvetinde TBGG'de 1:10 seyreltme yoluyla üç kopya halinde kaydedin. Lizat yapmak için uygun bir başlangıç aralığı OD_600nm = 4.0-8.0'dır.
5. OD_600nm < 4.0 ise ek inkübasyon süresi sağlayın. OD_600nm > 8'e sahip bir kültür kullanılabilir ve daha fazla hacimde hücresiz ekspresyon lizatı ile sonuçlanacaktır, ancak geç log büyüme fazının başlaması nedeniyle daha düşük kaliteye sahiptir. Kültür şişelerini buzun üzerine yerleştirin ve sonraki adımları bekleyin.
   NOT: Nihai kültür OD_600nm'nin doğru ölçümü, bozulmadan önce konsantre hücreler için nihai hacmi hesaplamak için kullanıldığından kritik öneme sahiptir. Bu hesaplama, protokolü basitleştirmek için kesinti^34'ten önce hücre konsantrasyonunu kalibre etmek için LTE üretiminin önceki sürümlerinde kullanılan bir pelet tartım yönteminin yerini alır. OD_600nm ölçümü için TBGG'de seyrelttiğinizden emin olun, aksi takdirde ozmotik şok hücre şeklini değiştirerek ölçüm hatasına neden olur. Pipet, spektrofotometrik okumayı yapmadan saniyeler önce OD_600nm ölçümü için (doğrudan küvette) 1:10 seyreltmeyi karıştırın, çünkü L. tarentolae hücreleri belirgin bir bulutlu görünümle hızla yerleşir. İfade kültürünün nihai hacminin yaklaşık olduğu kabul edilirse, daha iyi bir tahmini hacim elde etmek için (1 g = 1 mL'de) hasatta şişelerin (uygun boş şişe dara ile) tartılması da önerilir. Şaşkın şişelerde L. tarentolae büyümesinden mümkün olan maksimum OD_600nm 15-20'dir, ancak bu, sabit faza ulaşması nedeniyle lizat üretimi için uygun değildir.

2. L. tarentolae kültürlerinin konsantrasyonu

1. Leishmania hücreleri, bozulmadan yaklaşık 60 kat önce yıkanmalı ve konsantre edilmelidir. Son konsantre için OD_600nm = 300'e dayalı hücre konsantrasyonu için hedef hacmi hesaplayın. Denklem V = hasat hacmi (mL) x (hasat OD_600nm/300). Örneğin, hasat OD₆₀₀ = 5 olan 2 L'lik bir kültür kullanıldığında, hedef hacim 33 mL'dir.
   NOT:_{300'lük OD 600nm} hedefi değiştirilebilir; önceki LTE üretiminde 150-350 aralığında değerler kullanılmıştı. Bozulmaya giren daha yüksek hücre konsantrasyonları, daha yüksek protein verimleri ile nihai hücresiz ekspresyon reaksiyonları verme eğiliminde olacaktır, ancak savunmasız proteinlerin toplanma eğilimi artacaktır. OD_600nm = 300, LTE üretimi için uygun bir varsayılan hedefi temsil eder.
2. Hasat edilen kültürleri uygun santrifüj şişelerine aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 2500 x g'da döndürün. Süpernatanı dikkatlice kültür atığına boşaltın.
   NOT: Bozulma yüklemesinin hesaplanmasını etkilediğinden, atılan süpernatanta hücre kaybını en aza indirmek önemlidir. Önceki LTE üretim protokollerinde, bozulma için L. tarentolae hücrelerinin konsantrasyonu, hücre konsantresinin bir test mikrosantrifüj tüpünde döndürülmesi ve toplam ağırlığa^{karşı pelet ağırlığının ölçülmesiyle kalibre edildi 34}. Bu basitleştirilmiş protokol bunun yerine, ölçülen hasat OD_600nm'ye dayalı olarak konsantre için teorik bir OD_600nm hedefi kullanır ve hücre konsantrasyonu ve yıkama sırasında düşük hücre kaybını varsayar.
3. Hücre peletini SEB tamponunda (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM sükroz, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂, buz üzerinde tutulur) üç kez yıkayın, her seferinde 2500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. İlk yıkama için, her 1 L peletlenmiş kültürü 100 mL SEB tamponunda yeniden süspanse edin, ardından bunları tek bir santrifüj şişesinde birleştirin. İkinci yıkama için, orijinal kültürün her 1 L'si için 100 mL SEB kullanın.
   NOT: Son pelet yeniden süspansiyonu için, nihai hedef yeniden süspansiyon hacminin P'sine SEB tamponu ekleyin (adım 2.1). Bu, havuzlanan konsantrenin adım 2.4'teki tam olarak nihai hedef hacme kadar dikkatli bir şekilde doldurulmasını sağlar. L. tarentolae'nin erken parçalanmasını önlemek için her bir yeniden süspansiyon mümkün olduğunca yumuşak olmalıdır, örneğin, eklenen SEB'yi boşaltılan peletin etrafında hafifçe döndürerek veya SEB'yi santrifüj tüpü duvarına yapışan pelet üzerine pipetleyerek. Son adım için süpernatantları daha küçük santrifüj tüplerine aktarmak daha uygun olabilir.
4. Yeniden süspanse edilmiş konsantreyi uygun bir yıkanmış cam hacimsel silindire dökün, ardından ilave soğuk SEB kullanarak hacmi hedef hacme (adım 2.1) doldurun ve hafifçe karıştırın.

3. L. tarentolae konsantresinin parçalanması

1. Hücre konsantresini önceden 4 °C'ye soğutulmuş nitrojen kavitasyon cihazına aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız), 70 bar nitrojene basınçlandırın ve buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
   NOT: Nitrojen kavitasyon bozucular yaygın laboratuvar öğeleri olmasa da, LTE üretimi için önerilir. Hücresel donma-çözülme ve French-press tipi bozucular gibi alternatif yöntemler denenmiş; Bununla birlikte, protein ekspresyon aktivitesi, nitrojen kavitasyon yönteminin kullanılmasına kıyasla% <50 idi. Nitrojen kavitasyon cihazı, bu adımdan itibaren hücre lizatı ile temas eden tüm yeniden kullanılan kaplara (alıcı şişesi gibi) benzer şekilde, kullanımdan önce ve çalışmalar arasında iyice temizlenmelidir. Uygun bir temizleme rejimi, laboratuvar deterjanları ile yıkamayı ve ardından deiyonize su ile iyice durulamayı içerir.
2. Nitrojen kavitasyon cihazındaki havalandırma deliğini açın ve elde edilen lizatı buz üzerinde bir vakum alıcı şişesi gibi uygun şekilde sağlam bir kaba boşaltın. Elde edilen tüm lizatın çökeldiğinden ve yeni bir santrifüj tüpüne veya benzer bir kaba pipetlenebildiğinden emin olmak için alıcı şişesini eğin.
   DİKKAT: Nitrojen kavitasyon bozucular, hücre konsantresinin 70 bar nitrojenden ortam basıncına ani geçişine dayanır, bu da cihazın çıkış valfinden güçlü bir önce sıvı ve ardından nitrojen akışıyla elde edilir. Havalandırma, kimyasal güvenlik başlığında uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile yapılmalıdır. Hedef kabın kırılma ve lizatı kaybetme riski vardır, bu nedenle jenerik bir şişe yerine sağlam bir vakum alıcısı kullanıyoruz. Cihazın çıkış valfi bir tüp ise, havalandırma noktasında aşırı basınç oluşmasını önlemek için tüpü doğrudan alıcının içine yerleştirmekten kaçının.

4. Hücre lizatının santrifüjlenmesi

1. Lizatı uygun g kuvvetine dayanıklı santrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı taze, benzer santrifüj tüplerine çıkarın.
2. Lizatı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından son süpernatanı taze bir santrifüj tüpüne veya buz üzerine yerleştirilmiş benzer bir kaba çıkarın. Toplam hacmi tahmin edin.

5. Hücre lizatının jel filtrasyonu

NOT: Jel filtrasyonu, SEB tamponunda bulunan sakarozun çıkarılması için kullanılır. Sükroz, hücre bozulması sırasında hücresel mekanizmanın stabilize edilmesine yardımcı olurken, protein ekspresyon reaksiyonlarında tutulursa verimi düşürür.

1. Yeterli sayıda PD-10 yerçekimi beslemeli jel filtrasyon kolonunu (Malzeme Tablosuna bakınız), bir toplama tepsisine veya altındaki benzer bir kaba damlamalarına izin veren bir raf biçiminde kurun ve tüm lizat hacmini sütun başına 2,5 mL'de filtreleyebilmelerini sağlayın. Kolonları önceden 10 mL 4 °C EB tamponu (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂) geçirerek önceden dengeleyin.
   NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımların 4 °C soğuk odada gerçekleştirilmesi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, tüm lizatları ve reaktifleri bir tezgah üstü buz tepsisinde tutmak da uygundur. Bunun bir istisnası, yazarların yeniden tamponlama sırasında 4 °C'lik bir buzdolabının içine bir sütun rafı yerleştirdiği jel filtreleme adımıdır. Bu protokolün orijinal versiyonlarında, yeni jel filtrasyon kolonları, başlangıçta lizatı tamponlayarak ve ilk çıktıyı atarak 'bloke edildi'. Bu gerekli görülmese de, kolonlar EB tamponu ile yıkanmalı ve lizat partileri arasında 4 °C'de saklanmalıdır. İlk çıkış lizatı, yeni kolon üzerinde lizat bileşenlerinin bir miktar arka planda tutulması nedeniyle sonraki çıktılardan daha düşük protein ekspresyon aktivitesine sahip olabilir.
2. Her sütuna 2,5 mL lizat ekleyin ve sütuna geçene kadar bekleyin. Elüatı atarken lizatı kolona çökeltmek için ek bir 0.5 mL EB ekleyin.
3. Her sütuna ek 2,5 mL EB ekleyerek jel filtreli lizatı elute edin, çıktıyı sütunların altına taze, temiz bir tepsi veya başka bir kap yerleştirerek toplayın.

6. Hücre lizatının takviyesi

1. Jel filtreli lizatın Abs_280nm'sini ölçmek için nanodrop spektrofotometresini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. 60'ı aşarsa, ek 4 °C EB tamponu kullanarak Abs_280nm = 60'a ulaşacak şekilde seyreltin.
   NOT: OD_600nm kullanılarak bozulmaya hücre yoğunluğu girişini kontrol ederken, lizat çıkış gücünü yaklaşık olarak belirlerken, lizat bozulması ve işlemeden sonra Abs_280nm'yi normalleştirmek, lizat performansının toplu tutarlılığını daha da iyileştirir. Lysate Abs_280nm , protein ekspresyonu verimi ve agregasyonu için sonuçlarla birlikte yukarı ve aşağı ayarlanabilir. Takviye edilmemiş lizat, bir Abs_280nm < 60'ı gösteriyorsa, bozulma adımına daha fazla Leishmania biyokütlesi dahil etmek, yani hücre bozucu yüklemesini adım_{2.1'de OD 600nm > 300'e} çıkarmak gerekebilir.
2. 5x Besleme Çözeltisi (5x FS, Tablo 1) lizata 2: 5 oranında ekleyin ve iyice karıştırın. Uygun kaplara (örneğin, 1,5 mL mikrofüj tüpleri) koyun ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Aşağıdaki LTE ifade optimizasyonu için isteğe bağlı 7.1-7.3 adımları izleniyorsa, varsayılan 5x FS yerine Tablo 1'deki azaltılmış rNTP.Mg 5x FS'yi kullanın. Optimizasyon deneylerinde kullanılmak üzere dondurma için 5 x 100 μL'lik alikot ekleyin.
   NOT: 2:5 oranında varsayılan 5x FS ile dondurma, 7 μL/10 μL ekspresyonda kullanılan, ifadeye hazır takviyeli LTE oluşturur (bu nedenle, 5x FS, son reaksiyonda 1x FS olur). Bununla birlikte, yazarlar, 5x FS'de varsayılan rNTP ve magnezyum miktarının 0,6 katının sağlandığı diğer isteğe bağlı adımların izlenmesini önermektedir. Bunu, test reaksiyonlarını optimize edilmiş bir değere tamamlamak için ikisinin eşmolar bir karışımının (rNTP.Mg olarak adlandırılır) eklendiği bir optimizasyon adımı izler. Kısmi 5x FS ayrıca endojen mRNA ekspresyonunu kapatan bir oligonükleotid içerir (Giriş bölümüne bakınız). Oligonükleotidin dizisi CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT'dir.

7. Kalite kontrol ve son takviyeli LTE'nin optimizasyonu

NOT: İndirgenmiş rNTP ve magnezyum takviyeli lizata rNTP.Mg'in uygun 'tamamlama' ilavesini belirlemek için gerekli minimum adımlar, bir füzyon partneri olmadan eGFP veya benzer bir floroforun (örn., sfGFP) eksprese edilmesini içerir. İfade seviyesinin (çok modlu bir plaka okuyucu aracılığıyla eGFP RFU olarak ölçülür) optimize edildiği noktayı belirlemek için reaksiyonlara artan rNTP.Mg konsantrasyonları eklenir. Floresan olmayan eGFP'nin erken sonlandırılması, çok yüksek rNTP.Mg konsantrasyonlarında eGFP RFU'nun azalmasıyla belirginleşir. Bununla birlikte, LTE'nin kısa ürün arızaları, daha büyük eksprese edilen proteinlerde (>50 kDa) daha sık görülür. Bu nedenle, bu optimizasyonu eGFP'den daha büyük bir şablon kullanarak gerçekleştirmek mümkündür, özellikle de uygun bir ifade vektöründe mevcutsa, belirli bir uygulama veya çalışma için LTE tarafından üretilmesi istenen bir florofor füzyonu sağlar (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).

1. 100 μL'lik bir alikotu çözün ve her biri 6.2. adımdan 7 μL kısmen takviye edilmiş lizat, Tablo 2'ye göre 1 μL tamamlama çözeltisi ve 2 μL ultra saf sudan oluşan altı adet 10 μL ekspresyon reaksiyonu ayarlayın reaksiyonda 50 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeterli DNA kontrol şablonu içerir.
2. Reaksiyonları 25 ° C'de 2 saat inkübe edin ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansındaki artışı izleyin.
   NOT: GFP için uygun konfigürasyon değerleri, 485 nm'de (bant genişliği 5 nm) uyarma, 516 nm'de emisyon (bant genişliği 5 nm) ve 2 saat boyunca 1 dakikalık bir okuma aralığıdır.
3. En yüksek eGFP RFU'ya karşılık gelen rNTP.Mg konsantrasyonunu belirlemek için son ifade değerlerini sıralayın. Kinetik veriler mevcutsa, rNTP.Mg fazlalığı, 2 saatlik ekspresyon periyodu boyunca eGFP RFU'da iki fazlı bir artışla da gösterilecektir (Temsili Sonuçlar bölümüne bakınız).
4. Optimize edilmiş tamamlama rNTP.Mg konsantrasyonu belirlendikten sonra, önceki adımlarda kısmen takviye edilen LTE partisini kullanarak bunu diğer tüm protein ifadelerine ekleyin.
   NOT: Adım 6.2'deki alıntılama sabit hacimlerle dikkatli bir şekilde yapılırsa, ekleme, örneğin alikotlar kuru buz üzerine yerleştirilerek, çözülmeden her bir alikot'a geriye dönük olarak eklenebilir. Bu alikotlar artık tamamen desteklenmektedir, çünkü doğru rNTP.Mg doldurma, çözüldüklerinde ve kullanım için karıştırıldıklarında her biri boyunca karıştırılacaktır.

Sonuçlar

Hücresiz protein ekspresyonunun amacı, çok çeşitli uygulamalar için uygun, katlanmış, aktif bir formda tam uzunlukta proteinler üretmektir. LTE (Leishmania tarentolae özütü) daha önce diğer prokaryotik ve ökaryotik hücresiz ekspresyon sistemleriyle karşılaştırılmış ve özellikle E. coli bazlı hücresiz ekspresyon³³ ile karşılaştırıldığında, en iyi şekilde çalışırken kesilme ve agregasyonu önlemek için yüksek bir kapasite göstermiştir. Bununla birlikte, buna daha önce çıktı kalitesinde partiden partiye önemli farklılıklar eşlik ediyordu. Mevcut yöntem, esas olarak LTE'nin alikotlarda ilk dondurulmasından önce gerekli besleme çözeltisinin kısmen eklenmesi yoluyla tutarlı çıktı kalitesi sağlamak için daha fazla iyileştirme içermektedir. Bunu, sonraki her reaksiyona eklenebilen veya donmuş alikotları doğrudan tamamlamak için kullanılabilen bir tamamlama çözeltisinde rNTP.Mg transkripsiyonel girdinin optimizasyonu takip eder. Optimizasyon reaksiyonlarının, proteinleri pratik olarak eksprese etmek için LTE'nin tipik kullanımını temsil etmesi ve reaksiyonların 25 ° C'de 2 saat boyunca gerçekleştirilmesi dikkat çekicidir.

Hücresiz reaksiyonlarda rNTP.Mg konsantrasyonunun optimize edilmesinden elde edilen veriler, temsili bir veri seti sağlar. İfade seviyeleri tipik olarak transkripsiyonel girdi (rNTP.Mg) yükseldikçe artar ve bu da başarılı ifadeyi gösterir. Bununla birlikte, sistemin, özellikle daha büyük proteinler (>50 kDa) söz konusu olduğunda, kesilmiş ürünlerin üretken olmayan ifadesine yöneldiği bir eşiğe ulaşılır. Bu suboptimal ekspresyon, özellikle polipeptitin translasyonunun floroforun kendisine ulaşmadığı C-terminal florofor füzyonlarında belirgin olan, artan rNTP.Mg ile floresan sinyali kaybına yol açar. N-terminal füzyonları için, genel RFU'da (Bağıl Floresan Birimleri) bir azalma, aşırı rNTP.Mg ile mutlaka meydana gelmese de, başarısız ekspresyon, SDS-PAGE jellerinde azalan boyutlarda çoklu floresan ürünler olarak gözle görülür şekilde belirgindir. Bu yaklaşım, numunelerin karıştırıldıktan sonra ısıtılmaması koşuluyla, geleneksel bir SDS-PAGE jeli üzerinde görselleştirildiğinde bile GFP'nin (Yeşil Floresan Protein) floresanı koruma yeteneğinden yararlanır. Bunun yerine, jel yükleme tamponu ile karıştırılır ve doğrudan jel üzerine yüklenir. SDS-PAGE jel malzemeleri ve ekipmanı genellikle birbirinin yerine kullanılabilirken, jel görüntüleyici GFP floresansını görselleştirebilmelidir. GFP görselleştirmesi için tipik bir konfigürasyon, 485 nm'de (bant genişliği 5 nm) uyarma, 516 nm'de emisyon (bant genişliği 5 nm) ve 2 saat boyunca 1 dakikalık bir okuma aralığı ile sağlanır.

Yalnızca eGFP ifadesini kullanarak sistemi optimize etmek mümkündür. Şekil 2A,B (ek), eGFP RFU'nun artan rNTP.Mg konsantrasyonları ile arttığı, maksimum RFU için +0.6x rNTP.Mg ve +0.3x rNTP.Mg'lik optimum bir seviyeye ulaştığı iki LTE partisi için optimizasyon reaksiyonlarının tipik ifade çıktılarını göstermektedir. Azaltılmış rNTP besleme çözümü, 0,6 kat rNTP.Mg içerir ve bu LTE partileri için varsayılan miktarın 1,2 katı ve 0,9 katı toplam rNTP.Mg seviyeleri ile sonuçlanır. Şekil 2C, Şekil 2B'deki LTE partisi için reaksiyon sırasında RFU artışının kinetiğini göstermektedir ve reaksiyon süresi boyunca iki ayrı faz ile iki fazlı bir bifazik reaksiyonu göstermektedir.

Şekil 2: Azaltılmış rNTP 5x FS ile LTE'de rNTP.Mg tamamlama ilavesinin optimizasyonu. (A) Hücresiz ekspresyon reaksiyonunda değişen rNTP.Mg tamamlama seviyelerinde bir kontrol plazmitinden 140 dakikalık ekspresyondan sonra eGFP'nin ekspresyon seviyeleri (n = 3, Ortalama ± SD çizildi). (B) Belirli bir rNTP.Mg eşiğinin ötesinde azaltılmış ifade gösteren farklı bir LTE üretim partisinin optimizasyonu. (C) (B) ile aynı reaksiyonlarda, artan rNTP.Mg doldurma ile eGFP birikiminin kinetiği. Bu veriler aynı zamanda LTE toplu ifadesinde protein birikiminin tipik kinetiğini de temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bununla birlikte, katlanması kolay küçük bir protein (27 kDa) olan eGFP'nin, kullanılan hücresiz ekspresyon sisteminden bağımsız olarak eksprese edilmesi, katlanması ve olgunlaşması muhtemel olduğu unutulmamalıdır. Sistemin arızalanması, ilgilenilen daha büyük proteinleri ifade ederken daha olasıdır ve kesilmiş ürünler 70 kDa'dan daha büyük girdi protein boyutlarında daha belirgin hale gelir³³. Bu nedenle, sistemin gerçek kullanım için amaçlanan protein(ler) ile optimize edilmesi daha üstündür, eGFP hala miktar tayini için mevcuttur, ancak ilgilenilen protein ile bir N-terminal füzyonu olarak.

Şekil 3, kesilmiş ürünler (eGFP-Sox18) vermeye eğilimli daha büyük bir protein şablonu kullanıldığında rNTP.Mg tamamlama seviyesinin tipik bir optimizasyonunu temsil eder. Yarı doğal bir jel SDS-PAGE formatı kullanarak (yani, numuneleri ısıtmadan), ifadenin ilerleyici başarısızlığını görselleştirmek mümkündür. +0,1x'te optimum rNTP.Mg ilavesi (kısmi besleme çözeltisindeki 0,6x rNTP.Mg ile birleştiğinde, toplam 0,7x'tir), toplam floresan ekspresyon ürünlerinin bir parçası olarak tam uzunlukta protein bandının fraksiyonunu belirgin bir şekilde azaltır ve fazla rNTP.Mg ilavesi ile sistem arızasını gösterir.

Protokolde belirtildiği gibi, rNTP.Mg optimizasyon adımını atlamak ve adım 6.2'deki jel filtrasyonundan hemen sonra takviye sırasında tam rNTP.Mg miktarını doğrudan "varsayılan" besleme çözeltisine eklemek mümkündür. Bunu yaparak, protokol esasen LTE³⁴ oluşturmak için yayınlanan orijinal yöntemlere geri döner. Bununla birlikte, yazarlar, Şekil 3'te (Lane D'den Lane E'ye) gösterildiği gibi, sistemin optimum performans için uyarlanmasının, ek protokol karmaşıklığından daha ağır bastığına ve bir protein ekspresyon aracı olarak LTE'nin değerini artırdığına inanmaktadır.

Şekil 3: Kısmen takviye edilmiş LTE'de artan rNTP.Mg yüklemenin eGFP-Sox18 ekspresyonu üzerindeki etkisi. Artan rNTP.Mg yüklemenin eGFP-Sox18 ekspresyonu üzerindeki etkisini gösteren yarı doğal SDS-PAGE jeli. A Şeridi: +0,1x (rNTP.Mg) yükleme, B Şeridi: +0,2x (rNTP.Mg), C Şeridi: +0,3x (rNTP.Mg), D Şeridi: +0,4x (rNTP.Mg). N-terminal eGFP füzyonu, jelin floresan taraması ile görselleştirilir. Şerit A'daki birincil bant, tam uzunlukta eGFP-Sox18'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parça	Stok konsantrasyonu	5x Besleme Çözümü	μL stok/mL 5x Besleme Çözeltisi
		Varsayılan (azaltılmış rNTP)	Varsayılan (azaltılmış rNTP)
Spermidin	100 milyon	1,25 milyon	12
DTT (DTT)	500 milyon	10 milyon	20
Kreatin Fosfat	1000 mM	200 milyon	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 milyon	100 milyon	40
PEG3000	0,5 V/V	0,05 V/V	100
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	120 katı	5 katı	43
Amino Asitler	3,6 mM (adet)	0,68 mM (adet)	190
ATP	100 milyon	8,5 (5,1) milyon	85 (51)
GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası	100 milyon	3,2 (1,9) milyon	32 (19)
UTP	100 milyon	2,5 (1,5) mM	25 (15)
CTP (Otomotiv Teknolojileri T	100 milyon	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Mg(OAc)2	1 milyon	16,7 (10) milyon	16,7 (10)
Ekleme önleyici lider oligo	1 milyon	0,05 mM	50
T7 RNA polimeraz	5 mg / mL	0.5 mg / mL	100
Kreatin Fosfokinaz	5 birim/μL	0,2 birim/μL	42
Ultra saf su			19 (93)

Tablo 1: LTE için 5x besleme çözeltisinin (5x FS) bileşimi. Jel filtrasyonundan sonra her 2,5 mL takviye edilmemiş lizat için 1 mL 5x FS gereklidir. Varsayılan 5x FS ile takviye, 7 μL/10 μL oranında ekspresyon reaksiyonlarında kullanım için ifadeye hazır bir LTE oluşturur. Azaltılmış rNTP.Mg tarifi (italik olarak yazılan miktarlar) LTE ifade optimizasyonu için önerilir ve varsayılan rNTP ve magnezyum seviyelerinin 0,6 katını içerir. Bunlar, Tablo 2'de özetlenen eklemeler kullanılarak sonraki optimizasyon deneyinde değişken seviyelere (0,6 ila 1,1 kat) ayarlanabilir.

rNTP yüklemesi	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 M)	Ultra saf su
(1 μL/10 μL rxn)	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL
+0x	0	0	0	0	0	200
+0,1 kat	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0,2 kat	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0,3 kat	10.2	3.8	3	3	2	178
+0,4 kat	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0,5 kat	17	6.4	5	5	3.3	163

Tablo 2: LTE optimizasyonu için (rNTP.Mg) yükleme çözümlerinin bileşimi. Bu çözeltiler, 10 μL protein ekspresyon reaksiyonu başına 1 μL tamamlama çözeltisi ekleyerek LTE'yi optimize etmek için kullanılır. Optimizasyon deneyinde bir tamamlama seviyesi belirlendikten sonra, aynı LTE toplu alikotları kullanılarak sonraki tüm protein ekspresyon reaksiyonlarına tutarlı bir şekilde eklenebilir. Alternatif olarak, 7 μL'de 1 μL ilavesiyle (çözülmeden) doğrudan alikotlara eklenebilir. Çözüldükten ve karıştırıldıktan sonra, bu lizatlar 10 μL protein ekspresyonu başına 8 μL LTE'de kullanılır ve optimizasyon sırasında belirlenen rNTP.Mg tamamlama seviyesini korur.

Tartışma

LTE oluşturma protokolleri son on yılda^{yayınlanmıştır 7} ve periyodik güncellemelerden geçmiştir^25,34. Bununla birlikte, tekniğe yeni başlayanlar genellikle dik bir öğrenme eğrisi ile karşılaşırlar ve bu da yüksek kaliteli ve yüksek verimli protein ekspresyonunun elde edilmesinde gecikmelere neden olur. LTE³⁵ ile çalışan diğer araştırma grupları tarafından, özellikle partiden partiye önemli farklılıklarla ilgili olarak benzer zorluklar bildirilmiştir. Video tabanlı protokol formatı, potansiyel olarak potansiyel kullanıcılara fayda sağlayan ek, daha az belirgin kurulum bilgisi sağlayabilir³⁴. Başarı olasılığını artırmayı, prosedürü basitleştirmeyi, süreyi azaltmayı ve karmaşıklıkla ilgili hataları en aza indirmeyi amaçlayan protokolde değişiklikler yapılmıştır.

Hücre bozulmasında, hücrelerin nitrojen kavitasyon hücresi bozucusuna yüklenmesi üzerinde hassas kontrol çok önemlidir³⁴. Hücre konsantrasyonu ve yıkamadan sonra yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle bunu başarmak zor olabilir. Orijinal protokollerde, son konsantre kültürün küçük bir hacminin döndürülmesi ve fraksiyonel hücre peletinin miktarının belirlenmesi gibi çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ancak bu protokolde daha basit bir yaklaşım benimsenmiştir. Kültür hasat hacmi ve OD_600nm ölçülür ve bu ölçümler, hücre konsantresi için mililitre cinsinden bir hedef hacim hesaplamak için kullanılır ve istenen nihai OD_600nm'yi 300 olarak hedefler. Bu hesaplama, yıkama sırasında önemli bir hücre kaybının meydana gelmediğini varsayar. Hücre kaybı şüphesi varsa, yıkama sonrası konsantre hücrelerin üçlü seri 1/10 seyreltmesini içeren alternatif bir yöntem kullanılır ve sonuçta 1/1000'lik bir seyreltme ile sonuçlanır. Bu, gerçek konsantrenin OD_600nm'sinin ölçülmesine izin vererek, bozucuya yüklemeden önce hedef OD_600nm = 300'e ulaşmasını sağlar.

Hücre bozucu yüklemenin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesiyle bile, jel filtrelenmiş takviye edilmemiş lizat^34'ün Abs_280nm'si ile belirtildiği gibi, bozulma sonrası lizat protein içeriğinde önemli değişkenlik meydana gelebilir. Bu nedenle, lizat takviyesinden önce Abs_280nm'lik bir ölçüm yapılır ve lizat, bir Abs_280nm = 60 elde etmek için seyreltilir. Protein ekspresyon reaksiyonları sonunda 0.5 v/v lizat içerdiğinden, bu, Abs_280nm = 30 ile standartlaştırılmış bir reaksiyon lizatı ile sonuçlanır. Abs_280nm = 30'dan daha düşük ile yapılandırılan lizat performansı, uzun süreli, düşük ekspresyonlu reaksiyonlar verme eğilimindeyken, Abs_280nm = 30'dan daha büyük değerler daha yüksek ekspresyon verme eğilimindedir, ancak çıktı proteini agregasyonu için artan bir eğilim vardır.

Lizat performans optimizasyonu, isteğe bağlı reaksiyon adımları 7.0-7.3'te lizatı tamamlayan besleme çözeltisindeki transkripsiyonel girdilerin, özellikle rNTP'lerin ve magnezyumun ayarlanmasını içerir. rNTP'lerin ve magnezyumun, LTE²⁵ gibi birleştirilmiş bir transkripsiyon-çeviri sisteminde karmaşık ve çoklu rollere sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, LTE'nin rNTP (mM) + 1.5'te optimum yaklaşık bir magnezyum ekspresyonuna sahip olduğu gösterilmiştir. Lizatın kendisi nihai reaksiyon karışımına 1.5 mM Mg katkıda bulunduğundan, bu, eşmolar rNTP.Mg değiştirerek Mg'yi birlikte optimize etmeden rNTP girişini değiştirmek ve optimize etmek için basit bir yol sağlar.

Lizat performansı, protein ekspresyonu genellikle optimizasyonun tersine döndüğü bir eşiğe kadar artarak, tam uzunlukta proteinler yerine kısa ürünler şeklinde ekspresyon arızalarına neden olan rNTP.Mg artarken önemli farklılıklar gösterir²⁵. Bu nedenle, bu eşiği belirlemek için sistemin nihai optimizasyonu faydalıdır. Orijinal LTE protokolü, sabit bir besleme çözeltisi tarifi kullandı ve bazı Mg optimizasyonu önerildi³⁴. Bu yaklaşım daha sonra daha kapsamlı rNTP optimizasyonu ile değiştirildi. Bununla birlikte, bu yöntem, nihai lizat ekspresyon seviyelerini düşürme eğiliminde olan bir alikot üzerinde optimizasyonu sağlamak için lizatın takviyesiz formda dondurulmasını gerektiriyordu. Bu azalma, jel filtrasyon adımının hemen ardından takviye edilmemiş lizatın ani dondurulması sırasında besleme çözeltisinin kriyoprotektif özelliklerinin kaybına bağlandı. Mevcut protokol, dondurmadan önce azaltılmış rNTP.Mg içeren bir besleme solüsyonu ile takviye ederek bir denge sağlar ve bu, ifade noktasında optimize edilmiş seviyeye kadar tamamlanabilir.

Bu protokol iyileştirmelerinin, birincil varyasyon kaynaklarını azaltarak ve protein ekspresyonu çıktı tutarlılığını iyileştirerek acemi kullanıcılar için LTE sisteminin faydasını artırması bekleniyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PD-10 SuperDex 25 Sütun	Cytiva	17085101	Jel filtrasyon sütunları
Azot Kavitasyon hücre bozucu	Parr Industries	4635 veya 4639	Hücre Bozucu
Sığır türevi Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Kültür katkı maddesi
Penisilin / Streptomisin 10000U / ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiyotik karışımı
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	10ul ekspresyonları için çok kuyulu plaka
Oligonükleotid	IDT sentezi		CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT dizili oligo
Kreatin Fosfokinaz	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzim
Tecan Spark	Tecan		veya benzeri Çok Modlu Plaka Okuyucu
Chemidoc MP Görüntüleyici	Biorad		veya benzeri SDS-PAGE jel Görüntüleyici%
4-12 Bis-Tris Jeller	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE jeller
Biyofotometre	Eppendorf		veya benzeri Cuvette Specrofotometre
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spektrofotometre
Avanti JXN-26 santrifüj	Beckman Coulter		veya benzeri santrifüj, 10K ve 50K dereceli rotorlar/tüpler ile
g 5424R mikrosantrifüj	Eppendorf		veya benzeri mikrosantrifüj, 1.5ml mikrosantrifüj tüplü
Şişe İnkübatörü Inova S44i	Eppendorf		veya benzeri şişe inkübatör çalkalayıcı 5L Şişeler için uygun
5L cam kültür şişeleri			Kültür büyümesi için şaşkın cam şişeler
Bactotryptone	BD	211705	Büyüme ortamı
Maya Özü	Merck	VM930053	Büyüme ortamı
Gliserol			Herhangi bir analitik sınıf
Glikoz			Herhangi bir analitik sınıf
KH2< / sub>PO 4< / sub>			bir analitik sınıf
K 2 < / sub > HPO< sub > 4 < / sub >			Herhangi bir analitik sınıf
UltraPure su	Invitrogen	10977-015	Veya herhangi bir MilliQ tipi su sebilinden çıktı