Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65592

⸱

8 Kasım 2024

 ,  , 
1CSIRO-QUT Synthetic Biology Alliance, Queensland University of Technology, 2ARC Centre of Excellence in Synthetic Biology, Queensland University of Technology, 3Centre for Agriculture and the Bioeconomy, Queensland University of Technology, 4School of Biology and Environmental Science, Queensland University of Technology, 5Centre for Genomics and Personalised Health, Queensland University of Technology

Bu makalede

Özet

Leishmania Translasyonel Ekstrakt (LTE), tek hücreli parazit Leishmania tarentolae'den türetilen ökaryotik hücresiz bir protein ekspresyon sistemidir. Bu optimize edilmiş protokol, LTE'nin üretimini basit ve uygun maliyetli hale getirir. Karmaşık ökaryotik proteinlerin ve bunların etkileşimlerinin çok paralel ekspresyonu ve çalışmasına odaklanan çeşitli uygulamalar için uygundur.

Özet

Bu protokol, Leishmania Translasyonel Özü veya LTE olarak adlandırılan tek hücreli kamçılı Leishmania tarentolae'den türetilen ökaryotik Hücresiz Protein Ekspresyon Sisteminin (CFPS) üretimini ve optimizasyonunu ana hatlarıyla belirtir. Bu organizma başlangıçta bir kertenkele paraziti olarak evrimleşmiş olsa da, şişelerde veya biyoreaktörlerde kolay ve ucuz bir şekilde yetiştirilebilir. Leishmania major'dan farklı olarak, insanlar için patojenik değildir ve özel laboratuvar önlemleri gerektirmez. CFPS için Leishmania kullanmanın bir başka avantajı, CFPS'ye tek bir antisens oligonükleotidin eklenmesinin, tüm protein kodlayan RNA'ların 5'-ucunda korunmuş bir ekleme lideri dizisini hedeflemesinin, endojen protein ekspresyonunu baskılayabilmesidir. Önceki sürümlere kıyasla basitleştirilmiş ve geliştirilmiş hücre bozulması ve lizat işleme için prosedürler sunuyoruz. Bu işlemler basit şişe kültürleri ile başlar. Ek olarak, türden bağımsız translasyon başlatma bölgeleri (SITS) içeren vektörler kullanılarak genetik bilginin nasıl tanıtılacağını ve tutarlı protein ekspresyon kalitesini sağlamak için basit parti optimizasyonu ve kalite kontrolünün nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz.

Giriş

1960'larda, hücresiz protein ekspresyon sistemleri, genetik kodun ortaya çıkarılmasında çok önemli bir rol oynadı1. Bununla birlikte, esas olarak E. coli'ye dayanan prokaryotik hücresiz protein ekspresyon sistemleri, şu anda hem laboratuvar hem de ticari uygulamalara hakimdir. E. coli bazlı sistemler maliyet etkinliği, ölçeklenebilirlik ve yüksek ekspresyon verimi gibi avantajlar sunarken, aktif formlarında çok alanlı proteinler üretirken ve protein komplekslerinin montajını kolaylaştırırkenzorluklarla karşılaşırlar 2,3. Günümüzde, yaygın olarak kullanılan ökaryotik Hücresiz Protein Sentezi (CFPS) formları arasında buğday tohumu özütü (WGE), tavşan retikülosit lizatı (RRL) ve böcek hücresi lizatı (ICL) bulunur4,5,6. Bu çalışma, tek hücreli kamçılı parazit Leishmania tarentolae'ye dayanan, hem basit hem de ölçeklenebilir alternatif bir ökaryotik hücresiz sistemi tanıtmaktadır.

Leishmania tarentolae , uygun maliyetli ortam kullanılarak şişelerde kolayca yetiştirilebilir ve ayrıca daha yüksek hücre yoğunluğu elde etmek için biyoreaktörlerde ölçeklendirilebilir. Hücre lizatında endojen mRNA'ların varlığı, aksi takdirde tanıtılan mesajlarla rekabet edebilecek, korunmuş Leishmania mRNA ek lideri dizisi7'yi hedefleyen antisens oligonükleotidler kullanılarak nötralize edilebilir. İnsan hastalığına neden olan yakın akrabası Leishmania majörden farklı olarak L. tarentolae , mağribi kertenkeleyi (Tarentolae mauritanica) enfekte ederek, özel önlemlere ihtiyaç duymadan PC2 laboratuvar ortamlarında yetiştiriciliğe uygun hale getirir. Daha önce in vivo protein ekspresyonu8 için transgenik bir organizma olarak kullanılmıştır.

Hücresiz sistemlerde şablon hazırlamayı kolaylaştırmak için, translasyonel başlatmayı geliştiren polimerik RNA yapılarına dayalı olarak evrensel diziler tasarlanmıştır9. Bu türden bağımsız çeviri dizileri (SITS) hem prokaryotik hem de ökaryotik hücresiz sistemlere uygulanabilir ve genetik bilgiyi LTE'ye dahil etmek için uygundur. Bu protokol, LTE hücresi içermeyen protein ekspresyonu için vektör yapımının ayrıntılı bir açıklamasını sağlamasa da, optimizasyon ve kalite kontrolü, SITS bölgesinin aşağı akışında istenen ilgili proteinlerin florofor füzyonlarını içeren uygun vektörler gerektirir. Bu amaçla, Ağ Geçidi klonlama bölgeleri kullanılarak istenen ilgilenilen proteine bir N-terminal eGFP füzyonunu kodlayan pCellFree_G03 vektör gibi uygun LTE vektörleri Addgene gen deposu ile biriktirilmiştir.

LTE, protein kendi kendine montajınınanalizi 10,16, insan integral zar proteinlerinin üretimi17, antiviral ilaç adaylarıüzerinde araştırma 18, biyoteknolojik olarak yararlı enzimlerin geliştirilmesi19, protein biyosensörlerininprototiplenmesi 20,21 ve kancalı kurtlardan elde edilen biyolojiklerin incelenmesi22 dahil olmak üzere protein ekspresyonu gerektiren çok çeşitli uygulamalarda değerini kanıtlamıştır. LTE, viroloji ve hücresel yapılar alanlarında Protein-Protein etkileşim ağlarının haritalanmasında da etkili olmuştur21,32. LTE, daha uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim sunarken, tam uzunlukta, tek dağılmış ve toplanmamış proteinleri33 ifade etmede diğer ökaryotik hücresiz sistemlere benzer şekilde performans gösterecek şekilde kıyaslanmıştır.

Bu protokol, konakçı organizmayı yetiştirmek ve bozmak, lizat hazırlamak ve birleştirilmiş transkripsiyon / translasyon protein ekspresyonu için bir besleme çözeltisi (FS) takviyesi için teknikler sağlar. Ek olarak, üretim partilerini optimize etmek için bir protokol içerir. Leishmania hücresiz sisteminin ilk versiyonunda, ekspresyon seviyelerinde, tam uzunlukta proteinlerin fraksiyonunda ve protein agregatlarının varlığında istenmeyen partiden partiye varyasyon gözlendi ve bu da partilerinatılmasına yol açtı 34. Bu sorunu gidermek için daha sonraki protokol iyileştirmeleri yapıldı25. Mevcut protokol, bu iyileştirmeler üzerine inşa edilmiştir ve bireysel partilerin en yüksek protein ekspresyonu ve boyutu için optimize edilmesine izin verir. Bunu, hücre bozucu yüklemeyi yakından kontrol ederek (600 nm'de optik yoğunluk olarak ölçülür; OD600nm) ve 280 nm'de (Abs280nm) absorbans kullanarak elde edilen lizat çıkışını normalleştirmek. Ayrıca, üretim sırasında lizatın kısmen rNTP ve magnezyum ile desteklenmesi için bir yöntem içerir ve daha sonra test ifadeleri sırasında bu besleme çözeltisi bileşenlerinin optimizasyonu yapılır. Bu optimizasyon protokolde bir seçenek olarak sunulsa da yazarlar tarafından şiddetle tavsiye edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, kültürlemeyi, santrifüjlemeyi, çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansının ölçülmesini, OD600nm kültürünün ölçülmesini ve lizat Abs280nm'nin değerlendirilmesini içeren ayrıntılı ortam tariflerini ve adımlarını içerir. Ayrıca SDS-PAGE protein jellerinin kurulumunu ve görüntülenmesini de kapsar. Bu protokol için gerekli olan veya önerilen malzemeler, Malzemeler elektronik tablosunda listelenmiştir. Ortam bileşenleri, santrifüjler, tüpler, spektrofotometreler ve jel elektroforez kurulumları gibi tipik laboratuvar kaynaklarının, aksi belirtilmedikçe büyük olasılıkla birbirinin yerine kullanılabileceğini unutmamak önemlidir. Şekil 1 , LTE üretim sürecinin bir özetini sağlar.

figure-protocol-1
Şekil 1: LTE üretim protokolüne genel bakış. Bu karikatür, LTE üretim protokolünün kısa bir özetini sunmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Leishmania tarentolae kültürlerinin büyümesi

  1. En az 3 L TBGG büyüme ortamı hazırlayın (Baktotripton 12 g/L, Maya özütü 24 g/L, gliserol 8 mL/L, glikoz 1 g/L, KH2PO4 2,3 g/L, K2HPO4 2,5 g/L, bkz . Ortamı vakum veya benzer bir kurulum altında 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
  2. Ortamı oda sıcaklığında (RT) saklayın, son ilaveler (Hemin, Antibiyotikler) L. tarentolae ile aşılamadan hemen önce eklenir. Hemin (% 50 trietanolamin içinde% 0.25 v / v),% 0.2 v / v, Penisilin (10.000 birim / mL) artı Streptomisin (10.000 μg / mL)% 0.5 v / v'de karıştırılır.
    NOT: Bu protokolün başlangıç noktası, bakımı yapılan 2 x 10 mL'lik yabani tip L. tarentolae kültürüdür. Bakım kültürleri 27 °C'de standart 50 mL'lik doku kültürü şişelerinde düşük çalkalama (75 rpm) ile büyütülür. Bu tür 10 mL kültürler, her 2-3 günde bir steril (TBGG + hemin, penisilin, streptomisin) içinde ~ 1/20 seyreltme ile süresiz olarak korunabilir. Bir PC2 laboratuvarında standart bir biyogüvenlik kabini tavsiye edilir; bununla birlikte, bakteriyel kontaminasyonlar eklenen antibiyotikler tarafından önlenme eğilimindeyken, mantar kontaminasyonları genellikle L. tarentolae tarafından büyütülür.
  3. İki gün boyunca, L. tarentolae bakım kültürlerini 200 mL'ye (1. gün) ve daha sonra her gün artan hacimde TBGG + hemin / antibiyotik ile 1: 10 dilüsyon yoluyla 2 L'ye (2. gün) genişletin. Her iki seyreltmeyi de otoklavla sterilize edilmiş şaşkın 5 L'lik cam şişelerde (maksimum 1 L'ye kadar doldurulmuş) gerçekleştirin. İkinci seyreltme, ertesi gün saat 8-11 arasında lizat üretimine başlamak amacıyla öğleden sonra 3-6 arasında yapılmalıdır.
    NOT: Bu protokol, LTE üretimi için minimum başlangıç hacmini kullanır (2 x 1 L kültür). Ek bir genişletme adımı dahil ederek LTE üretimi için kültürü 10 L'ye kadar genişletmek de mümkündür (örneğin, Gün 1: 100 mL; 2. Gün: 1 L; 3. Gün: 10 L). Bu protokol, L. tarentolae'yi büyütmek için şaşkın şişeler (Malzeme Tablosuna bakınız) kullansa da, isteğe bağlı olarak, karıştırma hızının 100 rpm'nin altında tutulması koşuluyla, Rushton çarkları ile bakteri üremesi için tasarlanmış geleneksel biyoreaktörler kullanılabilir. Biyoreaktörlerde iyileştirilmiş havalandırma ve pH kontrolü genellikle L. tarentolae kültürlerinin log fazı büyümesini uzatır ve adım 1.4'te kullanılmak üzere600 nm'lik daha yüksek bir hasat OD 10'a izin verir.
  4. Kültürün OD600nm'sini doğrudan spektrofotometre küvetinde TBGG'de 1:10 seyreltme yoluyla üç kopya halinde kaydedin. Lizat yapmak için uygun bir başlangıç aralığı OD600nm = 4.0-8.0'dır.
  5. OD600nm < 4.0 ise ek inkübasyon süresi sağlayın. OD600nm > 8'e sahip bir kültür kullanılabilir ve daha fazla hacimde hücresiz ekspresyon lizatı ile sonuçlanacaktır, ancak geç log büyüme fazının başlaması nedeniyle daha düşük kaliteye sahiptir. Kültür şişelerini buzun üzerine yerleştirin ve sonraki adımları bekleyin.
    NOT: Nihai kültür OD600nm'nin doğru ölçümü, bozulmadan önce konsantre hücreler için nihai hacmi hesaplamak için kullanıldığından kritik öneme sahiptir. Bu hesaplama, protokolü basitleştirmek için kesinti34'ten önce hücre konsantrasyonunu kalibre etmek için LTE üretiminin önceki sürümlerinde kullanılan bir pelet tartım yönteminin yerini alır. OD600nm ölçümü için TBGG'de seyrelttiğinizden emin olun, aksi takdirde ozmotik şok hücre şeklini değiştirerek ölçüm hatasına neden olur. Pipet, spektrofotometrik okumayı yapmadan saniyeler önce OD600nm ölçümü için (doğrudan küvette) 1:10 seyreltmeyi karıştırın, çünkü L. tarentolae hücreleri belirgin bir bulutlu görünümle hızla yerleşir. İfade kültürünün nihai hacminin yaklaşık olduğu kabul edilirse, daha iyi bir tahmini hacim elde etmek için (1 g = 1 mL'de) hasatta şişelerin (uygun boş şişe dara ile) tartılması da önerilir. Şaşkın şişelerde L. tarentolae büyümesinden mümkün olan maksimum OD600nm 15-20'dir, ancak bu, sabit faza ulaşması nedeniyle lizat üretimi için uygun değildir.

2. L. tarentolae kültürlerinin konsantrasyonu

  1. Leishmania hücreleri, bozulmadan yaklaşık 60 kat önce yıkanmalı ve konsantre edilmelidir. Son konsantre için OD600nm = 300'e dayalı hücre konsantrasyonu için hedef hacmi hesaplayın. Denklem V = hasat hacmi (mL) x (hasat OD600nm/300). Örneğin, hasat OD600 = 5 olan 2 L'lik bir kültür kullanıldığında, hedef hacim 33 mL'dir.
    NOT:300'lük OD 600nm hedefi değiştirilebilir; önceki LTE üretiminde 150-350 aralığında değerler kullanılmıştı. Bozulmaya giren daha yüksek hücre konsantrasyonları, daha yüksek protein verimleri ile nihai hücresiz ekspresyon reaksiyonları verme eğiliminde olacaktır, ancak savunmasız proteinlerin toplanma eğilimi artacaktır. OD600nm = 300, LTE üretimi için uygun bir varsayılan hedefi temsil eder.
  2. Hasat edilen kültürleri uygun santrifüj şişelerine aktarın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 2500 x g'da döndürün. Süpernatanı dikkatlice kültür atığına boşaltın.
    NOT: Bozulma yüklemesinin hesaplanmasını etkilediğinden, atılan süpernatanta hücre kaybını en aza indirmek önemlidir. Önceki LTE üretim protokollerinde, bozulma için L. tarentolae hücrelerinin konsantrasyonu, hücre konsantresinin bir test mikrosantrifüj tüpünde döndürülmesi ve toplam ağırlığakarşı pelet ağırlığının ölçülmesiyle kalibre edildi 34. Bu basitleştirilmiş protokol bunun yerine, ölçülen hasat OD600nm'ye dayalı olarak konsantre için teorik bir OD600nm hedefi kullanır ve hücre konsantrasyonu ve yıkama sırasında düşük hücre kaybını varsayar.
  3. Hücre peletini SEB tamponunda (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM sükroz, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2, buz üzerinde tutulur) üç kez yıkayın, her seferinde 2500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. İlk yıkama için, her 1 L peletlenmiş kültürü 100 mL SEB tamponunda yeniden süspanse edin, ardından bunları tek bir santrifüj şişesinde birleştirin. İkinci yıkama için, orijinal kültürün her 1 L'si için 100 mL SEB kullanın.
    NOT: Son pelet yeniden süspansiyonu için, nihai hedef yeniden süspansiyon hacminin P'sine SEB tamponu ekleyin (adım 2.1). Bu, havuzlanan konsantrenin adım 2.4'teki tam olarak nihai hedef hacme kadar dikkatli bir şekilde doldurulmasını sağlar. L. tarentolae'nin erken parçalanmasını önlemek için her bir yeniden süspansiyon mümkün olduğunca yumuşak olmalıdır, örneğin, eklenen SEB'yi boşaltılan peletin etrafında hafifçe döndürerek veya SEB'yi santrifüj tüpü duvarına yapışan pelet üzerine pipetleyerek. Son adım için süpernatantları daha küçük santrifüj tüplerine aktarmak daha uygun olabilir.
  4. Yeniden süspanse edilmiş konsantreyi uygun bir yıkanmış cam hacimsel silindire dökün, ardından ilave soğuk SEB kullanarak hacmi hedef hacme (adım 2.1) doldurun ve hafifçe karıştırın.

3. L. tarentolae konsantresinin parçalanması

  1. Hücre konsantresini önceden 4 °C'ye soğutulmuş nitrojen kavitasyon cihazına aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız), 70 bar nitrojene basınçlandırın ve buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
    NOT: Nitrojen kavitasyon bozucular yaygın laboratuvar öğeleri olmasa da, LTE üretimi için önerilir. Hücresel donma-çözülme ve French-press tipi bozucular gibi alternatif yöntemler denenmiş; Bununla birlikte, protein ekspresyon aktivitesi, nitrojen kavitasyon yönteminin kullanılmasına kıyasla% <50 idi. Nitrojen kavitasyon cihazı, bu adımdan itibaren hücre lizatı ile temas eden tüm yeniden kullanılan kaplara (alıcı şişesi gibi) benzer şekilde, kullanımdan önce ve çalışmalar arasında iyice temizlenmelidir. Uygun bir temizleme rejimi, laboratuvar deterjanları ile yıkamayı ve ardından deiyonize su ile iyice durulamayı içerir.
  2. Nitrojen kavitasyon cihazındaki havalandırma deliğini açın ve elde edilen lizatı buz üzerinde bir vakum alıcı şişesi gibi uygun şekilde sağlam bir kaba boşaltın. Elde edilen tüm lizatın çökeldiğinden ve yeni bir santrifüj tüpüne veya benzer bir kaba pipetlenebildiğinden emin olmak için alıcı şişesini eğin.
    DİKKAT: Nitrojen kavitasyon bozucular, hücre konsantresinin 70 bar nitrojenden ortam basıncına ani geçişine dayanır, bu da cihazın çıkış valfinden güçlü bir önce sıvı ve ardından nitrojen akışıyla elde edilir. Havalandırma, kimyasal güvenlik başlığında uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ile yapılmalıdır. Hedef kabın kırılma ve lizatı kaybetme riski vardır, bu nedenle jenerik bir şişe yerine sağlam bir vakum alıcısı kullanıyoruz. Cihazın çıkış valfi bir tüp ise, havalandırma noktasında aşırı basınç oluşmasını önlemek için tüpü doğrudan alıcının içine yerleştirmekten kaçının.

4. Hücre lizatının santrifüjlenmesi

  1. Lizatı uygun g kuvvetine dayanıklı santrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı taze, benzer santrifüj tüplerine çıkarın.
  2. Lizatı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından son süpernatanı taze bir santrifüj tüpüne veya buz üzerine yerleştirilmiş benzer bir kaba çıkarın. Toplam hacmi tahmin edin.

5. Hücre lizatının jel filtrasyonu

NOT: Jel filtrasyonu, SEB tamponunda bulunan sakarozun çıkarılması için kullanılır. Sükroz, hücre bozulması sırasında hücresel mekanizmanın stabilize edilmesine yardımcı olurken, protein ekspresyon reaksiyonlarında tutulursa verimi düşürür.

  1. Yeterli sayıda PD-10 yerçekimi beslemeli jel filtrasyon kolonunu (Malzeme Tablosuna bakınız), bir toplama tepsisine veya altındaki benzer bir kaba damlamalarına izin veren bir raf biçiminde kurun ve tüm lizat hacmini sütun başına 2,5 mL'de filtreleyebilmelerini sağlayın. Kolonları önceden 10 mL 4 °C EB tamponu (45 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)2) geçirerek önceden dengeleyin.
    NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımların 4 °C soğuk odada gerçekleştirilmesi avantajına sahiptir. Bununla birlikte, tüm lizatları ve reaktifleri bir tezgah üstü buz tepsisinde tutmak da uygundur. Bunun bir istisnası, yazarların yeniden tamponlama sırasında 4 °C'lik bir buzdolabının içine bir sütun rafı yerleştirdiği jel filtreleme adımıdır. Bu protokolün orijinal versiyonlarında, yeni jel filtrasyon kolonları, başlangıçta lizatı tamponlayarak ve ilk çıktıyı atarak 'bloke edildi'. Bu gerekli görülmese de, kolonlar EB tamponu ile yıkanmalı ve lizat partileri arasında 4 °C'de saklanmalıdır. İlk çıkış lizatı, yeni kolon üzerinde lizat bileşenlerinin bir miktar arka planda tutulması nedeniyle sonraki çıktılardan daha düşük protein ekspresyon aktivitesine sahip olabilir.
  2. Her sütuna 2,5 mL lizat ekleyin ve sütuna geçene kadar bekleyin. Elüatı atarken lizatı kolona çökeltmek için ek bir 0.5 mL EB ekleyin.
  3. Her sütuna ek 2,5 mL EB ekleyerek jel filtreli lizatı elute edin, çıktıyı sütunların altına taze, temiz bir tepsi veya başka bir kap yerleştirerek toplayın.

6. Hücre lizatının takviyesi

  1. Jel filtreli lizatın Abs280nm'sini ölçmek için nanodrop spektrofotometresini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. 60'ı aşarsa, ek 4 °C EB tamponu kullanarak Abs280nm = 60'a ulaşacak şekilde seyreltin.
    NOT: OD600nm kullanılarak bozulmaya hücre yoğunluğu girişini kontrol ederken, lizat çıkış gücünü yaklaşık olarak belirlerken, lizat bozulması ve işlemeden sonra Abs280nm'yi normalleştirmek, lizat performansının toplu tutarlılığını daha da iyileştirir. Lysate Abs280nm , protein ekspresyonu verimi ve agregasyonu için sonuçlarla birlikte yukarı ve aşağı ayarlanabilir. Takviye edilmemiş lizat, bir Abs280nm < 60'ı gösteriyorsa, bozulma adımına daha fazla Leishmania biyokütlesi dahil etmek, yani hücre bozucu yüklemesini adım2.1'de OD 600nm > 300'e çıkarmak gerekebilir.
  2. 5x Besleme Çözeltisi (5x FS, Tablo 1) lizata 2: 5 oranında ekleyin ve iyice karıştırın. Uygun kaplara (örneğin, 1,5 mL mikrofüj tüpleri) koyun ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Aşağıdaki LTE ifade optimizasyonu için isteğe bağlı 7.1-7.3 adımları izleniyorsa, varsayılan 5x FS yerine Tablo 1'deki azaltılmış rNTP.Mg 5x FS'yi kullanın. Optimizasyon deneylerinde kullanılmak üzere dondurma için 5 x 100 μL'lik alikot ekleyin.
    NOT: 2:5 oranında varsayılan 5x FS ile dondurma, 7 μL/10 μL ekspresyonda kullanılan, ifadeye hazır takviyeli LTE oluşturur (bu nedenle, 5x FS, son reaksiyonda 1x FS olur). Bununla birlikte, yazarlar, 5x FS'de varsayılan rNTP ve magnezyum miktarının 0,6 katının sağlandığı diğer isteğe bağlı adımların izlenmesini önermektedir. Bunu, test reaksiyonlarını optimize edilmiş bir değere tamamlamak için ikisinin eşmolar bir karışımının (rNTP.Mg olarak adlandırılır) eklendiği bir optimizasyon adımı izler. Kısmi 5x FS ayrıca endojen mRNA ekspresyonunu kapatan bir oligonükleotid içerir (Giriş bölümüne bakınız). Oligonükleotidin dizisi CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT'dir.

7. Kalite kontrol ve son takviyeli LTE'nin optimizasyonu

NOT: İndirgenmiş rNTP ve magnezyum takviyeli lizata rNTP.Mg'in uygun 'tamamlama' ilavesini belirlemek için gerekli minimum adımlar, bir füzyon partneri olmadan eGFP veya benzer bir floroforun (örn., sfGFP) eksprese edilmesini içerir. İfade seviyesinin (çok modlu bir plaka okuyucu aracılığıyla eGFP RFU olarak ölçülür) optimize edildiği noktayı belirlemek için reaksiyonlara artan rNTP.Mg konsantrasyonları eklenir. Floresan olmayan eGFP'nin erken sonlandırılması, çok yüksek rNTP.Mg konsantrasyonlarında eGFP RFU'nun azalmasıyla belirginleşir. Bununla birlikte, LTE'nin kısa ürün arızaları, daha büyük eksprese edilen proteinlerde (>50 kDa) daha sık görülür. Bu nedenle, bu optimizasyonu eGFP'den daha büyük bir şablon kullanarak gerçekleştirmek mümkündür, özellikle de uygun bir ifade vektöründe mevcutsa, belirli bir uygulama veya çalışma için LTE tarafından üretilmesi istenen bir florofor füzyonu sağlar (Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).

  1. 100 μL'lik bir alikotu çözün ve her biri 6.2. adımdan 7 μL kısmen takviye edilmiş lizat, Tablo 2'ye göre 1 μL tamamlama çözeltisi ve 2 μL ultra saf sudan oluşan altı adet 10 μL ekspresyon reaksiyonu ayarlayın reaksiyonda 50 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için yeterli DNA kontrol şablonu içerir.
  2. Reaksiyonları 25 ° C'de 2 saat inkübe edin ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresansındaki artışı izleyin.
    NOT: GFP için uygun konfigürasyon değerleri, 485 nm'de (bant genişliği 5 nm) uyarma, 516 nm'de emisyon (bant genişliği 5 nm) ve 2 saat boyunca 1 dakikalık bir okuma aralığıdır.
  3. En yüksek eGFP RFU'ya karşılık gelen rNTP.Mg konsantrasyonunu belirlemek için son ifade değerlerini sıralayın. Kinetik veriler mevcutsa, rNTP.Mg fazlalığı, 2 saatlik ekspresyon periyodu boyunca eGFP RFU'da iki fazlı bir artışla da gösterilecektir (Temsili Sonuçlar bölümüne bakınız).
  4. Optimize edilmiş tamamlama rNTP.Mg konsantrasyonu belirlendikten sonra, önceki adımlarda kısmen takviye edilen LTE partisini kullanarak bunu diğer tüm protein ifadelerine ekleyin.
    NOT: Adım 6.2'deki alıntılama sabit hacimlerle dikkatli bir şekilde yapılırsa, ekleme, örneğin alikotlar kuru buz üzerine yerleştirilerek, çözülmeden her bir alikot'a geriye dönük olarak eklenebilir. Bu alikotlar artık tamamen desteklenmektedir, çünkü doğru rNTP.Mg doldurma, çözüldüklerinde ve kullanım için karıştırıldıklarında her biri boyunca karıştırılacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücresiz protein ekspresyonunun amacı, çok çeşitli uygulamalar için uygun, katlanmış, aktif bir formda tam uzunlukta proteinler üretmektir. LTE (Leishmania tarentolae özütü) daha önce diğer prokaryotik ve ökaryotik hücresiz ekspresyon sistemleriyle karşılaştırılmış ve özellikle E. coli bazlı hücresiz ekspresyon33 ile karşılaştırıldığında, en iyi şekilde çalışırken kesilme ve agregasyonu önlemek için yüksek bir kapasite göstermiştir. Bununla birlikte, buna daha önce çıktı kalitesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

LTE oluşturma protokolleri son on yıldayayınlanmıştır 7 ve periyodik güncellemelerden geçmiştir25,34. Bununla birlikte, tekniğe yeni başlayanlar genellikle dik bir öğrenme eğrisi ile karşılaşırlar ve bu da yüksek kaliteli ve yüksek verimli protein ekspresyonunun elde edilmesinde gecikmelere neden olur. LTE35 ile çalışan diğer araştırma grupları tarafından, özellikle partiden partiye...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Rekabet eden hiçbir finansal çıkar mevcut değildir.

Teşekkürler

Yazarlar, son 10 yılda LTE sistemlerinin geliştirilmesine katkıda bulunan birçok Alexandrov laboratuvar üyesine, özellikle de sisteme öncülük eden ve SITS ribozom giriş alanını geliştiren Sergey Mureev'e teşekkür etmek istiyor. Şekil 1 , Biorender.com tarafından oluşturulmuş ve lisans altında çoğaltılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PD-10 SuperDex 25 SütunCytiva17085101Jel filtrasyon sütunları
Azot Kavitasyon hücre bozucuParr Industries4635 veya 4639Hücre Bozucu
Sığır türevi HeminSigma-AldrichH5533Kültür katkı maddesi
Penisilin / Streptomisin 10000U / mlThermo-Fisher15140122Antibiyotik karışımı
Optiplate 384Perkin-Elmer600729010ul ekspresyonları için çok kuyulu plaka
OligonükleotidIDT sentezi  CAATAAAGTACAGAAACTGATAC
TTATATAGCGTT dizili oligo
Kreatin FosfokinazSigma-Aldrich9001-15-4Enzim
Tecan SparkTecanveya benzeri Çok Modlu Plaka Okuyucu
Chemidoc MP GörüntüleyiciBioradveya benzeri SDS-PAGE jel Görüntüleyici%
4-12 Bis-Tris JellerInvitrogenNW04125SDS-PAGE jeller
BiyofotometreEppendorfveya benzeri Cuvette Specrofotometre
Nanodrop OneThermofisherNanodrop spektrofotometre
Avanti JXN-26 santrifüjBeckman Coulterveya benzeri santrifüj, 10K ve 50K dereceli rotorlar/tüpler ile
g 5424R mikrosantrifüjEppendorfveya benzeri mikrosantrifüj, 1.5ml mikrosantrifüj tüplü
Şişe İnkübatörü Inova S44iEppendorfveya benzeri şişe inkübatör çalkalayıcı 5L Şişeler için uygun
5L cam kültür şişeleriKültür büyümesi için şaşkın cam şişeler
BactotryptoneBD211705Büyüme ortamı
Maya ÖzüMerckVM930053Büyüme ortamı
GliserolHerhangi bir analitik sınıf
GlikozHerhangi bir analitik sınıf
KH2< / sub>PO 4< / sub>bir analitik sınıf
K 2 < / sub > HPO< sub > 4 < / sub >Herhangi bir analitik sınıf
UltraPure suInvitrogen10977-015Veya herhangi bir MilliQ tipi su sebilinden çıktı
Herhangi

Kaynaklar

  1. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).
  2. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  3. Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements. Metab Eng. 38, 370-381 (2016).
  4. Ezure, T., et al. Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing. Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).
  5. Harbers, M. Wheat germ systems for cell-free protein expression. FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).
  6. Kobs, G. Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals. Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).
  7. Kovtun, O., et al. Leishmania cell-free protein expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  8. Basile, G., Peticca, M. Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae. Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).
  9. Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression. Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).
  10. Gambin, Y., et al. Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC. J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).
  11. Sierecki, E., et al. Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).
  12. Sierecki, E., et al. Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence. Sci Rep. 6, 37630(2016).
  13. Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein. Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).
  14. Gambin, Y., et al. Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae. Elife. 3, e01434(2013).
  15. Ve, T., et al. Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).
  16. Guo, Z., et al. Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes. PLoS One. 8 (12), e81534(2013).
  17. Ruehrer, S., Michel, H. Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers. Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).
  18. Varasteh Moradi, S., et al. Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins. J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).
  19. Gagoski, D., et al. Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases. J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).
  20. Ergun Ayva, C., et al. Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches. J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).
  21. Lau, D., et al. Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).
  22. Ryan, S. M., et al. Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).
  23. McMahon, K. A., et al. Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis. Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).
  24. Sierecki, E., et al. A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro. Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).
  25. Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions. Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).
  26. Jung, W., et al. Cell-free formation and interactome analysis of caveolae. J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).
  27. Fontaine, F. R., et al. Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach. MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).
  28. Overman, J., et al. Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice. Elife. 6, e21221(2017).
  29. Kubala, M. H., et al. Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).
  30. Han, S. P., et al. Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens. J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).
  31. Das Gupta, K., et al. Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2. Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).
  32. Leitão, A. D. G., et al. Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein. BioRxiv. , (2021).
  33. Gagoski, D., et al. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  34. Johnston, W. A., Alexandrov, K. Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae. Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).
  35. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Leishmania Tarentolae EkstraktıProtein Ekspresyon OptimizasyonuÖkaryotik Hücreden Arındırılmış SistemAzot KavitasyonuJel FiltrasyonuParti Kalite KontrolüProtein KatlanmasıMultiplex Protein Sentezi
Rekombinant Protein Üretimi için Leishmania Tarentolae Türetilmiş Hücresiz Protein Ekspresyon Sistemi olan LTE'nin Üretimi ve Optimizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.