Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Burada, karaciğer mimarisini bozmadan, ancak karaciğer dışı faktörlerin yokluğunda karaciğer metabolizmasının akut ve doğrudan regülasyonunu incelemek için fare karaciğerinin yerinde perfüzyonu için sağlam bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

Karaciğer, besin metabolizması da dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyona sahiptir. Diğer in vitro ve in vivo karaciğer araştırma modellerinin aksine, izole edilmiş perfüze karaciğer, karaciğer biyolojisi ve metabolizmasının, karaciğer dışı faktörlerin etkisinden ayrılmış, bozulmamış bir hepatik mimari ile tüm karaciğerde incelenmesine izin verir. Karaciğer perfüzyonları başlangıçta sıçanlar için geliştirilmiştir, ancak yöntem farelere de uyarlanmıştır. Burada fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir protokol tarif ediyoruz. Karaciğer, oksijenli Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile portal venden antegrad olarak perfüze edilir ve çıktı, devreyi kapatmak için infrahepatik inferior vena kavanın klemplenmesi ile suprahepatik inferior vena kavadan toplanır. Bu yöntem kullanılarak, bir test bileşiğinin doğrudan hepatik etkileri, ayrıntılı bir zaman çözünürlüğü ile değerlendirilebilir. Karaciğer fonksiyonu ve canlılığı en az 3 saat boyunca stabildir ve aynı deneye iç kontrollerin dahil edilmesine izin verir. Bu modeli kullanan deneysel olasılıklar çoktur ve karaciğer fizyolojisi ve karaciğer hastalıkları hakkında fikir verebilir.

Introduction

Karaciğer metabolizmada önemli bir organdır. Glikoz, lipid ve amino asit metabolizmasını düzenleyerek tüm vücut enerji dengesinin kontrolünde anahtar rol oynar. Dünya çapında karaciğer hastalıklarındaki artış, önemli bir küresel sağlık yükü olarak ortaya çıkmaktadır ve patofizyoloji ve karaciğer fonksiyonları üzerindeki sonuçları hakkında daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır.

İn vivo çalışmaları tamamlamak için karaciğer araştırmaları için çeşitli in vitro modeller geliştirilmiştir. Kemirgenlerden ve insanlardan izole edilmiş ve kültürlenmiş primer hepatositler yaygın olarak kullanılmaktadır. Parankimal olmayan hücreler, diferansiyel ve gradyan santrifüjleme kullanılarak hepatositlerden ayrılabilir ve farklı hücre tiplerinin ko-kültürü, hücreler arası karışma^1’i incelemek için yararlıdır. Primer insan hepatositleri, ilaç toksisitesini test etmek için altın standart olarak kabul edilse de, birkaç çalışma, hepatositlerin doku kültüründe hızla farklılaştığını ve bunun sonucunda hepatik fonksiyonların kaybına neden olduğunu göstermiştir ^2,3,4. 3D sferoid sistemdeki hepatosit kültürü, farklılaşmayı iyileştirir, daha kararlıdır ve karaciğeri in vivo olarak geleneksel 2D kültür sistemlerinden daha yüksek derecede taklit ediyor gibi görünmektedir⁵. Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri, doku mimarisini sağlam tutan ve karaciğerde bulunan parankimal olmayan hücreleri içeren bir başka köklü in vitro modeldir⁶. Daha gelişmiş in vitro modeller arasında çip üzerinde karaciğer⁷ ve karaciğer organoidleri⁸ bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yaklaşımlarla, vektörel portal-hepatik ven akışı da dahil olmak üzere yapısal bütünlük ve akış dinamiklerinde bir kayıp vardır ve bu da genellenebilirliği büyük olasılıkla etkiler.

İzole perfüze sıçan karaciğeri ilk olarak 1855’te Claude Bernard tarafından^{tanımlanmıştır 9} ve hala karaciğer biyolojisi, toksikoloji ve patofizyoloji çalışmaları için çeşitli bilimsel alanlarda kullanılmaktadır. Perfüze karaciğerin yukarıda belirtilen in vitro modellere göre avantajları arasında hepatik mimarinin korunması, vasküler akış, hepatosit polaritesi ve zonlaması ve hepatositler ile parankimal olmayan hücreler arasındaki etkileşimler yer alır. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontrol ile karaciğer metabolizmasının izole bir şekilde incelenmesine izin verir. ^10,11,12,13 yıllarında sıçan karaciğer perfüzyon modelini geliştirmek için çeşitli değişiklikler yapılmıştır. İzole perfüze karaciğer çalışmaları için fareler kullanılmış olsa da, daha az literatür mevcuttur. Burada, fare karaciğerinden gelen hepatik venöz atık suda gerçek zamanlı olarak ölçülen metabolik substratlara ve hormonlara akut ve doğrudan metabolik yanıtları incelemek için portal ven ve suprahepatik vena kava inferiorunun kanülasyonu ile fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Çevre ve Gıda Bakanlığı (izin 2018-15-0201-01397) ve yerel etik komitesinin izniyle 2010/63/EU sayılı AB direktifi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (yayın No. 85-3) ve hayvan deneylerini düzenleyen Danimarka mevzuatının yönergeleri izlenerek gerçekleştirilmiştir (1987). Bu terminal bir prosedürdür ve ölüm nedeni derin anestezi altında diyaframın kansızlaşması ve delinmesidir. 1. Deney hayvanları İstenilen suş, yaş ve cinsiyete sahip fareler elde edin. Bu çalışmada 11-16 haftalık erkek C57BL / 6JRj fareleri kullanılmıştır. Kafes başına 5 adede kadar erkek veya 8 dişi fareyi, yem ve suya ad libitum erişimi ile barındırın ve sabah 6’dan akşam 6’ya kadar ışıklar açıkken 12 saat/12 saat aydınlık-karanlık döngüsünü sürdürün. 2. Ameliyat öncesi hazırlıklar Karaciğer perfüzyon tamponu yapın.Krebs-Henseleit Tamponu. 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/LMgSO4 ve 1,2 mmol/L KH2PO4’ü dH2O içinde karıştırın ve çözün. 25 mmol/L NaHCO3’ü çözün ve karıştırırken tampona yavaşça ekleyin. Tamponu 4 derecede saklayın. Tampon en az 1 ay stabildir.NOT: CaCl2 ve NaHCO3 eklenmeden önce ayrı ayrı çözülmezse çökelme meydana gelebilir. Perfüzyon tamponunu 2 μm’lik bir filtreden süzün ve HCl kullanarak pH’ı 7.5’e ayarlayın.NOT: Kapalı şişelerde saklandığında bile pH zamanla arttığı için bu adım deney gününde gerçekleştirilmelidir. Test bileşiklerini istenen nihai konsantrasyondan daha yüksek bir konsantrasyonda hazırlayın (örneğin, filtrelenmiş ve pH ayarlı Krebs-Henseleit perfüzyon tamponunda bir yan kol pompası ile 20 mL / dak hızında infüze edildiğinde 0.175x konsantrasyon). Uygunsa, Krebs-Henseleit perfüzyon tamponundaki test bileşiklerini, taşıyıcı olarak %1 BSA eklenmiş (tüm peptitler için gerekli olan boru ve cam eşyalara yapışmayı önlemek için), uygun boyutta bir filtreden süzülerek seyreltin. 3. Operasyon ve perfüzyon NOT: Bu çalışmada kullanılan perfüzyon kurulumunun bir gösterimi Şekil 1’de verilmiştir. Karaciğere yeterli oksijen sağlamak ve işlemin başlangıcından itibaren doğru pH’ı korumak için perfüzyon tamponunu ( O 2,% 5 CO2) en az 30 dakika gazlayın (bikarbonat tampon sistemi sürekli gazlama altında 7.4 pH’a ulaşacaktır, bkz. Ek Şekil 1). İntraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) uygulayarak bir fareyi uyuşturun. Fareyi ısıtılmış bir ameliyat masasına sırtüstü yerleştirin ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olarak refleks eksikliğini onaylayın. Saçın makasa yapışmasını önlemek için etanol püskürtün. Fareyi sıcak yüzeye sabitlemek, aşağıdaki prosedürler için kararlılığı artırmaya yardımcı olur. Karın tabanında makasla bir kesi yapın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için her iki taraftan göğüs kafesine doğru yukarı doğru kesin. Portal damarı açığa çıkaran bir pamuklu çubuk kullanarak bağırsakları sağa doğru hareket ettirin. Kavisli forseps kullanarak portal damarın altına iki bağ yerleştirin ve her bağ için gevşek bir düğüm hazırlayın. Portal vene 0,7 mm’lik bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve Şekil 2’de gösterildiği gibi kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan katetere akar. Bağları sıkın. Kateter kanla dolu değilse, hava kabarcığı girmesini önlemek için perfüzyon tamponu ile doldurun. Perfüzyon tüpünü takın ve silindir pompasını 0.8 mL/dk perfüzyon akış hızında çalıştırarak 37 °C’de Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile karaciğerin perfüzyonunu başlatın. Karaciğer saniyeler içinde soluklaşır. Makas kullanarak göğüs kafesini ve diyaframı kesin. Bu noktada, hayvana ötenazi yapılır. İnce uçlu forseps kullanarak suprahepatik inferior vena kava altına bir bağ yerleştirin. Damarı daha erişilebilir hale getirmek için farenin arkasına bir kalem, rulo gazlı bez veya başka bir tek kullanımlık öğe yerleştirin. Kalbin sağ atriyumundan suprahepatik inferior vena kavaya bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan ve perfüzyon tamponu hemen biter. Bağı sıkın ve perfüzyon atıklarının toplanması için bir tüp takın. Tüm tüpleri su geçirmez bantla (şık bant veya benzeri) sabitleyin. Karışımı önlemek için sağ renal venin hemen üzerindeki infrahepatik vena kava boyunca bir damar klempi yerleştirmek için bir damar klemp adaptörü kullanın (Şekil 2). Perfüzyon akış hızını 3,5 mL/dk’ya yükseltin ve bir zamanlayıcı başlatın. Basınç kaydını başlatın. Başarılı perfüzyon genellikle ~ 10 mm / Hg’lik bir basınçla sonuçlanır. Karaciğeri tuzlu suyla nemlendirilmiş steril bir örtü ile örtün ve kurumasını önlemek için deney sırasında salin ekleyin. Perfüzyon atık suyunu 1 dakika boyunca toplayın ve hacmi ölçün. Hacim yaklaşık 3.5 mL / dak olmalıdır. Bu aşamada kan karışımı beklenmez ve kalp artık pompalamaz. Deneye başlamadan önce 30 dakikalık bir dengeleme süresi bekleyin. Şekil 1: Perfüzyon kurulumunun bir gösterimi. (A) Ameliyat masası bir tripod standı üzerinde yükseltilir ve 37 °C’ye ısıtılır. Perfüzyon tamponu gazlanır ( O 2,% 5 CO2 ‘ dir), peristaltik silindirli bir pompa ile pompalanır ve yerleşik bir kabarcık tutucu ile ısı eşanjöründe ısıtılır. Sistem ayrıca perfüzyon basıncının ayarlanması için bir manometre ve mil pompasından oluşur. Perfüzyon basıncı, bir PC’deki bir dönüştürücü, bir basınç kayıt programı aracılığıyla sürekli olarak kaydedilir ve görselleştirilir. (B) Kırmızı kutu, üç muslukların bağlantılarını yakalar. İlk üç vana, bir şırınga pompası aracılığıyla bir test bileşiğinin infüzyonu için açıktır ve ikincisi kapalıdır. Üçüncüsü sürekli basınç ölçümleri için açıktır. Dördüncü musluk, örneğin perfüze karaciğer boyunca gaz analizi için girdi numunelerini toplamak için kullanılabilir. Konektörler, daha fazla veya daha az infüzyon hattı gerektiren belirli deneyler için gerektiği gibi değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Karaciğer perfüzyonu öncesi ve sırasında fare karın boşluğunun fotoğrafları . (A) Yeşil nokta, portal ven kateterinin ucunun yerini gösterir. Kateterin ucunun, portal venin dallanma noktasının hemen altında, sol ve sağ hepatik portal venlere ancak pankreato-duodenal dalın üzerinde yer alması sızıntıyı önlemek için önemlidir. Sarı nokta, kanın perfüze karaciğere geri akışını önlemek için sağ böbrek veni ile karaciğer arasındaki infrahepatik inferior vena kava üzerindeki damar klempinin doğru yerini gösterir. (B, C) Portal ven (B) ve suprahepatik inferior vena kava (C) ve infrahepatik inferior vena kava (B) üzerindeki damar klempine yerleştirilen iki kateter ile perfüze edilmiş bir fare karaciğeri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Deney Dengeleme periyodunun sonunda bir kesir toplayıcı kullanarak ilk temel numuneleri toplayarak deneye başlayın. İstenilen zaman aralığında numuneleri toplayın ve hemen buzun üzerine koyun. Kabarcık kapanını düzenli olarak kontrol edin ve boşalmaya yakın olduğunda perfüzyon tamponu ile yeniden doldurun. Tamponun bir örneğini, organa girmeden hemen önce üç bir musluktan ve inferior vena kavaya yerleştirilen toplama kateterinden (karaciğerden perfüze edildikten sonra) toplayın. Organın metabolik olarak aktif olduğunu doğrulamak için numuneleri bir kan gazı analizörü ile ölçün (CO2’nin kısmi basıncında bir artış ve pH’da bir azalma ile gösterilir). Deney boyunca uygulanabilirliği değerlendirmek için deneyin sonunda 4.3-4.4 adımlarını tekrarlayın (Ek Şekil 2).NOT: Oksijen kısmi basıncındaki azalma, tüp, organ vb. oksijen kayıpları nedeniyle güvenilir bir solunum ölçüsü sağlamaz. 15 dakikalık başlangıç perfüzyonundan sonra, bir şırınga pompası kullanarak istenen akış hızında üç bir musluktan bir test maddesini infüze ederek ilk stimülasyonu başlatın (örneğin, bir yan kol pompası aracılığıyla 20 mL/dak hızında infüze edildiğinde test maddesinin 0.175x konsantrasyonu). Alternatif olarak, temel tamponu, son konsantrasyonda test bileşiğini içeren yeni (oksijenli ve ısıtılmış) bir tampona geçirin. Stimülasyonu durdurun ve ikinci stimülasyona başlamadan önce 20-30 dakika boyunca temel numuneler toplayın. Deneyin sonunda, 5-10 dakika boyunca uygun bir pozitif kontrol uygulayın. Deneyden sonra, perfüze karaciğeri eksize edin ve çıktıyı karaciğer ağırlığına normalleştirmek için tartın. Çıktıyı protein içeriğine normalleştirmek için protein içeriğinin potansiyel ölçümü için karaciğeri sıvı nitrojen içinde dondurun. 5. Biyokimyasal ölçümler Perfüzyon tamponundaki ölçümler için uygun tahlilleri (kurum içi veya ticari olarak temin edilebilen kolorimetrik veya ELISA tahlilleri) kullanarak ilgilenilen molekülün konsantrasyonunu ölçün. Tampon, metabolomik ve proteomik gibi çoğu omik tabanlı teknikle uyumludur.NOT: Bu çalışmada üre, daha önce tarif edilen bir kolorimetrik teste dayalı olarak ölçülmüştür14. Glikoz ve esterleştirilmemiş yağ asitleri, ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak ölçüldü. 6. Veri analizi Verileri, zaman içindeki salgı çıktısını gösteren XY grafiklerinde sunun.NOT: İn vitro perfüzyon sisteminin erdemlerinden biri, in vivo çalışmalarda olduğu gibi çıktıda ölçülen konsantrasyon (mmol/L) yerine verileri gerçek çıktı (konsantrasyon × akış hızı, örneğin μmol/dk) olarak ifade etmenin mümkün olmasıdır. Farklı fare modellerini karşılaştırırken çıktıyı karaciğer ağırlığına veya kontrol farelerini, karaciğer ağırlığındaki bir artışın artan yağ içeriğine bağlı olabileceği obezite veya karaciğer hastalıkları olan fare modelleriyle karşılaştırırken toplam protein içeriğine (BCA ile ölçülür) normalleştirmeyi düşünün. Özet verileri, başlangıç sırasında ve bir stimülasyon periyodu boyunca (tipik olarak 15-30 dakika) ortalama veya toplam çıktıyı temsil eden hayvan başına ayrı noktalar veya çalışma tasarımına bağlı olarak her stimülasyon periyodu için önceki taban çizgisini kullanarak artımlı çıktı olarak sunun. Verileri, çoklu test için uygun bir post-hoc test ile eşleştirilmiş t-testi (iki grup) veya tekrarlanan stimülasyonlarla (ikiden fazla grup) tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin.

Representative Results

Bir uyaranın veya substratın ilgilenilen molekülün salınmasına yol açıp açmadığını belirlemek için sabit bir taban çizgisi gereklidir. Şekil 3A’da başarılı bir deney örneği gösterilmektedir. Perfüze karaciğerde üre üretimi 2 dakikalık aralıklarla ölçülür ve ortalama ± SEM olarak gösterilir. İki stimülasyon periyodunun her birinden önceki başlangıç periyotları sabittir. İki stimülasyon periyodu boyunca ortalama üre ?…

Discussion

İzole perfüze fare karaciğeri, hepatik metabolizmanın dinamikleri ve moleküler mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar için güçlü bir araştırma aracıdır. Dakikadan dakikaya numune toplama imkanı, bir test bileşiğinin karaciğer üzerindeki doğrudan etkisinin ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontro…