Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

"Avatar", In vivo Gerinim ve Aktivasyon Kullanılarak Modifiye Edilmiş Bir Ex vivo Çalışma Döngüsü Deneyi

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65610

⸱

18 Ağustos 2023

 , 
1Northern Arizona University

Bu makalede

Özet

Bu makale, gerinim geçişlerinin ve aktivasyonun kas kuvveti tepkisine katkılarını değerlendirmek için bir laboratuvar kemirgeninden bir "avatar" kası kullanılarak ex vivo iş döngüsü deneyleri sırasında in vivo kas kuvveti üretimini taklit etme metodolojisini detaylandırır.

Özet

Hareket davranışları, kas kuvveti üretimi ve iş çıktısından kaynaklanan dinamik sistemlerin ortaya çıkan özellikleridir. Nöral ve mekanik sistemler arasındaki etkileşim, koşarken bacak kası özelliklerinin ayarlanmasından, yerle etkileşime giren uzuvların dinamiklerine kadar, biyolojik organizasyonun tüm seviyelerinde aynı anda gerçekleşir. Hayvanların nöral kontrol stratejilerini kontrol hiyerarşisindeki içsel kas mekaniğine ('prefleksler') doğru kaydırdığı koşulları anlamak, kas modellerinin in vivo kas kuvvetini tahmin etmesine ve daha doğru çalışmasına olanak tanır. İn vivo kas mekaniğini anlamak için, kas kuvvetinin ex vivo araştırılması ve in vivo harekete benzer şekilde dinamik olarak değişen zorlanma ve yükleme koşulları altında çalışmak gereklidir. İn vivo gerinim yörüngeleri tipik olarak nöral aktivasyon, kas-iskelet kinematiği ve çevre tarafından uygulanan yükler arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan ani değişiklikler (yani gerinim ve hız geçişleri) sergiler. "Avatar" tekniğimizin temel amacı, içsel mekanik özelliklerin kas kuvveti üretimine katkısının en yüksek olabileceği durumlarda, gerilme hızı ve yüklenmedeki ani değişiklikler sırasında kasların nasıl çalıştığını araştırmaktır. "Avatar" tekniğinde, geleneksel çalışma döngüsü yaklaşımı, ex vivo kasları çoklu gerilme-kısaltma döngüleri boyunca sürmek için dinamik hareketler sırasında hayvanlardan ölçülen in vivo gerinim yörüngeleri ve elektromiyografik (EMG) sinyaller kullanılarak değiştirilir. Bu yaklaşım, in vivo gerinim yörüngelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesi ve bir servo motora bağlı ex vivo fare kaslarına uygulanması dışında, çalışma döngüsü tekniğine benzer. Bu teknik, kişinin şunları yapmasına izin verir: (1) in vivo gerilme, aktivasyon, adım frekansı ve çalışma döngüsü modellerini taklit etmek; (2) bu kalıpları in vivo kuvvet tepkilerini en doğru şekilde eşleştirecek şekilde değiştirin; ve (3) mekanik hipotezleri test etmek için kontrollü kombinasyonlarda gerinim ve/veya aktivasyonun belirli özelliklerini değiştirir.

Giriş

Hareket eden hayvanlar, karmaşık ortamlarda etkileyici atletik dayanıklılık, hız ve çeviklik becerileri elde eder. Hayvan hareketi, insan mühendisliği makinelerinin aksine özellikle etkileyicidir - akım bacaklı robotların, protezlerin ve dış iskeletlerin stabilitesi ve çevikliği hayvanlara kıyasla zayıf kalmaktadır. Doğal arazide eğimli hareket, beklenmedik bozulmalar gibi davranan hız ve manevra çevresel özelliklerini değiştirmek için hassas kontrol ve hızlı ayarlamalar gerektirir1,2,3,4. Yine de, sabit olmayan hareketi anlamak doğası gereği zordur çünkü dinamikler fiziksel çevre, kas-iskelet mekaniği ve sensorimotor kontrol arasındaki karmaşık etkileşimlere bağlıdır1,2. Bacaklı hareket, duyusal bilgilerin hızlı ve çok modlu işlenmesi ve uzuvların ve eklemlerin koordineli olarak çalıştırılması ile beklenmedik bozulmalara yanıt vermeyi gerektirir1,5. Sonuç olarak, hareket, kas-iskelet sisteminin içsel mekanik özellikleri yoluyla kuvvet üreten kasların yanı sıra nöral kontrol1,5,6,7. Nöromekaniğin göze çarpan bir sorusu, bu faktörlerin beklenmedik bozulmalara yanıt olarak koordineli hareket üretmek için nasıl etkileşime girdiğidir. Aşağıdaki teknik, bir "avatar" kası ile kontrol edilebilir ex vivo deneyler sırasında in vivo gerinim yörüngelerini kullanarak kasın deformasyona içsel mekanik tepkisini kullanır.

Kas çalışma döngüsü tekniği, döngüsel hareketler sırasında içsel kas mekaniğini anlamak için önemli bir çerçeve sağlamıştır8,9,10. Geleneksel çalışma döngüsü tekniği, in vivo deneyler sırasında ölçülen frekansları ve aktivasyon modellerini kullanarak kasları önceden tanımlanmış, tipik olarak sinüzoidal, gerinim yörüngeleri boyunca hareket ettirir2,8,9,11. Sinüzoidal uzunluk yörüngelerinin kullanılması, hayvanların çevre ve kas-iskelet sistemi kinematiği ile etkileşim nedeniyle gerinim yörüngelerinde hızlı değişikliklere uğramadığı koşullar altında uçuş12 ve yüzme2 sırasında iş ve güç çıkışını gerçekçi bir şekilde tahmin edebilir. Bununla birlikte, bacaklı hareket sırasında in vivo kas gerilme yörüngeleri, nöral aktivasyon, kas-iskelet kinematiği ve çevre tarafından uygulanan yükler arasındaki etkileşimlerden dinamik olarak kaynaklanır5,7,13,14. İn vivo kas-tendon dinamiklerine karşılık gelen yükleri, gerinim yörüngelerini ve kuvvet üretimini taklit etmek için daha gerçekçi bir çalışma döngüsü tekniğine ihtiyaç vardır ve pertürbasyonlar karşısında koordineli hareket üretmek için içsel kas mekaniği ve nöral kontrolün nasıl etkileşime girdiğine dair içgörü sağlar.

Burada, zamanla değişen in vivo yükleri temsil eden in vivo gerinim yörüngeleri ile kontrollü ex vivo deneyler sırasında bir laboratuvar kemirgeninden bir "avatar" kası kullanarak koşu bandı hareketi sırasında in vivo kas kuvvetlerini taklit etmenin yeni bir yolunu sunuyoruz. Kontrollü ex vivo deneyler sırasında bir hedef kastan bir laboratuvar hayvanından alınan kaslar üzerindeki ölçülen in vivo gerinim yörüngelerinin kullanılması, hareket sırasında yaşanan yükleri taklit edecektir. Burada açıklanan deneylerde, ex vivo fare ekstansör digitorum longus (EDL) kası, bir koşu bandında yürüme, paça ve dörtnala koşma sırasında in vivo sıçan medial gastroknemius (MG) kası için bir "avatar" olarak kullanılır13. Bu yaklaşım, in vivo gerinim yörüngelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesi ve bir servo motora bağlı ex vivo fare kaslarına uygulanması dışında, çalışma döngüsü tekniğine benzer. Fare EDL kasları, sıçan MG'ye kıyasla boyut, lif türü ve mimari açısından farklılık gösterse de, bu farklılıkları kontrol etmek mümkündür. "Avatar" tekniği kişinin şunları yapmasına izin verir: (1) in vivo gerilme, aktivasyon, adım frekansı ve çalışma döngüsü modellerini taklit etmek; (2) bu kalıpları in vivo kuvvet tepkilerini en doğru şekilde eşleştirecek şekilde değiştirin; ve (3) mekanik hipotezleri test etmek için kontrollü kombinasyonlarda gerinim ve/veya aktivasyonun belirli özelliklerini değiştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Northern Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Mevcut çalışmada, 60-280 gün yaşlarındaki erkek ve dişi yabani tip farelerden (suş B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) alınan extensor digitorum longus (EDL) kasları kullanılmıştır. Hayvanlar ticari bir kaynaktan temin edilmiş (bakınız Malzeme Tablosu) ve Northern Arizona Üniversitesi'nde bir koloni şeklinde oluşturulmuştur.

1. Seçme in vivo gerinim yörüngesi ve kullanım sırasında hazırlık ex vivo iş döngüsü deneyleri

NOT: Bu protokolde, yazarlara doğrudan sağlanan (Nicolai Konow, UMass Lowell, kişisel iletişim) in vivo dinamik lokomosyon ön ölçümleri, ex vivo deneylerde kullanılmıştır. Orijinal veriler Wakeling ve ark. için toplanmıştır15. Protokolü tekrarlamak için zaman, uzunluk veya gerinim, EMG/aktivasyon ve kuvvet verileri gereklidir.

  1. Tamamını segmente edin in vivo herhangi bir programlama platformu kullanılarak bireysel adımların denemesi (MATLab kodu şurada sağlanmıştır: Ek Kodlama Dosyası 1).
    1. Uzunluk değişimlerini grafiğe dökün vstüm işlem süresi in vivo deneme. Bu, bireysel adımları (basıştan basışa) görselleştirmek ve adımlar arası değişkenliği değerlendirmek için kullanılır (Şekil 1).
    2. Tüm deneme için gerinimi hesaplayın (Uzunluk (L) / Optimal Uzunluk L'deki Maksimum İzometrik Kuvvet)0).
    3. Tüm denemeler arasından, tüm adımları temsil eden, benzer uzunluklarda başlayıp biten bir adım seçin. Bu işlem, her bir adımı karşılaştırmak için uzunlukların üst üste grafiğe dökülmesiyle görsel olarak gerçekleştirilebilir.
    4. Temsili bir adım seçildikten sonra, herhangi bir programlama platformunu kullanarak tüm denemeden gerinim, EMG/aktivasyon ve kuvvet verilerini segmente edin (bakınız Ek Kodlama Dosyası 1 MATLab'da kullanılan kodlar için16).
    5. Gerinim, EMG/aktivasyon veya kuvvet için örnekleme frekansları farklıysa, tüm verilerin aynı frekansta örneklenmiş olması için veri noktalarını interpole edin.
      NOT: Araştırmacılar, tüm deney boyunca örneklenen her nokta arasındaki zaman aralıklarına dayanarak yakalama sıklığını belirleyebilirler. Değişkenler aynı sıklıkta yakalanırsa, örnekleme zamanları aynı olacaktır.
  2. Segmentli adımların frekansını hesaplayın.
    1. Segmentlere ayrılmış bir adımın süresini saniye cinsinden belirleyerek ve 1'i (saniye) bu süreye bölerek frekansı hesaplayın (1/süre = saniyedeki adım sayısı).
    2. elde edilmesi gereken veri noktası sayısını manuel olarak belirleyin ex vivo frekansı eşlemek için deneyler.
    3. İki adım için gereken süreyi hesaplayın. Sonraki istatistiksel analizler için gerekli olacak kas ölçüm hatası sınırları içinde bir tahminleme yapmak amacıyla, adımları en az bir kez tekrarlayın.
  3. uyarımın başlangıcını ve süresini belirlemek için, ölçülen EMG aktivitesini kullanarak uyarım fazını gerinim girdisine göre belirleyin ex vivo çalışma döngüleri. Herhangi bir programlama platformu kullanılabilir (bakınız Ek Kodlama Dosyası 1 (bu çalışmada kullanılan kod için).
    1. EMG sinyalini, gerinim değişimiyle aynı x-ekseni aralığında (zaman) görüntüleyin (Şekil 1). EMG sinyalini görünür hale getirmek için büyütün; bu işlem, EMG sinyalinin rastgele bir sayı ile çarpılmasıyla, gerinim ve EMG'nin aynı ölçeğe gelecek şekilde yeniden ölçeklendirilmesiyle ve/veya EMG sinyalinin gerinime eklenmesiyle gerçekleştirilebilir.
      NOT: Yazarlar, MATLab'daki "rescale" fonksiyonunu kullanarak gerinim ve EMG değerlerini aynı ölçeğe getirmişlerdir (bakınız Ek Şekil 1).
    2. İki standart sapmalık bir yoğunluk değişimi ile belirtilen EMG aktivitesinin başladığı ve bittiği noktaları belirleyin17,18.
      NOT: Hayvana ve kasa bağlı olarak, EMG başlangıcı ayak temasıyla örtüşebilir veya örtüşmeyebilir (Monica Daley, UC Irvine, kişisel iletişim) (Tartışma bölümüne bakınız).
    3. EMG aktivasyon başlangıcının gerçekleştiği gerinim döngüsünün yüzdesini (örneğin, %40) ve stimülasyonun ne kadar süreceğini (örneğin, 222 ms) hesaplayın.
      NOT: Araştırmacıların, şunlar arasında farklılık gösteren bir uyarılma-kasılma eşleşmesi (ECC) gecikmesini hesaba katmaları gerekecektir in vivo hareket ve ex vivo iş döngüleri oluşturur ve her hayvan ile kas için farklılık gösterebilir (örneğin, in vivo Sıçan MG için ECC 24,5 ms'dir, ex vivo ECC (fare EDL için ~5 ms'dir).
  4. İş döngüsü kontrolör programı için temsili gerinim girişleri hazırlayın. Gerinim ve stimülasyon girişleriyle kuvvet çıktısını kaydedebilen herhangi bir program, iş döngüsü kontrolör programı için kullanılabilir (bkz. Tartışma bölümü).
    1. Seçilen adımı alın ve adımın şu değerde yakalanması için gerekli olan uygun nokta sayısına göre interpolasyon yapın in vivo iki döngü için frekans (bkz. adım 1.2).
    2. Adımı, "sıfır gerinim"de (örneğin, L) başlayıp bitecek şekilde yeniden ölçeklendirin0 veya %95 GA0(önceden belirlenmiş bir uzunluk deplasmanı ile gerildikten sonra (bkz. adım 3.3)).
    3. Fare EDL'deki gerinim değişiklikleri için girdi olarak kullanmak üzere, gerekirse seçilen adım aralığını ölçeklendirin (Tartışma bölümüne bakınız). Ölçeklendirmek için, fare EDL'nin hasar görmeden gerilebileceği bir uzunluk ekskürsiyonu seçin (örneğin, biz genellikle fare EDL'yi L0'ın %10'u kadar geriyoruz)0 ...-e bakılmaksızın in vivo türler). Bu durum, ön sonuçlara bağlı olarak değişiklik gösterebilir (bkz. adım 3.3).

Kalp kası kasılma verileri; döngüsel hareket kalıplarını gösteren uzunluk ile zaman grafiği.
Şekil 1: in vivo tüm deneme boyunca zamanla değişim gösteren uzunluk. Sıçan MG'nin zamanına karşı uzunluğu (mm) grafiğe aktarılmıştır. Adımlar, en kısa uzunluktan en kısa uzunluğa kadar dairelerle işaretlenmiş ve tek bir adım olarak kabul edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Fare kasının ex vivo maksimum izometrik kuvvetinin değerlendirilmesi

  1. Ekipman ve cerrahi hazırlıkları yapın.
    NOT: ex vivo iş döngüsü için gerekli ekipmanın açıklaması için Tartışma bölümüne bakınız.
    1. Oxytube iğne valfini su ceketli doku banyosuna yerleştirerek bir doku-organ banyosu hazırlayın (bkz. Materyal Tablosu). Oxytube'u %95 O2-%5 CO2 içeren bir gaz tüpüne bağlayın. Su ceketli doku banyosunu doldurmak için 20 psi basınç uygulayın.
    2. Cerrahi alanın yakınında, Krebs-Henseleit çözeltisi (adım 2.1.3) ile doldurulmuş bir kristalizasyon kabına gaz hattından ek bir oxytube çekerek cerrahi alanı hazırlayın. Bu, ameliyatlar sırasında ve sonrasında kasların havalandırılmasını ve nemli kalmasını sağlamak için kullanılacaktır.
      NOT: Fareden aynı anda birden fazla kas alındığı takdirde, kaslar bu havalandırılmış çözeltide 4 saate kadar saklanabilir.
    3. Oda sıcaklığında ve HCl ve NaOH kullanılarak pH'ı 7.4'e ayarlanmış, içeriğinde (mmol l-1 cinsinden) şunlar bulunan 1 L Krebs-Henseleit çözeltisi hazırlayın: NaCl (118); KCl (4.75); MgSO4 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl2 (2.54) ve glukoz (10.0) (bkz. Materyal Tablosu). HCl ve NaOH ile çalışırken koruyucu gözlük ve eldiven gibi uygun KKD kullanın.
    4. Banyoyu oda sıcaklığında ve pH 7.4 olan Krebs-Henseleit çözeltisi ile doldurun. Kası ve kancayı tamamen çözeltinin içine batırın.
    5. Tüm ekipmanları açın; çift modlu kas kaldıraç sistemi, stimülatör ve sinyal arayüzü (DAQ kartı) (bkz. Materyal Tablosu).
  2. EDL kası diseksiyonu.
    1. Fareyi derin şekilde anesteziye alın ve ardından servikal dislokasyon ile ötanazi yapın. Fareyi, üst arka uzvu gerilmiş ve ayak parmakları diseksiyon tahtasına değecek şekilde sağ veya sol lateral rekumbent pozisyonda yatırın. Bilekten diz ekleminin üzerine kadar olan tüyleri temizleyin.
    2. Cildi pensle kaldırarak gerin ve ayak bileği ekleminden kalça bölgesine kadar kesin. Kas açığa çıktıktan sonra, ayak bileğinin etrafını pantolon "paçası" gibi kesin. Bacak kaslarını daha net görmek için cildi yukarı çekin.
    3. Tibialis anterior (TA) ve gastroknemius'u ayıran fasya hattını bulun, diz tendonlarını açığa çıkarmak için diseksiyon makası ile ayırın. Diseksiyon makasını açığa çıkan iki diz tendonu arasına yerleştirin. Makas, açığa çıkan diz tendonlarının hemen altındaki bir cebe "takılacaktır". Makaslar bileğe ulaşana kadar makası bacaktan uzaklaştırarak çekip bir "cep" oluşturacak şekilde künt diseksiyon yaparak EDL'yi açığa çıkarın.
    4. 4-0 boyutunda ipek cerrahi süturla önceden bağlanmış bir ilmek düğümü kullanarak (bkz. Materyal Tablosu), süturun bir ucunu dize en yakın tendonun altına geçirin. Kasın üzerine yerleştirmeden veya tendonu dahil etmeden, proksimal kas-tendon bağlantısının üzerine çift kare düğüm atın. Düğümün üzerinden kesin. Tendona bağlı ilmeği nazikçe çekin; EDL "cep"ten çıkacaktır.
    5. EDL'de gerginlik oluşturmak için ilmeği diseksiyon alanına bantlayın. Distal kas-tendon bağlantısında, kasın üzerine yerleştirmeden veya tendonu dahil etmeden başka bir önceden bağlanmış ilmek düğümü kullanarak çift kare düğüm atın. EDL'nin tamamını fareden çıkarmak için bacağa daha yakın olan taraftaki düğümü kesin. Kasın proksimal ve distal yanlarındaki çift kare düğümlerden uzaklaşan fazla süturu kesin ve kası cerrahi alanın yanındaki havalandırılmış banyoya yerleştirin.
      NOT: Kas havalandırılmış banyoya yerleştiriliyorsa, hangi tarafın proksimal ve/veya distal olduğunu not ettiğinizden emin olun.
    6. Servomotor kaldıraç düzeneğine yerleştirmek için, EDL'yi asılı platin elektrotlar arasına dikey olarak sabitleyin. Distal ilmek düğümünü sabit kancaya, proksimal ilmek düğümünü ise servomotor koluna bağlı kancaya takın. Kası havalandırılmış Krebs-Henseleit çözeltisine batırmak için doku banyosunu yükseltin.
      NOT: Havalandırma, kas batırılmış durumdayken onu rahatsız etmemelidir. Eğer ediyorsa, gaz basıncını düşürün. Stimülasyona başlamadan önce kasın 10 dakika boyunca dengelenmesini bekleyin.
  3. EDL kasının maksimum izometrik kuvvetini ölçün.
    NOT: Seğirme (twitch) ve tetanoz kullanarak maksimum izometrik kuvvetin nasıl ölçüleceğine dair protokol için Tablo 1'e bakınız. Yazarlar tarafından kullanılan programın illüstrasyonu için Ek Şekil 1'e bakınız.
    1. Cerrahi sırasında kasın zarar görmediğinden emin olmak için kası supramaksimal bir seğirme ile uyarın (80 V, 1 pps, 1ms; Tablo 1; bkz. Ek Şekil 2). Herhangi bir hasar oluşmamışsa, aktif tansiyonun ~1V / 0.1271 N ve pasif tansiyonun ~0.1V / 0.01271N'den az olduğu bir kas uzunluğunu seğirme stimülasyonu ile bulmak için kas kaldıraç sistemindeki uzunluk düğmesini kullanın.
    2. Kasın sütur düğümünden sütur düğümüne olan başlangıç uzunluğunu Volt ve milimetre cinsinden kaydedin. Ölçümleri, programın başlangıç uzunluğu için olan kalibrasyon kısmına girin (bkz. Ek Şekil 1).
    3. EDL'nin optimal uzunluğundaki (L0) supramaksimal seğirme maksimum izometrik kuvvetini bulun (Tablo 1). Teknik olarak bir dinlenme süresine gerek yoktur, ancak stimülasyonlar arasında 1 dakika beklemek pasif tansiyonu stabilize edecektir. Supramaksimal seğirmenin maksimum olduğu uzunluğu (Volt cinsinden) kaydedin. Bu, seğirme için kasın optimum uzunluğudur (L0).
    4. Bu uzunlukta kası kumpas ile ölçün. Kası sütur düğümünden sütur düğümüne ölçün. L0 bulunduktan sonra, kası tekrar başlangıç uzunluğuna (aktif tansiyon ~1V / 0.1271 N) kısaltın.
    5. EDL'nin supramaksimal tetanoz maksimum izometrik kuvvetini bulun (80 V, 180 pps, 500 ms; Tablo 1). L0'daki supramaksimal tetanik kuvvetin uzunluğunu (Volt ve milimetre cinsinden) kaydedin ve lifleri kumpas ile sütur düğümünden sütur düğümüne tekrar ölçün.
      NOT: Kas uzunluğunu 0.5 V/0.65 mm adımlarla artırmak, hem seğirme hem de tetanoz için daha doğru L0 değerleri sağlayacaktır.
    6. Stimülasyon protokolünden kaynaklı bir yorgunluk oluşmadığından emin olmak için, deneyden önce ve sonra L0'da EDL'nin submaksimal izometrik kuvvetini (45 V, 110 pps, 500ms; Tablo 1) belirleyin. Kuvvetteki %10'luk bir azalma, kasın "yorgun" olduğu şeklinde değerlendirilir.
DeneySimülasyon Şiddeti (V)Darbe Frekansı (pps / Hz)Stimülasyon Süresi (ms)Yorumlar
1. "Isınma"80111 V'luk pasif gerilimi bulmak için uzunluğu 0,50 V artırın veya azaltın
2. Optimal kas uzunluğu seyirmesi (L0)8011~1 V pasif gerilimi bulmak için uzunluğu 0,50 V artırın veya azaltın
3. Optimal kas uzunluğu tetanüsü (L0)80180500Uzunluğu 0,50 V şeklinde değiştirmenin arasında 3 dakika dinlendirin
4. Deney öncesi submaksimal L045110500L0 uzunluğunda
6. Avatar deneyleri45110Fare EDL için temsili uzunluk değişimlerini döngüsel olarak kullanın
7. Deney sonrası submaksimal L045110500Deneyden sonra L0 konumuna geri dönün ve L0'ı ölçün

Tablo 1: Stimülasyon protokolü. Supramaksimal ve submaksimal seğirme ve tetanüs optimal uzunluğunu belirlemek için stimülasyon protokolü. Protokol; stimülasyon şiddetine, zamanlamaya ve saniye başına düşen pals sayısına göre değişiklik gösterir.

3. Seçilmiş in vivo suş yörüngeleri kullanılarak "avatar" çalışma döngüsü tekniğinin tamamlanması

  1. "Avatar" iş döngüsü tekniklerini tamamlamak için gerekli yazılımı kurun (bkz. Malzemeler Tablosu).
    NOT: Her zaman adımındaki kas uzunluğunu belirten bir giriş dosyasına (.csv veya benzeri) ihtiyaç vardır (bkz. adım 1.4). Stimülasyonun başladığı döngü yüzdesi ve stimülasyon süresi için girişler gereklidir (örnek için bkz. Ek Şekil 3).
  2. "Avatar" iş döngüsü tekniğini tamamlayın.
    NOT: Biz özel bir LabView programı kullansak da, araştırmacılar bir servomotor kolu üzerindeki fare EDL kasının uzunluk değişimlerinin kontrolüne, belirlenen zamanlardaki stimülasyon başlangıcının (% döngü) ve süresinin (ms) kontrolüne ve kas kuvvetinin ölçümüne izin veren herhangi bir programı kullanabilirler. Yazarların kullandığı programın bir gösterimi için bkz. Ek Şekil 3.
    1. Ölçeklendirilmiş uzunluk ekskürsiyonu ile birlikte ölçeklendirilmiş gerinim değişimlerini adım 1.4'teki programa yükleyin. "Ölçeklendirilmiş gerinim değişimleri" hakkında daha fazla bilgi için adım 1.4, 3.3 ve Tartışma bölümüne bakınız.
    2. Gerekirse kasın başlangıç uzunluğunu ayarlayın (bkz. bölüm 3.3). Sonuçları kalibre etmek için başlangıç uzunluğunu V ve mm cinsinden girin (bkz. Ek Şekil 3).
    3. Adım 1.3'te hesaplanan stimülasyon başlangıcını ve süresini kullanın.
    4. Kası, belirlenen uzunluk ekskürsiyonu ile ölçeklendirilmiş uzunluk değişimleri boyunca iki döngü boyunca çalıştırın.
    5. Verileri kaydedin. Aynı kas üzerinde birkaç stimülasyon protokolü toplandıysa, her stimülasyon arasında 3 dk bekleyin.
    6. Yorgunluğun oluşup oluşmadığını belirlemek için submaksimal aktivasyon kullanarak optimal uzunlukta (L0) stimülasyon uygulayın. Kuvvet %10'dan fazla azalırsa, kaslar yorulmuş kabul edilir. Stimülasyon protokolleri için bkz. Tablo 1.
    7. Kası banyodan çıkarın. Kas üzerindeki döngü düğümlerini kesin ve kasın üzerindeki fazla solüsyonu tamponla alın. Kasın ağırlığını ölçün. Standart formülü kullanarak fizyolojik kesit alanını belirleyin: kas kütlesi/(L0*1.06)19.
  3. "Avatar" iş döngüsü tekniği için parametreleri optimize edin (bkz. Tartışma bölümü).
    1. ex vivo pasif gerilim artışını, in vivo gözlemlenen pasif gerilim artışıyla eşleştirerek başlangıç uzunluğunu ve uzunluk ekskürsiyonunu belirleyin (Şekil 2).
      NOT: Bu çalışmada, başlangıç uzunluğunu (mm) ve ekskürsiyonu (% L0) ölçeklendirmek için yüzde L0 kullanılmıştır (bkz. adım 1.4 ve Tartışma bölümü). ex vivo fare EDL'sindeki gerilim artışını in vivo sıçan MG'ninkiyle eşleştirmek için yazarlar, L0'daki başlangıç uzunluğunun en iyi uyumu sağladığını bulmuşlardır (Şekil 2).
    2. Üç başlangıç uzunluğu seçin (örneğin, -5% L0, L0 ve +5% L0). Her bir başlangıç uzunluğunda, belirlenen bir uzunluk ekskürsiyonu ile (örneğin, 10% L0) "avatar" iş döngüsünü gerçekleştirin.
      NOT: Fare EDL kullanılan mevcut "avatar" deneylerinde, 10% L0 uzunluk ekskürsiyonu kullanılmıştır.
    3. ex vivo pasif gerilim artış hızı, in vivo pasif gerilim artış hızına benzer olana kadar yeni başlangıç uzunlukları ve/veya ekskürsiyonlar ile tekrarlayın (bkz. Şekil 2B).
    4. Kullanılan kasların lif tiplerine ve aktivasyon dinamiklerine bağlı olarak, ex vivo ve in vivo kuvvet arasındaki uyumu optimize etmek için stimülasyon süresini artırın veya azaltın. Bu nedenle, "avatar" deneyleri sırasında in vivo kuvvet üretimini en iyi şekilde eşleştirmek için stimülasyon başlangıcını ve/veya süresini değiştirmek gerekebilir.
    5. Bunun gerekli olup olmadığına karar vermek için (bkz. Tartışma bölümü), "avatar" ve in vivo kasın zamana karşı kuvvet grafiğini çizin (Şekil 3) ve hedef ile "avatar" kas kuvveti arasındaki ölçeklendirilmiş korelasyonun karesini alarak determinasyon katsayısı R2 değerini hesaplayın (bkz. Temsili sonuçlar).

Statik denge grafiği, ΣFx=0, iş döngüsü analizini göstermektedir; ölçeklendirilmiş gerilme-birim şekil değiştirme diyagramı.
Şekil 2: Eşleşen pasif gerilim artışı. Pasif gerilimdeki in vivo ve ex vivo artışı gösteren iş döngüleri (oklar). 2.9 Hz hızında yürüyen sıçan MG'den (siyah) alınan ölçeklendirilmiş in vivo iş döngüsü (veriler Wakeling ve ark.15 tarafındandır). 2.9 Hz hızında fare EDL'den (yeşil) alınan ölçeklendirilmiş ex vivo iş döngüleri. (A) Fare EDL kasının başlangıç uzunluğu +%5 L0'dır. (B) Fare EDL kasının başlangıç uzunluğu L0'dır. Ex vivo pasif gerilim artışının A'daki in vivo gerilim artışıyla eşleştiği, ancak B'de eşleşmediği görülmektedir. Daha kalın çizgiler stimülasyonu belirtir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Malzeme testi analizinde dinamik yanıt eğrilerini gösteren stres ile zaman grafiği.
Şekil 3: Fare EDL'sinin stimülasyon süresinin, sıçan MG'sinin in vivo kuvvetine (siyah çizgi) uyum sağlayacak şekilde optimize edilmesi.EMG tabanlı stimülasyon kullanılarak fare EDL tarafından üretilen kuvvet (yeşil kesikli çizgi), muhtemelen fare EDL'sinin sıçan MG'sine kıyasla daha hızlı deaktivasyonu nedeniyle in vivo kuvvetten daha erken azalmaktadır. in vivo ve ex vivo kuvvetler arasındaki uyumu optimize etmek için fare EDL daha uzun bir süre stimüle edilmiştir (düz yeşil çizgi). EMG tabanlı stimülasyon R2 = 0,55, Optimize edilmiş stimülasyon R2 = 0,91. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

"Avatar" deneylerinin amacı, ex vivo iş döngüsü deneyleri sırasında in vivo kuvvet üretimini ve iş çıktısını mümkün olduğunca yakından taklit etmektir. Bu çalışma, hem fare EDL'sinin hem de sıçan MG'sinin çoğunlukla hızlı kasılan kaslardan oluşması nedeniyle, sıçan MG'si için bir "avatar" olarak fare EDL'sini kullanmayı tercih etmiştir20,21. Her iki kas da benzer pennasyon açılarına sahip (fare EDL 12.4 + 2.12°22, bu çalı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Organizmalar manzaralar arasında sorunsuz bir şekilde hareket ederken, kasların maruz kaldığı altta yatan yükler ve gerilmeler büyük ölçüde değişir 1,6,23. Hem in vivo hareket 1,24 hem de "avatar" deneyleri sırasında, kaslar döngüsel, sabit olmayan koşullar altında maksimal altında uyarılır. İzometrik kuvvet-uzunluk ve izotonik kuvvet-hız ilişkileri, bu koşullar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını kabul eder.

Teşekkürler

Bu çalışmada kullanılan verileri sağladığı için Dr. Nicolai Konow'a teşekkür ederiz. NSF IOS-2016049 ve NSF DBI-2021832 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Örgülü Emilmeyen İpek Sütür 4-0 Mersilk 734H
Kalsiyum Klorür Dihidrat (CaCl2)Sigma-Aldrich1086436Krebs-Henseleit  çözüm
Dekstroz Sigma-AldrichD9434Krebs-Henseleit  çözüm
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  çözelti
Hidroklorik Asit (HCl) Sigma-Aldrich1.37055Krebs-Henseleit  çözüm
LabView Veri Toplama Lab-View
Magnezyum Sülfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  çözelti
Potasyum Klorür (KCl) Sigma-AldrichP3911Krebs-Henseleit  çözelti
Potasyum Fosfat Monobazik (KH2< / sub>PO4< / sub>)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  çözüm
S88 StimülatörÇimM643H05Ebay
Serisi 300B Kol SistemindenAurora1200Asu ceketi doku banyosu içerir
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  çözelti
Sodyum Klorür (NaCl) Sigma-AldrichS9888Krebs-Henseleit  çözelti
Sodyum Hidroksit (NaOH)Sigma-AldrichS5881Krebs-Henseleit  çözüm
Vahşi Tip FarelerJackson LaboratuvarıB6C3Fe a / a Ttn mdm / J
satın alınabilir ,

Kaynaklar

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561(2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242(2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312(2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721(2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669(2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019(2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

In Vivo KasKas Kuvvet retimiGerinme Y r ngeleriN ral AktivasyonKas Mekani iUzama K salma D ng leriElektromiyografik SinyallerServo MotorLokomosyon Dinami i
"Avatar", In vivo Gerinim ve Aktivasyon Kullanılarak Modifiye Edilmiş Bir Ex vivo Çalışma Döngüsü Deneyi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.