Method Article

Filamentli Siyanobakterilerde Hızlandırılmış Mikroskopi Analizi için Dikey İmmobilizasyon Yöntemi

DOI:

10.3791/65612

⸱

September 25th, 2023

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Laboratorio de Ciencias Omicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Espíritu Santo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XY düzleminde filamentli siyanobakteriyel görselleştirme için basit ve erişilebilir bir yöntem sunuyoruz. Düşük erime noktalı bir agaroz matrisi kullanıldı ve bölünmede yer alan proteinlerin görüntülerinin dikey bir yönde elde edilmesine izin verildi. Bu nedenle, bu metodoloji herhangi bir filamentli organizmaya ve farklı protein türlerine uygulanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel hücre bölünmesindeki ana olay, FtsZ proteininin anahtar element olduğu septasyon işlemidir. FtsZ, hücrenin ortasında, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi gören halka benzeri bir yapı (Z-halkası) oluşturan polimerize olur. Bakteriyel modellerde süper çözünürlüklü mikroskopi Escherichia coli ve Bacillus subtilis , Z-halkasının süreksiz olduğunu gösterirken, canlı hücre görüntüleme çalışmaları FtsZ'nin halka boyunca koşu bandı olarak bilinen bir mekanizma ile hareket ettiğini gösterdi. FtsZ'nin dinamiklerini in vivo olarak incelemek için, XY düzlemindeki halkanın tüm yapısını görüntülemek için dikey konumda özel bir hücre yerleşimi gereklidir. Anabaena sp. PCC7120 gibi çok hücreli siyanobakterilerde FtsZ görüntüleme durumunda, filamentlerin dikey konumda tutulması, hücrelerin büyüklüğü ve filamentlerin uzunluğu nedeniyle zordur. Bu makalede, Z-halkasını bir FtsZ-sfGFP füzyon proteinini ifade eden bir mutantta kaydetmek için Anabaena sp. PCC 7120 filamentlerinin düşük erime noktalı agaroz ve şırıngalar kullanılarak dikey immobilizasyonuna izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, konfokal mikroskopi kullanarak bölünme bölgesinde protein dinamiklerini kaydetmenin hızlı ve ucuz bir yoludur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel hücre bölünmesi, bir ana hücrenin, çoğu durumda ikili fisyon olarak bilinen mekanizma ile iki yavru hücre ürettiği süreçtir. Septasyon sürecindeki en erken olaylardan biri, FtsZ'ninhücre 1'in ortasında lokalizasyonudur. Yapısal olarak tübülin2'ye homolog olan bu protein, çoğu bakteride korunur ve yaygın olarak dağıtılır ve polimerizasyonu Z-halka3 olarak bilinen bir kasılma yapısı oluşturur. Bu halka, diğer bölünme proteinleri için bir iskele görevi görür ve birlikte bölücü adı verilen moleküler bir makine oluştururlar. Birçok çalışma, Z-halkasının oldukça dinamik olduğunu ve FtsZ protofilamentlerinin 4,5,6 koşu bandı ile hareket ettiğini göstermiştir. Hızlandırılmış deneylerde Z-halkasını incelemek için, daha iyi çözünürlük ve hızlı örnekleme için bölme bölgesini XY düzleminde kaydetmeniz önerilir. Bunu başarmak için, genellikle mikrodelik hücre tuzaklarının ve karmaşık mikroakışkan cihazların nanofabrikasyonunu içeren dikey hücre immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi gerekmektedir7.

Siyanobakteriler, hücresel morfolojilerine göre gram-negatif olarak sınıflandırılan fotosentetik mikroorganizmalardır. Bununla birlikte, filogenetik olarak gram-pozitif bakterilere daha yakındırlar8. Bu organizmalar, gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerde yaygın olan hücre bölünme genlerine sahiptir, ancak bölücüleri de benzersiz elementler içerir9. Anabaena sp. PCC 7120 (bundan böyle Anabaena sp.) bir bölünme düzlemine sahip filamentli siyanobakterilerdir ve çok hücreli siyanobakterilerde hücre bölünmesinin incelenmesi için bir modeldir. Bu suşta, FtsZ'nin hücrelerin ortasındaki konumunu belirlemek mümkün olmuştur10. Bununla birlikte, bu modelde FtsZ'nin in vivo dinamiklerini gösteren hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Laboratuvarımızda, triparental çiftleşme ve homolog rekombinasyon yoluyla, tam endojen ftsZ geninin yerini alan sfGFP'ye kaynaşmış FtsZ proteinini ifade eden tamamen ayrılmış bir Anabaena sp. mutantı elde ettik. Filamentli siyanobakterilerdeki bölünme proteinlerini görselleştirmek için hızlandırılmış deneyler için mutant suş filamentlerinin dikey oryantasyonunu destekleyen hızlı ve basit bir hücre immobilizasyon yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, pahalı ve geliştirilmesi zor olabilecek mikroakışkan cihazlara ihtiyaç duymaz. Örnek olarak, bu protokolü FtsZ-sfGFP mutantındaki Z-halkasını konfokal mikroskopi ile görselleştirmek için kullandık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dikkat edilmesi gereken noktalar ve hücresel modelin seçimi

NOT: Siyanobakteriler, fotosentetik pigmentlerin varlığı nedeniyle güçlü bir otofloresansa sahiptir. Bu sinyal spektrumun kırmızı kısmındadır, bu nedenle siyanobakterilerde görüntüleme için uygun floresan proteinler kırmızı emisyondan uzak olanlardır. Örneğin, GFP, YFP, Venüs, Turkuaz ve BFP.

  1. Hedef filamentli siyanobakteriyel suşta bulunan bir bölücü bileşen seçin. Deneyler için, bir floresan proteine kaynaşmış seçilmiş bölücü bileşeni ifade eden filamentli bir siyanobakteriyel mutant oluşturmak gerekir. Bu protokolde, örnek olarak FstZ-sfGFP'yi ifade eden bir Anabaena sp. mutantı. Bu suş, E. coli11 ile üçlü çiftleşme ile elde edildi.
  2. Kullanılacak mutantın ayrışma seviyesini kontrol edin. Örnekte, ayrışma, hedef genin PCR amplifikasyonu ile belirlenmiştir. Bu protokolde kullanılan FtsZ-sfGFP mutantı, vahşi tip ftsZ geninden yoksun tamamen ayrılmış bir suştur.

2. Büyüme koşulları

  1. Sabit fazda 10 mL kültür kullanarak ( Anabaena sp için 25 ° C'de sabit ışıkta yaklaşık 14 gün boyunca yetiştirilir) ve antibiyotiklerle desteklenmiş 90 mL BG11 ortamına (FtsZ-sfGFP mutantı için Spectinomycin ve Streptomisin 10 μl ml-1 ) ekleyerek mutantın taze bir alt kültürünü yapın.
  2. Yeni hücre kültürünü üstel faza ulaşana kadar sabit ışıkta ve optimum sıcaklıkta büyütün. Anabaena sp.'nin FtsZ-sfGFP mutantı, numune hazırlamadan önce 7 gün boyunca 25 ° C'de yetiştirilir.

3. Bir agaroz matrisinde numune hazırlama

  1. Homojenize büyüme kültüründen 2 mL alın.
  2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj.
  3. Bu arada, 50 mL'lik bir şişede, BG11 sıvı ortamında 30 mL% 3 düşük erime noktası agarozu ısıtın. Orta güç seviyesine ayarlanmış bir mikrodalga kullanın ve tamamen çözünene kadar her 15 saniyede bir çözeltiyi kontrol edin. 37 °C'ye kadar soğuması için bir kenara koyun.
    NOT: Kontaminasyonu önlemek için agaroz çözeltisini otoklavlayın.
  4. Santrifüjleme yapıldıktan sonra, süpernatantın 1,9 mL'sini atın ve kalan hacimdeki hücreleri en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
  5. Askıya alınmış hücreleri en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 900 μL% 3 agaroz çözeltisi ile karıştırın.
    NOT: Agaroz çözeltisi sıvı olmalı, ancak hücre hasarını önlemek için çok sıcak olmamalıdır. Bir sonraki adım hızlı bir şekilde ve agaroz çözeltisi kıvam = gibi bir jel oluşturmadan önce gerçekleştirilmelidir.
  6. Agaroz matrisini 1 mL'lik bir şırıngada dikkatlice aspire edin. Numune şırınga ile aspire edilirken kabarcıkların oluşmasını önlemek önemlidir.
    NOT: Bu adımdan önce, dar giriş deliğini ortadan kaldırmak için şırınganın ucunun kesildiğinden emin olun.
  7. Şırıngayı 2 saat boyunca oda sıcaklığında yatay konuma getirerek numune-agaroz karışımının katılaşmasını sağlayın.
  8. Agaroz matrisini pistonu kullanarak dikkatlice çıkarın ve temiz ve düz bir yüzeye koyun.
  9. Katılaştırılmış numuneyi, matrisin bütünlüğünü koruyarak 0,5 - 1 mm kalınlık aralığında dilimler halinde kesin.
    NOT: Daha iyi sonuçlar için, agaroz matrisini bir neşter veya ince tıraş bıçağı kullanarak kesin.
  10. Dilimleri bir kapak kayması üzerine yan yana yerleştirin. Bir kapak fişindeki disk sayısı, boyutlarına bağlı olacaktır.
    NOT: Hızlandırılmış mikroskopi için, mikroskopi analizi için yapılmış bir hücre odasının kullanılması önerilir (örneğin, Attofluor veya Chamlide Manyetik odaları). Bu odalar, dehidrasyondan kaçınarak numunenin elde edilmesine izin verir. Bu örnekte, numuneler Attofluor haznesi kullanılarak yuvarlak kapaklar (25 mm) üzerinde hazırlanmıştır.
  11. Dehidrasyonu önlemek için odaya yerleştirilen numuneye 2 mL erimiş% 3 agaroz çözeltisi ekleyin.
  12. Bir jel oluşturmak için agaroz çözeltisi tamamen katılaşana kadar bekleyin.

4. Görüntü alma

  1. Konfokal mikroskopta mutant suşa ilgi duyan floresan proteini görselleştirmek için parametreleri standartlaştırın. Mikroskopun hem otofloresanı hem de seçilen floresan işaretleyiciyi algılayabildiğinden emin olun.
  2. Numuneyi parlak alan konformasyonunda maksimum büyütme ile görselleştirin ve Şekil 1'de gösterildiği gibi dikey olarak yönlendirilmiş bir filament arayın.
  3. Z düzlemi boyunca otofloresan sinyalini kullanarak ilk taramayla ilgilendiğiniz bölme bölgesini bulun.
  4. Bölünme bölgesinde ilgilenilen proteinin sinyalini görselleştirmek için floresan protein işaretleyicisinin parametrelerini kullanın.
  5. Biyolojik modele ve ilgilenilen proteine göre hızlandırılmış deneyler yapın. Örneğin, bu durumda, Anabaena sp.'deki Z-halkası boyunca FtsZ'nin dinamiklerini kaydetmek için 50 saniyede 10 s'lik hızlandırılmış deneyler yapılmıştır (Şekil 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anabaena sp.'deki Z-halkasının dikey immobilizasyon yöntemi kullanılarak görselleştirilmesi
Bakterilerdeki Z-halka bileşenlerinin dinamiklerini incelemek için, dikey olarak yönlendirilmiş hücrelerde görüntüler elde etmek gerekir. Bu pozisyonda, hızlandırılmış mikroskopi ile protein dinamiklerini izlemek için Z-halkasını ve bölücünün ana proteinlerini görselleştirmek mümkündür. Bakteriler için klasik numune hazırlama, filamentli siyanobakteriler için çalışmaz. Anabaena sp. durumunda, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bölücü proteinlerin dinamiklerinin incelenmesi şüphesiz bir meydan okumadır. Özellikle, filamentli siyanobakterilerde, zorluklardan biri, hücrelerin dikey olarak yönlendirilmesi gereken yatay düzlemde Z-halkasının görselleştirilmesidir. Burada tarif ettiğimiz yöntem, farklı analizleri gerçekleştirmek için Z-halkasının XY düzleminde konumlandırılmasını sağlar. Bu, Z-halkasının tam olarak görselleştirilmesini sağlayan filamentli siyanobakteriler için ilk basit yöntemdir.

Bu protokol basit ve hı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman için Ulusal doktora burslarına (ANID 21211333; 21191389) minnettarız. Grant Fondecyt 1161232.

Bu çalışma de Advanced Microscopy Facility UMA UC tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml şırıngaQingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.-Genellikle sıvıyı veya enjeksiyon sıvısını pompalamak için kullanılan 1 ml iğneli tek kullanımlık tıbbi plastik şırınga, bu deneyde numuneyi emmek ve polimerize etmek için kullanılır.
Attofluor Hücre OdasıThermoFischer ScientificA7816Attofluor Hücre Kamerası, canlı hücre örneklerini dik veya ters mikroskoplarda görüntülemek için tasarlanmış dayanıklı ve pratik bir lamel tutucudur.
96 kuyu bloklu Axygen MaxyGene II Termal DöngüleyiciCORNINGTHERM-1001Yeni MaxyGene II Termal Döngüleyici, Axygen markalı ürünlerden beklediğiniz üstün performansı sağlayarak artırılmış hız ve gelişmiş özelliklere sahiptir. Benzersiz esnek programlama. Hızlı çalışma süreleri. Geleneksel gradyan döngüleyicilere göre geliştirilmiş iş akışı. 5 ° C'ye kadar rampa oranları; C/sn'dir. Ayarlanabilir ısıtmalı kapak, şeritleri, tüpleri ve mikro plakaları barındırır.
Fisherbrand Kapak Camları: DairelerThermoFischer Scientific12-546-2PDüzgün kalınlık ve boyutta en iyi optik borosilikat camdan yapılmıştır. Dairesel şekil. Korozyona dayanıklı.
Düşük Erime Noktalı agarozPromegaV3841Agaroz, Düşük Erime Noktası, Analitik Derece, jel elektroforezinden sonra bozulmamış DNA fragmanlarının geri kazanılmasını gerektiren uygulamalar için idealdir.
Zeiss Airyscan'den LSM 880 mikroskobuZeiss-Zeiss Airyscan LSM 880 mikroskobu, çözünürlük sınırının (yanal çözünürlük ~ 120nm ve eksenel çözünürlük ~ 350nm) altında görüntü elde edebilen bir lazer taramalı odak mikroskobudur. Dedektörler son derece hassastır ve yüksek hızda süper çözünürlüklü görüntüler elde etmeyi mümkün kılar.
Mikrocentr ve iacute; fuga Fresco 17ThermoFischer Scientific75002402Soğutmalı olarak sunulan standart mikrosantrifüjümüzle 17.000 > g'ye kadar rutin numune hazırlama işlemlerini hızlandırın. Bu mikrosantrifüjler, kullanımı kolay, kompakt tasarımlı bir laboratuvar cihazında üretkenlik, çok yönlülük, güvenlik ve rahatlık sunar.
Nikon Timelapse MikroskopNikon-NikonC2 lazer taramalı konfokal mikroskop, uzun süreli timelapse için ideal bir mikroskoptur, çünkü inkübasyon odası sayesinde numuneleri 8 saatten fazla optimum koşullarda tutmak mümkündür.
İnce tıraş bıçakları Schick Super ChromiumFarmazonSKU: 401146  İnce tıraş bıçakları, agaroz matrisini kesmek için kullanılır, bu da matrisin bütünlüğünü korurken numuneyle birlikte diskleri elde etmemizi sağlar.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  2. Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
  3. Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
  4. Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
  5. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  6. Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
  7. Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
  8. Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
  9. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  10. Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  11. Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertical ImmobilizationTime Lapse MicroscopyFilamentous CyanobacteriaAnabaena PCC7120FtsZ DynamicsZ Ring ImagingConfocal MicroscopyLow Melting AgaroseFluorescent Protein FusionCell Division

Related Articles