Karo/SED/Array arayüzü kullanılarak çoğullanmış iyon ışını görüntüleme mikroskobu üzerinde doku mikrodizisi ve döşenmiş alan görüntülemesinin hızlı kurulumu

Summary

Çoğullanmış iyon demeti görüntüleme (MIBI) genellikle doku mikrodizilerini ve döşenmiş, bitişik doku alanlarını görüntülemek için kullanılır, ancak bu deneyleri kurmak için mevcut yazılım hantaldır. Döşeme/SED/dizi arayüzü, MIBI çalıştırma kurulumunu önemli ölçüde basitleştirmek ve hızlandırmak için geliştirilmiş sezgisel, etkileşimli bir grafik aracıdır.

Abstract

Çoğullanmış iyon demeti görüntüleme (MIBI), histolojik dokularda protein ekspresyonunun 40+ plex görüntüsünü üreten, hücresel fenotiplerin ve histomimari organizasyonun ayrıntılı diseksiyonunu sağlayan yeni nesil kütle spektrometresi tabanlı bir mikroskopi tekniğidir. Kullanıcılar görüntüleme için doku üzerindeki fiziksel konumları seçtiğinde işlemdeki önemli bir darboğaz oluşur. MIBI deneylerinin ölçeği ve karmaşıklığı arttıkça, üretici tarafından sağlanan arayüz ve üçüncü taraf araçlar, büyük doku mikrodizilerini ve döşenmiş doku alanlarını görüntülemek için giderek daha hantal hale geldi. Bu nedenle, web tabanlı, etkileşimli, ne görürsen onu alırsın (WYSIWYG) bir grafik arayüz katmanı - döşeme / SED / dizi Arayüzü (TSAI) - kullanıcıların sürükle ve bırak, tıklama ve sürükleme ve çokgen çizimi gibi tanıdık ve sezgisel fare hareketlerini kullanarak görüntüleme konumlarını ayarlamaları için geliştirilmiştir. Halihazırda modern web tarayıcılarında yerleşik olarak bulunan web standartlarına göre yazılmıştır, harici programların, uzantıların veya derleyicilerin yüklenmesini gerektirmez. Yüzlerce mevcut MIBI kullanıcısının ilgisini çeken bu arayüz, büyük, karmaşık MIBI çalıştırmalarının kurulumunu önemli ölçüde basitleştirir ve hızlandırır.

Introduction

Çoğullanmış iyon ışını görüntüleme (MIBI), histolojik doku kesitlerinde 40+ proteini aynı anda 250 nm çözünürlüğe kadar^{görüntülemek} için kullanılan bir tekniktir ^1,2,3. Histolojik bir doku kesiti, izotopik olarak saf elementel metallerle etiketlenmiş antikorlar kullanılarak boyandıktan sonra, MIBI cihazı, doku üzerindeki tek tek noktalarda tüm izotopları - ve dolayısıyla tüm 40+ antijenlerin ekspresyonunu - aynı anda ölçmek için ikincil iyon kütle spektrometresi gerçekleştirir. Milyonlarca noktadan oluşan ızgaralar boyunca gerçekleştirilen, elde edilen protein ekspresyonunun 40+ plex görüntüsü, uzamsal bağlamı^korurken hücre sınırlarının tanımlanmasını ve belirli hücre tiplerinin tanımlanmasını sağlar 1,2,3,4. Bu teknik, tümörlere karşı bağışıklık tepkisini, enfeksiyöz ajanların neden olduğu doku iltihabını, demansın nöropatolojisini ve gebelikte bağışıklık toleransını incelemenin bir parçası olarak düzinelerce doku tipinin hücresel bileşimini, metabolik profillerini ve/veya mimarisini incelemek için yaklaşık 20 bölgede yüzlerce kullanıcı tarafından kullanılmıştır 5,6,7,8,9^{, 10,11}.

MIBI cihazının çalışmasındaki önemli bir darboğaz, görüntüleme için dokunun 200 x 200 μm² ila 800 x 800 μm² alanı olan görüş alanlarının (FOV'lar) oluşturulmasıdır. MIBI, 800 x 800^μm2'ye kadar her seferinde bir FOV görüntüler, bu nedenle daha büyük alanların görüntülenmesi için birden fazla FOV'un birbirine dikilmesi gerekir. Bir doku mikrodizisinin görüntülenmesi (örneğin, Şekil 1A'daki sekiz dairesel doku), birden fazla FOV'un aralıklı olarak yerleştirilmesini içerir. FOV'ları ayarlamak için, üretici arayüzü 1) kabaca belirtilen görüntüleme koordinatına karşılık gelen bir artı işaretine sahip slaytın bir optik kamera görüntüsünü sağlar (Şekil 1A) ve 2) koordinattaki tam alanı gösteren ikincil bir elektron dedektörü (SED) görüntüsü, bildirildiğine göre 0.1 μm içinde doğru (Şekil 1B). İlk olarak, kullanıcı optik görüntüyü kullanarak kabaca tek bir FOV'u konumlandırır. Görüntü çözünürlüğü piksel başına yalnızca yaklaşık 60 μm olduğundan, yerleşim iki piksel (piksel başına 2 piksel x 60 μm) kapalıysa, standart 400 μm FOV %30 oranında kapalı olacaktır. Bu nedenle, kullanıcının konuma ince ayar yapmak için SED görüntüsünü kullanması gerekir - birden fazla açılır pencere, metin kutularına koordinatlar yazma, SED'yi yön kontrol düğmeleriyle yavaşça dürtme ve hatta çoğu zaman koordinatları kağıda yazma (Ek Şekil 1). Bu işlem, 100+ çekirdek doku mikrodizisinin (TMA) her noktası için tekrarlanmalıdır. Bazı üçüncü taraf araçlar, ilk kaba konumlandırma^12'ye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, yine de biraz programlama bilgisi gerektirirler ve nihai konumlandırma hala bir düzine adımlı süreçle yapılır. Ayrıca, daha sonra döşenmiş panoramik bir görüntüde bir araya getirilecek olan bitişik FOV'ların ızgaralarını konumlandırmak da oldukça zahmetlidir.

Bu nedenle, döşeme / SED / dizi Arayüzü (TSAI), kullanıcıların sezgisel, etkileşimli bir grafik arayüz kullanarak çok sayıda FOV'u hızlı bir şekilde konumlandırmasını sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. TSAI iki ana bileşenden oluşur: 1) TMA noktalarını ve doku döşemelerini hızlı bir şekilde yerleştirmek için web tabanlı bir grafik kullanıcı arayüzü (web UI) ve 2) Döşenmiş bir SED görüntüsü oluşturmak ve FOV konumlarını ayarlamak için MIBI kullanıcı kontrol arayüzüne entegrasyonlar. Yalnızca optik görüntü kullanılıyorsa, birçok FOV kabaca konumlandırılabilir ve ardından FOV navigasyon/ayarlama araçları kullanılarak hızlı bir şekilde ayarlanabilir (Şekil 2, TSAI, sol dal). Bununla birlikte, SED döşeme gerçekleştirilirse, FOV'lar, SED modunda daha fazla ayarlamaya gerek kalmadan döşenmiş SED görüntüsü üzerinde doğru bir şekilde konumlandırılabilir (Şekil 2, TSAI, sağ dal). Yüzlerce mevcut MIBI kullanıcısının genel ilgisini çeken bu araçlar, döşeme ve TMA konumlandırmayı acemiler için bile çok basit hale getirir ve karmaşık MIBI çalıştırma kurulumlarını birkaç saatten birkaç düzine dakikaya düşürür.

Protocol

1. TSAI'nin Yüklenmesi

1. MIBI kullanıcı denetim bilgisayarının web tarayıcısında https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai açarak TSAI'yi çalıştırın.
   1. TSAI'nin bu örneği, tüm enstrümanlar için geçerli olmayan özel ön ayarlar içerir. Bunu kullanırken, aşağıda adım 2.6'da oluşturulduğu gibi yalnızca şablon FOV(lar)ından döşemeler oluşturun. TSAI, web tarayıcısında yerel olarak çalışır ve sunucuya hiçbir görüntü, .json veya dosya adı verisi gönderilmez veya sunucuda saklanmaz.
2. Alternatif olarak, TSAI'yi herhangi bir enstrüman için özel ön ayarlarla herhangi bir web sitesinde kurun.
   1. https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai'a gidin ve mibi_tsai_standalone dizinini indirin. Alternatif olarak, Ek Kodlama Dosyası 1 .zip dosyasını indirin ve içeriği mibi_tsai_standalone adlı dizine açın.
   2. Herhangi bir metin düzenleyicide mibi_tsai_standalone/_resources/index.js açın.
   3. Gerekirse, FOV boyutunu, bekleme süresi/zamanlama seçimini, raster boyutunu, FOV JSON'u ve önerilen ön ayar ayarlarını, cihazın ayarlarıyla eşleşecek şekilde index.js düzenleyin. Bu esas olarak özelleştirilmiş enstrümanlar için geçerlidir, ancak bekleme süresi/zamanlama seçim çiftleri ne olursa olsun kontrol edilmelidir. index.js tasarruf edin.
   4. mibi_tsai_standalone internet üzerinden erişilebilen herhangi bir web sunucusuna, örneğin bir laboratuvar web sitesine veya üniversite tarafından barındırılan web sitesine yükleyin.
   5. MIBI kullanıcı kontrol bilgisayarının web tarayıcısında mibi_tsai_standalone/index.html açın.

2. MIBI slaytını yükleme ve bir şablon dosyası oluşturma

1. Web tarayıcısında MIBI deney izleyicisinde (taramayla ilgili meta verileri yönetmek için üretici tarafından sağlanan web arabirimi) oturum açın.
2. Slaytlar sekmesinde yeni bir slayt ekleyin ve yeni bir bölüm ekleyin (Ek Şekil 2A-B). Kaynaklar sekmesinde bir işaretçi paneli seçin veya oluşturun (Ek Şekil 2C).
3. Bölümler sekmesinde, yeni bölümü panele ekleyin (Ek Şekil 2D).
4. Web tarayıcısında MIBI kullanıcı denetimi arayüzünde oturum açın. Örneği Değiştir'e tıklayarak ve yeni slaydı seçerek MIBI slaytını yükleyin (Ek Şekil 3A).
5. FOV Ekle'ye tıklayarak (Ek Şekil 3B) ve çerçeve boyutlarını, FOV boyutunu, bekleme süresini, görüntüleme modunu ve bölüm kimliğini ayarlayarak bir şablon FOV oluşturun.
6. FOV listesini bir .json dosyasına aktarın (indirin) (Ek Şekil 3C). Optik görüntüyü .png dosyası olarak indirin (Ek Şekil 3D).

3. Optik görüntü aşaması motor ortak kaydı

1. TSAI'yi açın web tarayıcısında kullanıcı arayüzü. Daha önce ortak kayıt yapılmamışsa, optik ortak kayıt menüsü otomatik olarak açılmalıdır. Yapıldıysa ve yeterliyse, bu adımları tekrarlamayın.
2. Optik Ortak Kayıt menüsünü açın. Otomatik Ortak Kayıt Kodunu Panoya Kopyala'ya tıklayın (Ek Şekil 4A).
3. Web tarayıcısında MIBI kullanıcı denetimi arabirimini açın. Tarayıcı konsolunu açmak için Ctrl+Shift+J tuşlarına basın veya sayfayı sağ tıklatıp İncele'yi tıklatın, ardından Konsol sekmesini açın (Ek Şekil 4B).
4. Kodu konsola yapıştırın ve Enter tuşuna basın. Konsolda oluşturulan bağlantıya tıklayın (Ek Şekil 4C). Bu, ortak kaydı TSAI web kullanıcı arayüzüne yükleyecek ve bir çerez olarak kaydedecektir, böylece cihaz donanımında bir değişiklik olmadıkça devam eder ve tekrarlanması gerekmez.

4. Döşemeli SED taraması

1. Optik görüntü .png yükleyin ve 2.6. adımdaki .json dosyalarını TSAI'ye sürükleyip bırakarak web kullanıcı arayüzü.
2. SED Tiler menüsünü açın ve üst satırdaki bir metin kutusuna tıklayın (Ek Şekil 5A).
3. SED taraması için sol üst köşeyi seçmek için optik görüntüye tıklayın (± sürükleyin) (Ek Şekil 5B).
4. D tuşuna basın veya SED Tiler menüsündeki ikinci satırdaki bir metin kutusuna tıklayın.
5. SED taraması için sağ alt köşeyi seçmek için optik görüntüye tıklayın (± sürükleyin).
6. SED Tiler menüsünde, SED Taramayı Kopyala ve Düzeltme Kodunu Panoya Kaydır'a tıklayın (Ek Şekil 5C).
7. Web tarayıcısında MIBI kullanıcı denetimi arabirimini açın. Kodu konsola yapıştırın ve Enter tuşuna basın (Ek Şekil 5D).
8. MIBI'yi QC - 300 μm ayarında SED moduna alın, elde edilmeyecek bir alana geçin ve kazancı, odağı ve damgalamayı ayarlayın.
   1. Kazancı değiştirmeden SED görüntüsünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Parlaklığı artırmak için B'ye veya azaltmak için Shift+B'ye basın. Kontrastı artırmak için C tuşlarına veya azaltmak için Shift + C tuşlarına basın. Hem parlaklığı hem de kontrastı sıfırlamak için Shift+V tuşlarına basın.
9. Döşenmiş SED taramasını başlatmak için Shift+T tuşlarına basın.
10. Tamamlandığında, döşenmiş SED görüntüsünün yeni bir .png dosyasını otomatik olarak kaydetmelidir (Şekil 3). Dosya adının başına karakterler eklenebilir, ancak dosya adının diğer kısımlarını değiştirmezler.
11. Belirli kutucuklar odak dışındaysa veya başka bir şekilde yanlış taranmışsa, bunları yeniden tarayın.
    1. Yeniden tarama kuyruğuna bir kutucuk eklemek için Shift+R tuşlarına basın. Kullanıcıdan kutucuğun satırını ve sütununu isteyen bir iletişim kutusu açılır. Sayılar sıfır indekslidir, bu nedenle 8,0 girildiğinde dokuzuncu satır, ilk sütun yer alır.
    2. İlgili tüm kutucukları kuyruğa ekledikten sonra, yeniden taramak için Shift+T tuşlarına basın. Tamamlandığında, döşenmiş SED görüntüsünün yeni bir .png dosyasını otomatik olarak kaydetmesi gerekir.
12. Kritik adım: Döşemeli SED taramasında büyük yanlış hizalamalar olup olmadığını inceleyin (Şekil 3C-D). Varsa, motoru ve görüntüleme ışınını ayarlamak için üretici desteğiyle iletişime geçin veya 4.12.1 ila 4.12.9 arasındaki adımlardaki klavye kontrollerini kullanarak manuel yazılım düzeltmesini deneyin (Ek Şekil 6A).
    1. SED-stage motor hizalamasını kontrol etmek için, slaytın dokusuz bir alanına gidin. Bir dama tahtası deseninde beş adet 400 μm FOV yakmak için Shift+5'e (Ek Şekil 6B-C) veya 9 μm FOV'luk 3 x 400 deseni yakmak için Shift+ 6'ya basın (Ek Şekil 6D-E).
    2. FOV sütunları birbirinden çok uzaksa, 1'e basın ve x f(x) değerini negatif bir ondalık sayıya ayarlayın, genellikle -0,0025 ile -0,1 arasında.
    3. Üçüncü satır FOV'ları birinci satır FOV'larına göre sola kaydırılırsa, 2'ye basın ve x f(y) değerini genellikle 0,0025 ile 0,1 arasında pozitif bir ondalık sayıya ayarlayın.
    4. Üçüncü sütun FOV'ları ilk sütun FOV'larına göre aşağı doğru kaydırılırsa, 3'e basın ve y f(x) değerini negatif bir ondalık sayıya, tipik olarak -0,0025 ile -0,1 arasında ayarlayın.
    5. FOV satırları birbirinden çok uzaksa, 4'e basın ve y f(y) değerini negatif bir ondalık sayıya, tipik olarak -0,0025 ile -0,1 arasında ayarlayın.
    6. Dama tahtası ve 4.12.1 x 4.12.5 desenleri kabaca düz bir ızgara oluşturana kadar 3 ila 3 arasındaki adımları yinelemeli olarak tekrarlayın (Ek Şekil 6C, E).
    7. Desenin .png bir görüntüsünü dosya adındaki düzeltme değerleriyle kaydetmek için S tuşuna basın.
    8. Değerleri yüklemek ve tarayıcı çerezine kaydetmek için bu .png dosyasını TSAI web kullanıcı arayüzüne sürükleyip bırakın.
    9. Katsayıları kontrol etmek için döşemeli SED taramaları gerçekleştirin. 4.12.2 ila 4.12.5 arasındaki adımlarda olduğu gibi aynı ilkelere dayanarak, döşenmiş SED görüntülerindeki yanlış hizalamaları düzeltmek için katsayılarda daha fazla ayarlama yapın.
13. Döşenmiş SED yeterliyse, Escape tuşuna basın. TSAI web kullanıcı arayüzüne geri dönün.
14. Döşenmiş SED .png dosyasını TSAI web kullanıcı arabirimine sürükleyip bırakın (Ek Şekil 5E).
15. SED sekmesine tıklayın ve yakınlaştırmayı ayarlayın (Ek Şekil 5F).
16. Görüntü parlaklığını ve kontrastını ve/veya çizgi kalınlığı ve imleç boyutu gibi çizim seçeneklerini ayarlamak için SED görüntüsünün üzerindeki kaydırma seçenekleri menüsünü kullanın.
17. Klavye kısayolları mevcuttur ve çoğu görüntü denetimlerinin yanında gösterilir: Yakınlaştırmak için Z tuşlarına ve uzaklaştırmak için Shift + Z tuşlarına basın. Parlaklığı artırmak için B'ye veya azaltmak için Shift+B'ye basın. Kontrastı artırmak için C tuşlarına veya azaltmak için Shift + C tuşlarına basın. Hem parlaklığı hem de kontrastı sıfırlamak için Shift+V tuşlarına basın. Kutucukların üzerindeki etiketleri değiştirmek için L tuşuna basın. Netleme bölgelerinin etrafına çizilen 5 mm yarıçaplı daireler arasında geçiş yapmak için O düğmesine basın.

5. Doku mikrodizisi (TMA)

1. TMA noktalarından oluşan bir ızgara için FOV'ları ayarlıyorsanız, önce çoğaltılacak FOV'ların modelini ayarlayın. Döşemeler sütununun ilgili döşemesinde, sütunları ve satırları ayarlayın (Şekil 4A) ve haritadaki kutuları işaretleyin/işaretini kaldırın (Şekil 4B) ve diğer FOV ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın.
2. İlgili kutucukta, TMA seçenekleri menüsünü açmak için TMA'ya tıklayın (Şekil 4C). TMA noktalarının satır ve sütun sayısını ayarlayın (Şekil 4D). Gerekirse, bir adlandırma öneki ekleyin (Şekil 4E) ve başlangıç satırı ve sütun numaralandırmasını düzenleyin (Şekil 4F).
3. Slayt görüntüsünde, TMA'nın dört köşesine tıklayın (Şekil 4G-J). Artı işaretlerinin konumlarını TMA noktalarıyla en iyi şekilde eşleşecek şekilde ayarlamak için daire içine alınmış köşelere tıklayın ve sürükleyin.
4. TMA seçenekleri menüsünden TMA Oluştur'a tıklayın (Şekil 4K).
5. Konumunu kontrol etmek için kutucuklar sütunundaki her bir döşemenin üzerine gelin. Ayarlamak için Taşı'ya tıklayın (Şekil 4L). Ardından slayt görüntüsüne tıklayıp sürükleyin veya klavyenin ok tuşlarına basın.
   1. Daha uzak bir mesafe gitmek için ok tuşlarına basarken Shift tuşunu basılı tutun. Daha kısa bir mesafe taşımak için ok tuşlarına basarken Alt (Windows) veya Opt (Mac) tuşunu basılı tutun.
   2. Taşı seçildiğinde, döşeme adının yanındaki onay kutusunun işaretini kaldırmak, kutucuğu görünümden kaldırmak ve daha sonra oluşturulan .json dosyalarından çıkarmak için T tuşuna basın. Alternatif olarak, onay kutusunun işaretini doğrudan fareyle kaldırın (Şekil 4M) veya Sil'e tıklayarak tamamen kaldırın.
   3. Hareket seçildiğinde, FOV boyutunu sırasıyla 200 μm, 400 μm veya 800 μm olarak ayarlamak için 2, 4 veya 8 düğmesine basın ve raster boyutları, görüntüleme çözünürlüğü değişmeden kalacak şekilde orantılı olarak ölçeklendirilecektir.
   4. Taşı seçildiğinde, önceki kutucuğa gitmek için A'ya basın veya sonraki kutucuğa gitmek için D'ye basın.
   5. Diğer döşeme ayarlarını yapmak için, görünmüyorsa ayarlar menüsünü genişletmek için ≡ düğmesine tıklayın.

6. Alan/çokgen döşeme

1. FOV'ları bitişik bir doku alanını kaplayacak şekilde ayarlıyorsanız, önce Kutucuklar sütununun ilgili kutucuğunda FOV ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın.
2. İlgili kutucukta Çokgen'e tıklayın (Şekil 5A). Döşenecek alanın köşelerini/köşelerini ayarlamak için slayt görüntüsüne tıklayın (Şekil 5B-C). Çokgeni kapatmak ve alanı FOV'larla kaplamak için çift tıklayın (Şekil 5D).
3. Döşeme haritasını görmek için Döşemeler sütununun en altına kaydırın ve yeni çokgen döşemesindeki ≡ düğmesini (^ genişletildiğinde, Şekil 5E) tıklayın.
4. Döşeme haritasına tıklayarak (Şekil 5F) veya Clicker'a (Şekil 5G) tıklayarak ve slayt görüntüsündeki döşenmiş FOV'lara tıklayarak tek tek döşemeleri AÇIK veya KAPALI konuma getirin.
5. Birden fazla FOV'u kapatmak için Silgi'ye tıklayın ve ardından slayt görüntüsündeki döşenmiş FOV'lara tıklayıp sürükleyin (Şekil 5H).
6. Birden fazla FOV'u açmak için Clicker'a (Şekil 5G) tıklayın ve ardından döşeme haritasının kapsadığı slayt görüntüsündeki boş alanlara tıklayıp sürükleyin.
7. Yukarıdaki satırları eklemek için ▲ düğmesine tıklayın (Şekil 5I). Sola sütun eklemek için ◄ düğmesini tıklayın (Şekil 5J).
8. Döşeme konumunu ayarlamak için Taşı'yı tıklatın (Şekil 5K). Ardından slayt görüntüsüne tıklayıp sürükleyin, klavyedeki Ok tuşlarına basın veya 5.5.1 ile 5.5.5 arasındaki adımlarda açıklanan diğer denetimleri kullanın.

7. FOV navigasyonu ve ayarı

1. SED döşeme yanlış hizalanmışsa veya optik görüntü artı işareti gerçek stage motor konumunu yansıtmıyorsa, aşağıdaki klavye kontrollerinin yardımıyla MIBI kullanıcı kontrol arayüzünde SED modunda FOV konumlarını ayarlayın.
2. Slayt (optik veya SED) görüntüsünün altındaki FOV gezinme/ayarlama menüsünü açın. FOV Gezinme Kodunu Panoya Kopyala'ya tıklayın.
3. Web tarayıcısında MIBI kullanıcı denetimi arabirimini açın. MIBI'yi SED moduna getirin ve kazancı, odağı ve damgalamayı ayarlayın.
4. Tarayıcı konsolunu açmak için Ctrl+Shift+J tuşlarına basın veya sayfayı sağ tıklayıp İncele'yi tıklatın ve ardından Konsol sekmesini açın.
5. Kodu konsola yapıştırın ve Enter tuşuna basın. Kod otomatik olarak ilk FOV'a ve MIBI kullanıcı kontrol arayüzünün SED görüntüsünde görüntülenen tam FOV konumlandırmasına gidecektir.
6. Kazancı değiştirmeden SED görüntüsünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Parlaklığı artırmak için B'ye veya azaltmak için Shift+B'ye basın. Kontrastı artırmak için C tuşlarına veya azaltmak için Shift + C tuşlarına basın. Hem parlaklığı hem de kontrastı sıfırlamak için Shift+V tuşlarına basın.
7. SED büyütmesini ayarlamak için M (200 μm), , (400 μm), . (800 μm) veya / (maksimum) tuşlarına basın.
8. FOV'u hareket ettirmek için klavyedeki Ok tuşlarına basın. W tuşuna basarak konumu kaydedin. Daha uzak bir mesafe gitmek için ok tuşlarına basarken Shift tuşunu basılı tutun. Daha kısa bir mesafe taşımak için ok tuşlarına basarken Alt (Windows) veya Opt (Mac) tuşunu basılı tutun. Herhangi bir döşemenin yalnızca R1C1'inin taşınabileceğini unutmayın.
9. Bir FOV'u AÇIK veya KAPALI konuma getirmek için T tuşuna basın. FOV boyutunu değiştirmek için 2 (200 μm), 4 (400 μm) veya 8 (800 μm) düğmesine basın. Raster boyutları, görüntüleme çözünürlüğü aynı kalacak şekilde orantılı olarak ölçeklendirilecektir.
10. SED görüntüsünün ve üst üste bindirilmiş artı işaretinin bir görüntü dosyasını kaydetmek için S tuşuna basın. Ayarlamaların taslağını bir .txt dosyasına kaydetmek için X tuşuna basın.
11. Memnun kaldığınızda, bir sonraki FOV'a gitmek için D'ye veya önceki FOV'a geri dönmek için A'ya basın. Tüm FOV'lar için 7.6 ila 7.11 arasındaki adımları tekrarlayın.
12. Tüm FOV'larla işiniz bittiğinde, X veya Escape tuşuna basın. Ayarlamalar .txt bir dosyaya kaydedilecek ve panoya kopyalanacaktır.
13. TSAI web kullanıcı arayüzüne geri dönün. .txt dosyasını TSAI web kullanıcı arayüzüne sürükleyip bırakın veya ayarlamaları FOV gezinme/ayarlama menüsündeki metin kutusuna yapıştırın.
14. Ayarlamaları Kutucuklar sütunundaki kutucuklara uygulamak için Ayarla'yı tıklatın.

8. JSON dosyası oluşturma ve içe aktarma

1. Kutucuklar sütununun altında, Çıktı'nın altında, kutucuk listesini ve tahmini çalışma süresini kontrol edin (Ek Şekil 7A).
2. Grup altında, FOV gruplaması için bir seçenek belirleyin (Ek Şekil 7B). Gruplandırmanın sıralı olarak sıralanan .json dosyası üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
   1. Rastgele .json dosyası için, FOV'ları döşemeye göre gruplandırmak, FOV'ları, döşemeler rastgele sırada olsa bile belirli bir döşeme içindeki tüm FOV'lar bir arada kalacak şekilde sıralar.
   2. Rastgele .json dosyası için, FOV'ları gruplamayın, farklı döşemelerden FOV'lar karıştırılacak şekilde FOV'ları rastgele sıralar.
   3. Çalışma sırasında otomatik odaklama belirtilmişse, FOV'lar otomatik olarak en yakın otomatik odaklama alanına göre gruplandırılacaktır.
3. Bölme altında, birden çok .json dosyasına bölmek için bir seçenek belirleyin (Ek Şekil 7C).
   1. Bölme, tüm FOV'ları yalnızca bir .json dosyasında tutacaktır.
   2. Her # FOV'a göre bölme, FOV'ları birden çok .json dosyasına böler ve burada her dosya belirtilen sayıda FOV içerir.
   3. Her # saatte bir # dakikada bir bölme, FOV'ları birden çok .json dosyasına böler, burada her dosyanın tahmini çalışma süresi kabaca belirtilen süredir.
4. Yeniden Düzenle menüsünü açarak .json dosyalarındaki FOV'ların sırasını görüntüleyin ve yeniden düzenleyin (Ek Şekil 7D). Bir FOV'u taşımak için, tıklayın ve istediğiniz konuma sürükleyin. Diğer FOV'lar, sürüklenen FOV etrafında etkileşimli olarak yeniden düzenlenecektir.
5. .json dosyalarını kaydetmek için, yeniden düzenle menüsünün altındaki FOVs düğmesine (düğmelerine) tıklayın. Sıralı .json, FOV'ları döşemeye, ardından satıra ve ardından sütuna göre sıraya koyar (Ek Şekil 7E). Rastgele .json, adım 8.2'de seçildiği gibi gruplar içindeki FOV'ları rastgele hale getirir (Ek Şekil 7F).
6. FOV'lar ve uygulanan görüntüleme seçenekleriyle (döşeme etiketleri, parlaklık, kontrast vb.) dokunun bir görüntüsünü kaydetmek için, Döşenmiş Görüntüyü Kaydet'i tıklatın (Ek Şekil 7G). Bu genellikle kayıt tutma ve ortak çalışanlarla paylaşma için kullanışlıdır.
7. MIBI kullanıcı denetimi arabirimine geri dönün. FOV'ları İçe Aktar'a tıklayın ve oluşturulan .json dosyasını seçin. Odağı, damgayı ve akımı gerektiği gibi ayarlayın ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.

Results

TSAI, FOV'ları ayarlamak için iki yöntem sağlar (Şekil 2). Biri, mevcut diğer yöntemlere benzer şekilde yalnızca optik görüntüyü (Şekil 2, TSAI, sol dal) kullanır. İkinci yöntem - döşenmiş bir SED görüntüsü oluşturmak - TSAI'ye özgüdür (Şekil 2, TSAI, sağ dal). TSAI, FOV'ları bu görüntüye doğru bir şekilde çizerek, üretici arayüzü SED modunda FOV'ları yerine oturtmak için saatler harcama ihtiyacını ortadan kaldırır. Bununla birlikte...

Discussion

Çoğullanmış iyon ışını görüntüleme (MIBI), ayrıntılı hücresel fenotipleri ve doku histomimarisini^incelemek için güçlü bir tekniktir 5,6,7,8,9,10,11. MIBI ile ilgili hesaplama çabaları, büyük ölçüde görüntülemeden sonra verilerin işlenmesine odaklanmıştır, a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBI bilgisayar	Ionpath
MIBIcontrol (yazılım)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Çoklanmış İyon Işını Görüntüleme (MIBI) mikroskobu
MIBIslide	Ionpath	567001
Karo/SED/Dizi Arayüzü (TSAI) (yazılım)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/