ICP-MS ile Çok Elementli Tayin için Homojenizasyon ve Mikrodalga Destekli Islak Asitle Parçalama Kullanılarak Gıda Numunelerinin Hazırlanması

Element analizi, çeşitli numunelerin element bileşimini belirlemek için analitik bir işlemdir. Metallerin (özellikle ağır metaller¹) insan vücuduna alımını kontrol etmek için kullanılabilir, çünkü yüksek konsantrasyonları istenmeyen sağlık sorunlarına neden olabilir. Ağır metaller aynı zamanda ana çevresel kirleticilerden biridir, bu nedenle çevredeki varlıklarının kontrolü gereklidir². Ayrıca, gıda ürünlerinin coğrafi kökenini^{belirlemek 3} ve gıda ve su kaynaklarının kalitesini kontrol etmek^{için element analizi yapılabilir 4}. Ayrıca, topraklardaki mikro ve makro besin maddelerinin belirlenmesi 5 ve minerallerin^ve çökeltilerin kimyasal bileşimini inceleyerek tarih boyunca jeolojik süreçler hakkında bilgi edinmek^{için kullanılır 6}. Daha fazla metal rejenerasyonu⁷ için elektrikli ve elektronik atıklarda nadir metallerin varlığını belirlemek, ilaç tedavilerinin^{başarısını değerlendirmek 8} ve metal implantların temel bileşimini doğrulamak^{için 9} çalışmalar yapılmıştır.

Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) ve endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES), çeşitli numunelerin element analizi için yaygın olarak kullanılan tekniklerdir¹⁰. ng/L kadar düşük tespit limitleri (LOD) ve miktar belirleme limitleri (LOQ) ile birden fazla elementin aynı anda belirlenmesine izin verirler. Genel olarak, ICP-MS, ICP-OES^12'ye kıyasla daha düşük LOD değerlerine¹¹ ve daha geniş bir doğrusal konsantrasyon aralığına sahiptir. Elementel bileşimi belirlemeye yönelik diğer teknikler, mikrodalga kaynaklı plazma optik emisyon spektrometrisi¹³ ve alevli atomik absorpsiyon spektroskopisi, elektrotermal atomik absorpsiyon spektroskopisi², soğuk buhar atomik absorpsiyon spektroskopisi ve hidrit üretimi atomik absorpsiyon spektroskopisi¹⁴ dahil olmak üzere çeşitli atomik absorpsiyon spektroskopisi (AAS) varyantlarıdır. Ayrıca, düşük LOD ve LOQ ile element tayini, özellikle anodik sıyırma voltametrisi^15,16 ile farklı elektroanalitik yöntemlerle mümkündür. Tabii ki, numunelerin temel bileşimini belirlemek için başka yöntemler de vardır, ancak bunlar yukarıda belirtilen yöntemler kadar sık kullanılmazlar.

Katı numunelerin doğrudan elementel tayini, lazer kaynaklı kırılma spektroskopisi ve X-ışını floresansı¹⁷ kullanılarak mümkündür. Bununla birlikte, ICP-MS, ICP-OES ve AAS ile element tayini için katı numunelerin sıvı hale dönüştürülmesi gerekir. Bu amaçla, asit sindirimi asitler ve yardımcı reaktifler (çoğu durumda_H2O2) kullanılarak gerçekleştirilir. Asitle parçalama, yüksek sıcaklık ve basınçta gerçekleştirilir, numunenin organik kısmı gaz halindeki ürünlere dönüştürülür ve metal elementler suda çözünür tuzlara dönüştürülür, böylece çözelti içinde çözülür¹⁸.

Açık damar sindirimi ve kapalı kap sindirimi olmak üzere iki ana asit sindirimi türü vardır. Açık kap çürütme uygun maliyetlidir¹⁴ ancak atmosferik basınçta asitlerin kaynama sıcaklığına denk gelen maksimum çürütme sıcaklığı gibi sınırlamaları vardır. Numune, sıcak plakalar, ısıtma blokları, su banyoları, kum banyoları² ve mikrodalgalar¹⁹ ile ısıtılabilir. Numuneyi bu şekilde ısıtarak, üretilen ısının çoğu çevreye^{20 kaybolur ve} bu da sindirim süresini^{uzatır 14}. Açık kap çürütmesinin diğer dezavantajları arasında daha fazla kimyasal tüketim, çevredeki ortamdan daha fazla kontaminasyon olasılığı ve uçucu bileşenlerin oluşumu ve bunların reaksiyon karışımından^{buharlaşması nedeniyle} olası analit kaybı yer alır 21.

Kapalı kap sistemleri, açık kap sistemlerine göre organik ve inorganik numunelerin çürütülmesi için daha uygundur. Kapalı kap sistemleri, numuneleri ısıtmak için iletim ısıtma ve mikrodalgalar gibi çeşitli enerji kaynakları kullanır²². Mikrodalgaları kullanan çürütme yöntemleri arasında mikrodalga kaynaklı yanma²³, tek reaksiyon odası sistemleri²⁴ ve yaygın olarak kullanılan mikrodalga destekli ıslak asitle parçalama (MAWD)^25,26 bulunur. MAWD, cihazın çalışma koşullarına bağlı olarak 220 °C ile 260 °C arasında değişen daha yüksek çalışma sıcaklıklarında ve 200 bar'a kadar maksimum basınçlarda sindirime izin verir²⁷.

MAWD'nin verimliliği ve oranı, numunelerin kimyasal bileşimi, maksimum sıcaklık, sıcaklık gradyanı, reaksiyon kabındaki basınç, eklenen asitlerin miktarı ve kullanılan asitlerin konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır²⁸. MAWD'de, açık kap sistemlerindeki daha uzun süreli çürütmelere kıyasla yüksek reaksiyon koşulları nedeniyle birkaç dakika içinde tam asit çürütmesi sağlanabilir. Mevcut yeşil kimya yönergelerine uygun olan MAWD'de daha düşük hacimler ve asit konsantrasyonları gereklidir²⁹. MAWD'de, asitle parçalamayı gerçekleştirmek için açık kap çürütmeye kıyasla daha az miktarda örneğe ihtiyaç duyulur, genellikle 500 mg'a kadar örnek yeterlidir 30,31,32. Daha büyük numune miktarları sindirilebilir, ancak daha büyük miktarda kimyasal gerektirirler.

MAWD cihazı reaksiyon koşullarını otomatik olarak kontrol ettiğinden ve kişi ısıtma sırasında kimyasallarla doğrudan temas etmediğinden, MAWD'nin çalıştırılması açık kap çürütmelerinden daha güvenlidir. Bununla birlikte, kişi, vücutla temas etmelerini ve zarar vermelerini önlemek için reaksiyon kaplarına kimyasallar eklerken her zaman dikkatli davranmalıdır. Asitle sindirim sırasında içlerinde basınç oluştuğu için reaksiyon kaplarının da yavaşça açılması gerekir.

Asitle sindirim, element tayini için numune hazırlamak için yararlı bir teknik olsa da, bunu yapan kişi olası sınırlamalarının farkında olmalıdır. Asitle parçalama, özellikle karmaşık matrislere sahip olanlar ve yüksek oranda reaktif olan veya patlayıcı reaksiyona girebilen numuneler olmak üzere tüm numuneler için uygun olmayabilir. Bu nedenle, çözelti içinde istenen tüm elementleri çözen tam sindirim için uygun kimyasalları ve reaksiyon koşullarını seçmek üzere numune bileşimi her zaman değerlendirilmelidir. Kullanıcının dikkate alması ve ele alması gereken diğer endişeler, numune hazırlamanın her adımında safsızlıklar ve analit kaybıdır. Asit sindirimi her zaman belirli kurallara göre veya protokoller kullanılarak yapılmalıdır.

Aşağıda açıklanan protokol, gıda numunelerinin laboratuvar boyutunda bir karıştırıcıda homojenizasyonu, karıştırıcının bileşenlerinin temizlenmesi için bir prosedür, numunenin uygun şekilde tartılması, kimyasalların eklenmesi, MAWD ile asitle parçalamanın gerçekleştirilmesi, çürütme tamamlandıktan sonra reaksiyon kaplarının temizlenmesi, numunelerin element tayini için hazırlanması ve ICP-MS ile kantitatif çok elementli bir tayin gerçekleştirilmesi için talimatlar sağlar. Aşağıda verilen talimatlar izlenerek, element tayinine uygun bir numune hazırlanabilmeli ve sindirilmiş numunelerin ölçümleri yapılabilmelidir.

1. Numune homojenizasyonu

1. Kurutma işlemini hızlandırmak için temiz bir seramik bıçak kullanarak gıda numunelerini (brokoli, mantar, sosis ve erişte) manuel olarak daha küçük parçalara ayırın. Asit sindiriminin en az 6 kopyası için yeterli numune hazırlayın (kurutulmuş numunelerin minimum kütlesinin 1500 mg olduğundan emin olun).
   NOT: Numunenin yüzey alanının arttırılması, numunenin daha büyük bir bölümünü ısıtılmış çevre havasına maruz bırakarak suyun buharlaşma hızını artırır.
2. Numuneyi 250 mL'lik bir cam behere yerleştirin ve bir kurutucu kullanarak 105 °C'de sabit bir ağırlığa kadar kurutun.
3. Numunenin bulunduğu cam kabı kurutucudan çıkarın ve desikatöre yerleştirin.
4. Numunenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
   NOT: Ağırlığın kütleyi doğru bir şekilde yansıttığından emin olmak için numuneler sabit bir sıcaklıkta tartılmalıdır. Sıcaklık değişimleri, ölçülen numunelerin hacmini ve yoğunluğunu etkileyebilir.
5. Nem gidericiyi açın ve numuneyle birlikte cam kabı analitik teraziye aktarın. Numune ile cam kabın ağırlığını ölçün.
6. Tartım tamamlandıktan sonra numuneyi tekrar kurutucuya koyun.
   NOT: Numune kurutma sırasında önemli ölçüde küçülürse, daha uygun tartım için plastik bir spatula kullanılarak daha küçük bir cam behere aktarılabilir.
7. Numunenin sabit bir ağırlığı elde edilene kadar işlemi adım 1.3-1.6'da açıklandığı gibi tekrarlayın.
8. Kurutulmuş heterojen numuneyi mikser kabına yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın), mikser kabının maksimum hacmini aşmadığından emin olun.
9. Mikser kabını miksere yerleştirin ve koruma kapağını kapatın (Şekil 1).
10. Numuneyi öğütmek ve karıştırmak için bıçakları etkinleştirmek için başlat düğmesine basın.
11. Numune ince bir toz veya homojen bir macun haline gelene kadar öğütme işlemini gerçekleştirin. Böyle bir ürün elde etmek için öğütme işlemini birkaç kez tekrarlayın.
12. Numune homojen hale geldiğinde, karıştırıcıyı kapatın, koruma kapağını açın ve karıştırıcı kabını çıkarın.
13. Homojenize edilmiş numuneyi mikser kabından çıkarın ve temiz bir plastik spatula kullanarak 50 mL'lik temiz bir cam behere aktarın (Şekil 2).
    NOT: Numune çok sertse ve karıştırıcının bıçaklar ve karıştırıcı kabı gibi bileşenlerine potansiyel olarak zarar verebilirse, harçlarda ezmek gibi başka yollarla homojenize edilebilir. Mikserler genellikle mikserin bileşenlerine zarar verebilecek sert malzemeleri, donmuş numuneleri veya kolayca yanıcı numuneleri homojenize etmek için uygun değildir. Karıştırıcıda organik çözücülerin kullanılması önerilmez.
    DİKKAT: Güvenlik tertibatı kullanın ve mikserin bıçakları yüksek hızlarda dönerken mikser kapısının yeterince kapalı olduğundan emin olun.

2. Mikser temizliği

1. Boş mikser kabının işaretine ultra saf su ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Mikser kabını miksere yerleştirin ve standart karıştırma prosedürünü gerçekleştirin.
3. Beheri karıştırıcıdan çıkarın ve atık suyu boşaltın. Gerekirse, karıştırdıktan sonra bile su temiz kalana kadar işlemi ultra saf suyla birkaç kez tekrarlayın.
4. Kirlenmiş bıçakları ve diyafram contasını mikserden çıkarın ve ultra saf suyla iyice temizleyin.
   NOT: Yağ laboratuvar envanterinin yüzeyine kolayca yapıştığından, özellikle yüksek yağ içeriğine sahip numunelerle uğraşırken temizleme verimliliğini artırmak için nötr deterjanlar kullanın.
   DİKKAT: Keskin kenarlarından kaynaklanan olası yaralanma riskini azaltmak için bıçakları çıkarırken ve temizlerken eldiven gibi uygun koruyucu ekipman kullanın.
5. Temizlenen bileşenleri kurutucuda 105 °C'de kurutun ve miksere tekrar yerleştirin.
   NOT: Suyun aşağıdaki örneğe taşınmasını önlemek için miksere yeniden takmadan önce mikserin bileşenlerinin tamamen kuru olduğundan emin olun.ample.

3. Numune tartımı

1. 100 mL triflorometoksil-politetrafloroetilen TFM-PTFE reaksiyon kabından³³ kapak kapağını çıkarın.
2. Açık reaksiyon kabını analitik teraziye yerleştirin ve her ölçümden önce terazinin dengelendiğinden ve sıfırlandığından emin olun (Şekil 3).
   NOT: Tartım oda sıcaklığında yapılmalıdır. Şiddetli sıcaklık dalgalanmalarının ve hava akışının ölçülen ağırlığı etkileyebileceği alanlardan kaçının. Tartım alanının temiz olduğundan ve kirletici madde içermediğinden emin olun.
3. Homojenize numuneyi plastik bir spatula kullanarak reaksiyon kabına aktarın ve numuneyi 250 mg tartın. Numuneyi, analitik terazinin minimum ağırlık sınırının altında tartmayın.
4. Tartım tamamlandıktan sonra, numuneyi kontaminasyondan korumak için kapak kapağını reaksiyon kabının üzerine yerleştirin.
   NOT: Sindirim prosedürünün ağırlık sınırının aşılması, eksik sindirime neden olabilir. Herhangi bir dış kontaminasyonu önlemek için numuneyi ve reaksiyon kaplarını dikkatli kullanın.

4. Asit ilavesi

1. Sırasıyla ağırlıkça yaklaşık 40.0 mL %68 HNO₃ ve ağırlıkça %30 5.0 mL_H2O2'yi ayrı 50 mL cam beherlere dökün.
   NOT: Kimyasallar, ideal olarak ng/L (ppt) aralığında, 1,0 μg/L'den (ppb) daha az eser metal safsızlıkları ile yüksek saflıkta olmalıdır. Eser metal safsızlıkları, element tayininin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini etkiler.
2. Reaksiyon kaplarını bir çeker ocak içine yerleştirin, kapak kapaklarını açın ve aşağıda belirtilen hacimlerde ağırlıkça %68 HNO₃ ve ağırlıkça %30_H2O2'yi 1 mL veya 5 mL otomatik pipetlerle aşağıdaki özelliklere göre ekleyin:
   1. Brokoli, mantar, sosis ve erişte; 250 mg numune için ağırlıkça 5.0 mL %68 HNO₃ ve ağırlıkça 1.0 mL ağırlıkça %30_H2O2 ekleyin. Her örnek için üç kopya hazırlayın.
   2. Yöntemin doğruluğunu belirlemek için (geri kazanım açısından, Rec), adım 4.2.1'de açıklanan prosedürü kullanın ve 200 μL'lik bir otomatik pipet kullanarak reaksiyon kaplarına 37,5 μL 100 mg/L ICP çok elemanlı standart çözelti (Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Her örnek için üç kopya hazırlayın.
      NOT: 37.5 μL'lik hacim, numunelerin çivili çözeltileri için 15.0 μg/L'lik bir artışa karşılık geldiği için seçilmiştir. Ayrıca, numunelerin çivili çözeltisi için konsantrasyondaki artış, ölçülen her analit için hala doğrusal konsantrasyon aralığında olan nihai konsantrasyona karşılık gelir.
   3. Adım 4.2.1'de gıda numunelerinin sindirimi için kullanılanla aynı hacimde ağırlıkça %68_HNO3 ve ağırlıkça %30_H2O2kullanarak boş bir numune hazırlayın. Boş bir numune için, numuneyi reaksiyon kaplarına eklemeyin.
      DİKKAT: Sindirim için kullanılan_HNO3 aşındırıcıdır ve duman üretir. Bu nedenle çeker ocakta mutlaka asit ilavesi yapılmalıdır. Standart laboratuvar koruyucu ekipman kullanılmalıdır (eldivenler, koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlüğü). Asitle temas varsa, etkilenen bölge derhal soğuk su akışı altında durulanmalı ve tıbbi yardım alınmalıdır.
3. Kapak kapağını reaksiyon kaplarının üzerine yerleştirin ve numunelerin ağırlıkça %68_HNO3 ve ağırlıkça %30_H2O2ile 2-3 dakika reaksiyona girmesine izin verin.
4. İplik kapağını kap üzerine vidalayın ve kapak kapaklarını sıkın.
5. Numuneleri kimyasallara tam olarak dahil etmek için hafif el hareketlerini kullanarak reaksiyon kabını sallayın.
   NOT: Numuneleri reaksiyon kaplarının duvarlarında veya kapaklarında bırakmayın, çünkü tamamen sindirilmeme ihtimalleri vardır.

5. Mikrodalga destekli ıslak asitle sindirim

1. Başlat düğmesine basarak asitle parçalama için mikrodalga sistemini açın (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 4).
2. Mikrodalga fırın kapağını açın ve rafı çıkarın.
3. Numunelerin mikrodalgalarla eşit şekilde ışınlanmasını sağlamak için kapalı reaksiyon kaplarını rafa simetrik olarak dağıtın.
4. Rafı mikrodalga haznesine yerleştirin ve bir tutucuya monte edin (Şekil 5).
5. Mikrodalga fırının kapağını kapatın.
6. Kalem şeklinde bir alet kullanarak mikrodalga fırının dokunmatik ekranında uygun bir sindirim programı ayarlayın. Uygun bir sıcaklık gradyanı, son sıcaklık ve sindirilecek numune sayısını seçin. Farklı gıda örnekleri için önerilen sindirim programı aşağıda listelenmiştir:
   1. Brokoli, mantar, sosis ve erişte: 10 dakika artışla 160 °C'ye, 10 dakika artışla 200 °C'ye, 200 °C'de 15 dakika, maksimum güç 900 W.
7. Sindirim programını başlatın ve reaksiyon koşullarındaki değişimi ekranda izleyin. Sıcaklık öngörülen programa göre artmazsa sindirim işlemini durdurun.
   NOT: Sindirim sırasında mikrodalga fırın ekranında ani sıcaklık artışları görülebilir. Numuneler kimyasallarla ekzotermik reaksiyona girdiğinde ortaya çıkarlar. Mikrodalga sistemi, çıkış gücünü ayarlayarak sıcaklığı otomatik olarak düzenleyecektir.
8. Mikrodalga destekli parçalama tamamlanana ve numunenin sıcaklığı düşene kadar bekleyin.
9. Mikrodalga fırın kapağını açın ve rafı mikrodalga fırın haznesinden çıkarın. Kapıyı kapatın ve cihazı kapatın.
10. Reaksiyon kaplarını raftan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.
11. Asitle sindirim sırasında oluşan gazları serbest bırakmak için kapak kapaklarını manuel olarak yavaşça açın. Reaksiyon kaplarını çeker ocak yönünde çevirin (Şekil 6).
12. Kapağı tamamen çıkarın ve reaksiyon kabının kapağını ve duvarlarını az miktarda ultra saf suyla durulayın.
13. Kapağın ve reaksiyon kabının ultra saf su ile tekrar tekrar durulanmasıyla, reaksiyon kabının içeriğini bir cam huniden temiz bir 25 mL cam hacimsel şişeye kantitatif olarak aktarın.
14. Numuneyi hacimsel şişenin işaretine kadar ultra saf suyla seyreltin. Hacimsel şişeyi bir tıpa ile kapatın ve hacimsel şişenin içeriğini karıştırın.
    NOT: Sindirilmiş numunelerin ultra saf su ile daha fazla seyreltilmesi, %5'ten (V/V) daha az kalıntı asit³⁴ ve toplam çözünmüş^katılar 35 olarak da adlandırılan 2 g/L'den az çözünmüş element içermeleri gerektiğinden yapılmalıdır.
15. 20 mL'lik bir plastik şırınga alın ve bir poliamid şırınga filtresine (25 mm çap, 0,20 μm gözenek boyutu) bağlayın. Plastik şırıngayı seyreltilmiş numune ile doldurun ve içeriğini basınç uygulayarak 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne süzün. Herhangi bir çapraz kontaminasyonu önlemek için her numune için yeni bir plastik şırınga ve şırınga filtresi kullanın.
    NOT: MAWD'den sonra sindirilmemiş kalabilecek çözünmeyen maddeleri veya katı parçacıkları uzaklaştırmak için numunelerin filtrelenmesi gerekir. Bu parçacıklar, alet bileşenlerini tıkayarak element belirleme ölçümlerine müdahale edebilir. Numuneleri filtrelerken, ilk birkaç damlayı attığınızdan emin olun. Sulu çözeltiler için hidrofilik filtreler (poliamidden yapılmış) kullanın. Hidrofobik filtreler (PTFE), membran yırtılmasına neden olabilecek daha yüksek bir basınç gerektirdiğinden sulu çözeltilerin filtrasyonu için uygun değildir³⁶.
16. 50 mL'lik plastik santrifüj tüpünü vidalı bir kapakla kapatın ve numuneyi ölçümler yapılana kadar buzdolabına koyun.
    NOT: Sindirilmiş numuneler, muhafaza edilmeleri ve saklama sürelerinin uzatılması için buzdolabında daha düşük sıcaklıklarda saklanır.

6. Reaksiyon kabı temizliği

1. Sindirilmiş numuneler 50 mL'lik hacimsel şişelere aktarıldıktan sonra, reaksiyon kaplarına ağırlıkça 5,0 mL %68 HNO₃ ve 5,0 mL otomatik pipetlerle 5,0 mL ultra saf su ekleyin.
2. Reaksiyon kaplarını kapak kapaklarıyla kapatın ve rafa yerleştirin. Rafı mikrodalga fırın haznesine aktarın.
3. Aşağıdaki mikrodalga programını uygulayın: 15 dakika artışla 160 °C'ye, 10 dakika artışla 180 °C'ye, maksimum güç 900 W.
4. Isıtma sırasında reaksiyon koşullarını izleyin. Isıtma tamamlandıktan sonra reaksiyon kaplarının soğumasını bekleyin.
5. Mikrodalga fırını açın, reaksiyon kaplarını raftan çıkarın ve çeker ocakta yavaşça açın.
6. Reaksiyon kaplarının içeriğini plastik atık kaplarına atın.
7. Fazla malzeme veya kimyasalları çıkarmak için reaksiyon kaplarını ultra saf suyla durulayın.
8. Bir sonraki kullanımdan önce reaksiyon kaplarını kurutucuda 105 °C'de kurutun.
   NOT: Numunelerin asitle parçalanması için kullanılan aynı mikrodalga prosedürü (zaman, güç, sıcaklık gradyanı ve kimyasalların hacmi), reaksiyon kaplarının temizlenmesi için kullanılabilir. Alternatif olarak, reaksiyon kapları mikrodalga sistemi olmadan konsantre HNO₃ veya HCl'ye birkaç saat daldırılarak ve ultra saf su ile durulanarak temizlenebilir.

7. ICP-MS ile çok elemanlı belirleme

1. Sindirilmiş numuneleri içeren 50 mL'lik plastik santrifüj tüplerini buzdolabından alın ve oda sıcaklığına ısınmalarını bekleyin.
2. Sindirilmiş numunedeki asit konsantrasyonunu azaltmak ve numune matrisinin bileşeninin konsantrasyonunu azaltmak için numuneleri 10 faktörü ile seyreltin. Otomatik bir pipet kullanarak, numunenin 2,50 mL'sini 25 mL'lik bir cam hacimsel şişeye aktarın ve ardından işarete kadar ultra saf suyla doldurun.
3. Seyreltilmiş numuneleri 15 mL'lik plastik tüplere aktarın ve otomatik numune alma cihazında uygun konumlara yerleştirin.
4. Ölçümler için ICP-MS cihazını ( Malzeme Tablosuna bakın) hazırlayın:
   1. Havalandırmayı ve ICP-MS'ye soğutma suyu sağlayan ve bileşenlerini soğutan soğutucuyu açın.
   2. Durulama solüsyonunun (ağırlıkça %1 HNO₃) otomatik numune alma cihazından ICP-MS'ye titreşimsiz olarak sürekli akmasını sağlamak için uyumlu yazılımı kullanın.
   3. ICP-MS'ye her iki gazı da beslemek için Ar (%99,999 saflık) ve He (%99,999 saflık) gaz tüplerini açın. Yazılımdaki gaz akışını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
      NOT: Çok atomlu iyonların oluşumu nedeniyle spektral girişimler beklendiğinde He gazı ile çarpışma hücresi kullanın (örneğin, ⁴⁰Ar¹⁶O^{+ 56}Fe ile etkileşime giriyor⁺)³⁷.
   4. Plazmayı başlatın ve akort solüsyonunu kullanarak cihazı kalibre edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   5. Cihaz kalibre edildikten sonra (torç konumu, kazanç voltajı, lens voltajı, kütle/çözünürlük, darbe/analog (P/A) kalibrasyonu, veritabanı (DB) kalibrasyonu ve doğrulama), istediğiniz ölçüm yöntemini seçin ve ölçümleri gerçekleştirin.
5. Bilinmeyen numunelerle çalışırken, numunede hangi elementlerin bulunduğu ve bunların yaklaşık konsantrasyonları hakkında bilgi edinmek için yarı kantitatif bir belirleme yapın.
   NOT: Dedektörlerin bir kerede tespit edebilecekleri elementlerin konsantrasyonunun bir sınırı olduğundan, yarı kantitatif belirleme için numunelerin ek olarak seyreltilmesi tavsiye edilir. Daha düşük numune konsantrasyonları, cihaz bileşenlerinin ömrünü uzatabilir.
6. Numunelerdeki elementlerin yaklaşık konsantrasyonlarına ilişkin verileri elde ettikten sonra, yazılımda kantitatif element tayini için bir yöntem oluşturun. ICP-MS'nin çalışma koşullarını seçin (Tablo 1) ve istenen elemanları seçin (mevcut durumda Cu, Fe, Mn ve Zn). Bir kalibrasyon eğrisi (bazen analitik eğri veya çalışma eğrisi olarak anılır) oluşturmak için gereken standardın çözeltilerinin sayısını ve konsantrasyonlarını belirleyin (Tablo 1).
   NOT: Kalibrasyon eğrisi için kalibrasyon noktaları olarak en az altı farklı konsantrasyon hazırlayın.
7. Kalibrasyon eğrisi için standart çözeltiler hazırlayın. Otomatik pipetler kullanarak, aşağıdaki konsantrasyonlara sahip standart çözeltiler hazırlamak için gerekli hacimde 100 mg/L çok elemanlı standart çözeltileri 25 mL cam hacimsel şişelere pipetleyin: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L ve 50,0 μg/L. Şişeleri ağırlıkça %1 HNO₃ ile işarete kadar doldurun. Ek olarak, ağırlıkça %1 HNO₃ solüsyonunu kullanarak bir kalibrasyon boşluğu hazırlayın.
8. Hazırlanan standart ve numune çözeltilerini 15 mL'lik plastik tüplere aktarın, bunları otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve adım 7.4'te açıklanan prosedürü izleyerek cihazı çalıştırın.
9. Kalibrasyon eğrisi metodolojisini kullanarak seçilen elemanların kantitatif ölçümünü gerçekleştirin.
10. Ölçümler tamamlandıktan sonra plazmayı kapatın, Ar ve He gaz kaynaklarını kapatın, ICP-MS soğutucuyu kapatın ve havalandırma sistemini kapatın.

Homojenizasyon
Tüm numuneler, nemi ortadan kaldırmak için laboratuvar kurutucusu ile sabit bir kütleye kurutuldu. Numunenin bir desikatöre aktarılması, çevredeki ortamdan nemi bağlamadan oda sıcaklığına soğumasını sağladı. Gıda numuneleri daha sonra ince bir toz elde etmek için laboratuvar karıştırıcısı kullanılarak homojenize edildi. Elde edilen homojenize partiküller boyut olarak tekdüze ve eşit olarak dağılmıştı, bu da asit sindirimi için kullanılan alt numunelerin (daha büyük bir numuneden alınan numuneler) temsili olmasını sağlıyordu. Numuneler, daha yüksek yağ içeriği nedeniyle çıkarılması daha zor olan kurutulmuş et numunesi dışında, plastik bir spatula yardımıyla mikser kabından kolayca çıkarılabilirdi. Daha yüksek yağ içeriği, numunenin mikser kabının cam duvarlarına kısmen yapışmasını sağlamıştır. Taze, kurutulmuş ve homojenize edilmiş numunelerin karşılaştırılması Şekil 2'de verilmiştir.

Mikserde kalan tüm yiyecek parçacıklarını ortadan kaldırmak için cihazın bileşenlerinin ultra saf suyla defalarca temizlenmesi gerekiyordu.

Numunenin tartılan kütlesinin, reaksiyon kaplarında izin verilen maksimum değeri aşmamasını sağlamak önemlidir. Tartım, sabit bir sıcaklıkta analitik bir terazi kullanılarak gerçekleştirildi ve metal spatulalardan kaynaklanabilecek metallerle kontaminasyonu önlemek için plastik bir spatula kullanıldı.

Asit sindirimi
Protokolde kullanılan tüm örnekler, çeşitli miktarlarda karbonhidrat, protein ve yağ içeren gıda örnekleriydi. HNO3, H2O2ile kombinasyon halinde, bu moleküllerin sindirimi için uygundur ve diğer kimyasallara gerek yoktur. HNO3 duman oluşturduğundan kimyasallar bir çeker ocakta işlendi. Kimyasallar TFM-PTFE reaksiyon kaplarına eklendikten sonra, reaksiyon kaplarının üstüne kapak kapakları monte edildi ve olası kontaminasyonu ve analit kaybını önlemek için iyice kapatıldı. Reaksiyon kapları, mikrodalga sistemi içinde homojen mikrodalga ışınlaması sağlamak için rafa simetrik olarak dağıtıldı.

Asitle sindirim sırasında mikrodalga sisteminin kapısı kapalıydı ve protokol bitene kadar kapı açılamadı. Asitle sindirimin tüm süreci, zamanla sıcaklık değişimini gösteren cihazın ekranında izlenebilir (Şekil 7).

Asitle parçalama tamamlandıktan ve sindirilmiş numunelerin çözeltileri oda sıcaklığına soğuduktan sonra, reaksiyon kapları çeker ocakta açıldı. Mümkün olduğunca yavaş açıldılar. Basınç çok hızlı bir şekilde serbest bırakılırsa, reaksiyon karışımının küçük damlacıkları bile kaçabilir ve bu da analit kaybına neden olabilir. Reaksiyon kapları açıldığında, sarı veya sarı-turuncu bir gaz açığa çıktı (Şekil 8). Dumanların renklenmesi, daha yüksek sıcaklıklarda turuncu dumanlar oluşturanNO2'ye bağlanabilir. Reaksiyon kaplarındaki basınç artışı, gıda numunelerininHNO3 ile oksidasyonundan kaynaklanıyordu ve bu daCO2,H2O, NO, vb. gibi gazların oluşumuna neden oldu. Reaksiyon kaplarının gazı alındıktan sonra, sindirilmiş numunenin açık sarı veya renksiz bir çözeltisi reaksiyon kabında kaldı, bu da MAWD ile toplam asit sindiriminin sağlandığını gösterir. Bu, çözeltide kalan görünür parçacıkların yokluğu ile daha da doğrulandı.

Numune hazırlamanın son adımı, artık asitliği (RA) azaltmak için sindirilmiş numunelerin ultra saf su ile seyreltilmesini içeriyordu. Yüksek RA değerleri, arka plan sinyalini artırarak ölçümlere müdahale eder. Seyreltme ayrıca sıvı numunedeki metal iyonlarının konsantrasyonunu da azaltır26. Sindirilmiş numunelerin çözeltisini hacimsel şişelere aktarırken, reaksiyon kabının bileşenleri, analiti tamamen aktarmak için ultra saf su ile iyice durulandı. Ortaya çıkan bir sorun, ilgilenilen analiti içerebilen küçük ultra saf su damlalarının reaksiyon kaplarının duvarlarına yapışmasıdır. Ultra saf su ile 25 mL işaretine kadar seyreltildikten sonra, tüm numuneler renksiz hale geldi. Sindirilmiş numunelerin nihai çözeltileri, numunede bulunan metal elementler yüksek oranda çözünür nitratlar oluşturmak üzereHNO3 ile reaksiyona girdiğinden, suda çözünür tuzlar içeriyordu. Element analiz teknikleri, suda çözünür tuzları oluşturan metal iyonlarını belirleyebilir. Seyreltilmiş çözeltileri filtrelerken, herhangi bir partikül veya kirleticinin uzaklaştırılmasını sağlamak için ilk birkaç damlayı atmak önemlidir. Filtrasyondan sonra, herhangi bir sızıntıyı önlemek için çözeltiler sıkıca kapatıldı ve ardından buzdolabında saklandı.

Asitle parçalama prosedürünün ana sınırlaması, numune verimidir. MAWD sistemi bir seferde yalnızca sınırlı sayıda numuneyi sindirebilir. Ek olarak, her bir parçalama ve müteakip numune hazırlama adımının tamamlanması birkaç saat sürebilir. Ayrıca, reaksiyon kabı temizliği de zaman alıcıdır, ancak numuneler arasında çapraz kontaminasyon riskini en aza indirmek çok önemlidir.

ICP-MS ile çok elemanlı tayin
Her eleman için bir kalibrasyon eğrisi oluşturuldu. Analit konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak yoğunluğun çizilmesiyle elde edildiler (Şekil 9). Ölçülen tüm elementler için doğrusal konsantrasyon aralıkları 1.0 μg/L ila 50.0 μg/L aralığındaydı.

Her eleman için LOD ve LOQ, sırasıyla Denklem 1 ve Denklem 2 kullanılarak hesaplandı. Her iki denklemde de, sboşluğu, kalibrasyon boşluğunun çeşitli ölçümlerinin standart sapmasını temsil eder (10 tekrar)38,39, b1 ise kalibrasyon eğrisinin eğimini temsil eder.

(1)

(2)

Elde edilen LOD'ler Mn, Cu, Fe ve Zn için sırasıyla 0.5 ng/L, 2.8 ng/L, 2.8 ng/L ve 3.2 ng/L idi. Elde edilen LOQ'lar Mn, Cu, Fe ve Zn için sırasıyla 1.6 ng/L, 9.2 ng/L, 9.5 ng/L ve 10.8 ng/L idi.

Her numunenin altı kopya sindirimi gerçekleştirildi. Her numunenin üç tekrarlı sindirimi, numuneyi standart çözeltilerle dikmeden gerçekleştirildi ve tüm metodolojinin doğruluğunu (spike geri kazanım testi40) ve kesinliğini test etmek için bilinen miktarda analit standardının bir çözeltisinin eklenmesiyle üç tekrarlı çürütme gerçekleştirildi. Çürütme prosedüründen önce doğruluğun belirlenmesi için, numuneyi içeren reaksiyon kaplarına 37,5 μL 100 mg/L ICP çok elementli standart çözelti pipetlendi, bu da 10 kat seyreltilmiş çivili numunelerde 15,0 μg/L'lik bir konsantrasyon artışına neden oldu. Bu aynı zamanda ölçülen her metal iyonu için numunenin gramı başına 15.0 μg'lık bir artışa karşılık geldi. Doğruluk ve kesinlik sırasıyla Rec ve bağıl standart sapma (RSD) kullanılarak belirlendi.

Analitik bir yöntemin doğruluğu, ani artış kurtarma testi ile değerlendirilebilir. Bu amaçla, numuneye bilinen miktarda analit standardında bir çözelti eklenir ve bu çözelti daha sonra çivilenmemiş numunelerle aynı reaksiyon koşulları altında sindirilir41. Rec, Denklem 3 kullanılarak hesaplanır, burada γi, sindirimden sonra çivili numunelerin ölçülen konsantrasyonudur, γt ise analit standardının eklenen çözeltisinin artışı dikkate alınarak çivisiz numunenin belirlenen konsantrasyonunu temsil eder. i ve γt γ

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.