Yöntem makalesi

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

DOI:

10.3791/65647

⸱

23 Ağustos 2024

 ,  ,  , 
1Kindstar Global Technology Inc., 2Yongzhou Central Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör tedavisinden sonra minimal rezidüel hastalığı (MRD) izlerken, tedavi sırasında ilaç direnci mutasyonları ve dolaşımdaki tümör hücresi mutasyonları için tespit edildiğinden daha düşük tespit limiti gereksinimleri vardır. Geleneksel Sanger dizilemesi %5-%20 vahşi tip mutasyon tespitine sahiptir, bu nedenle tespit limiti ilgili gereksinimleri karşılayamaz. Bunun üstesinden geldiği bildirilen vahşi tip engelleme teknolojileri arasında engelleyici yer değiştirme amplifikasyonu (BDA), uzatılamayan kilitli nükleik asit (LNA), sıcak noktaya özgü problar (HSSP) vb. bulunur. Bu teknolojiler, vahşi türü bloke etmek veya vahşi türü tanımak için belirli oligonükleotid dizileri kullanır ve daha sonra bunu, vahşi tip amplifikasyonu önlemek ve mutant amplifikasyonu yükseltmek için diğer yöntemlerle birleştirerek yüksek hassasiyet, esneklik ve rahatlık gibi özelliklere yol açar. Bu protokol, RHOA G17V düşük frekanslı somatik mutasyonların tespitini optimize etmek için Sanger dizilimi ile birleştirilmiş vahşi tip bir bloke edici PCR olan BDA'yı kullanır ve tespit duyarlılığı %0,5'e ulaşabilir, bu da anjiyoimmünoblastik T hücreli lenfomanın MRD izlemesi için bir temel sağlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimal rezidüel hastalık (MRD), tedaviden sonra vücutta hala mevcut olan az sayıda kanser hücresidir. Sayılarının az olması nedeniyle herhangi bir fiziksel belirti veya semptoma yol açmazlar. Genellikle mikroskobik görselleştirme ve/veya kandaki anormal serum proteinlerinin izlenmesi gibi geleneksel yöntemlerle tespit edilmezler. MRD pozitif bir test sonucu, artık hastalıklı hücrelerin varlığını gösterir. Negatif bir sonuç, artık hastalıklı hücrelerin bulunmadığı anlamına gelir. Kanser tedavisi sonrası, vücutta kalan kanser hücreleri aktif hale gelebilir ve çoğalmaya başlayabilir, bu da hastalığın nüksetmesine neden olabilir. MRD'nin saptanması, tedavinin tamamen etkili olmadığının veya tedavinin eksik olduğunun göstergesidir. Tedaviden sonra MRD pozitif sonuçların bir başka nedeni, tüm kanser hücrelerinin tedaviye yanıt vermemesi veya kanser hücrelerinin kullanılan ilaçlara dirençli hale gelmesi olabilir1.

Anjiyoimmünoblastik T hücreli lenfoma (AITL), T foliküler yardımcı hücrelerden türetilen periferik T hücreli lenfomanın (PTCL) bir alt tipidir2; PTCL'nin yaklaşık %15-20'sini oluşturan en yaygın T hücreli lenfoma türüdür3. Lenfatik sistemi etkileyen bir grup ilişkili malignitedir. Köken hücresi foliküler T yardımcı hücresidir. 2016 DSÖ sınıflandırması bunu Anjiyoimmünoblastik T hücreli Lenfoma4 olarak sınıflandırır. 2022'de DSÖ, Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, anjiyoimmünoblastik tip (nTFHL-AI) ve Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, foliküler tip (nTFHL-F) ve Nodal T-foliküler yardımcı hücreli lenfoma, başka türlü belirtilmemiş (nTFHL-NOS), topluca nodüler foliküler yardımcı T hücreli lenfoma (nTFHL) olarak yeniden adlandırdı. Bu, önemli klinik ve immünofenotipik özelliklerini ve benzer T foliküler yardımcı (TFH) gen ekspresyon imzalarını ve mutantlarını tanımlamak için yapıldı. Genetik olarak, nTFHL-AI, TET2 ve DNMT3A mutasyonları yoluyla erken hematopoietik kök hücrelerde somatik mutasyonların ilerleyici kazanımı ile karakterize edilirken, RHOA ve IDH2 mutasyonları TFH tümör hücrelerinde de mevcuttur5. Birçok çalışma, RHOA G17V mutasyonunun AITL hastalarının %50-80'inde meydana geldiğini göstermiştir 6,7,8,9. RHOA geni tarafından kodlanan RHOA proteini, guanozin trifosfat (GTP) bağlanması ile aktive edilir ve guanozin difosfat (GDP) bağlanması ile inaktive edilir. Aktive edildiğinde, çeşitli efektör proteinlere bağlanabilir ve çeşitli biyolojik süreçleri düzenleyebilir. Fizyolojik olarak, RHOA, T hücresi göçüne ve polaritesine aracılık eder, timosit gelişiminde rol oynar ve pre-T hücre reseptörünün (pre-TCR) aktivasyonuna aracılık eder10. RHOA G17V mutasyonu, lenfoma patogenezinde itici bir rol oynayan bir fonksiyon kaybı mutasyonudur11. Düşük frekanslı mutasyonunun saptanması, AITL'nin MRD izlemesi için yararlıdır.

Sanger dizilemesi, bilinen ve bilinmeyen mutasyonların tespiti için altın standart olarak 40 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır. Bununla birlikte, tespit limiti sadece %5-%20'dir, bu da düşük frekanslı mutasyon tespiti12,13 için uygulamasını sınırlar. Sanger dizilemesinde, geleneksel PCR'yi vahşi bir engelleme teknolojisi olan BDA ile değiştirerek algılama hassasiyeti %0,1'e düşürülebilir14. BDA teknolojisi, mutant tipini büyütme amacına ulaşmak için vahşi tiple rekabet etmek için geleneksel primerleri tasarlarken, esas olarak mutant tipine tamamlayıcı olarak uyumsuz bir astar ekler. Astar tasarımının anahtarı, uyumsuzluk astarı ve terminal modifikasyonudur. Aynı zamanda, DNA'nın yapısal prensibine göre, iki primerin Gibbs serbest enerjisi arasındaki fark 0.8 kcal/mol ile 5 kcal/mol arasındadır. Bu teknikteki bir diğer önemli adım, vahşi tip ve bloke edici primerlerin14,15 oranını ayarlayarak vahşi tip amplifikasyonu baskılamaktır.

Şu anda, yaygın düşük frekanslı somatik mutasyon tespit teknikleri arasında PCR tabanlı alele özgü PCR (alele özgü polimeraz zincir reaksiyonu, ASPCR), refrakter primerler yardımıyla SNP'nin genotiplendirilmesi için kullanılan amplifikasyon-refrakter mutasyon sistemi PCR (amplifikasyon-refrakter mutasyon sistemi-PCR, ARMS-PCR) bulunmaktadır. Mutant ve normal aleller için primerlerin tasarlanması, su-yağ emülsiyonu damlacık teknolojisine dayanan dijital PCR gerçekleştirmek için bir yöntem olan seçici amplifikasyona ve dijital PCR'ye (Damlacık Dijital PCR, ddPCR) izin verir16. Bir numune 20.000 damlacığa bölünür ve her damlacık için şablon moleküllerinin bir PCR amplifikasyonu 1 x 10-5 hassasiyetle yapılır; bloker deplasman amplifikasyonu (BDA) aynı zamanda, yüksek oranda çoğullanmış bir ortamda SNV'lerin ve indellerin %0.01 VAF'ye kadar doğru tespiti ve kantitasyonu için kullanılan PCR tabanlı nadir bir alel zenginleştirme yöntemidir; kilitli nükleik asit teknolojisi (uzatılamayan kilitli nükleik asit, LNA), riboz halkasının Watson-Crick bağlanması için ideal konformasyonda kilitlendiği yüksek afiniteli RNA analogları sınıfıdır; sıcak noktaya özgü problar (Sıcak Noktaya Özgü Prob, HSSP), hedef primer dizisiyle örtüşür, tek bir mutasyon içerir ve qPCR 14,16,17,18 ile amplifikasyonu önlemek için C3' ucunda bir C3 ara parçası ile modifiye edilir. Dizide bir mutasyon mevcut olduğunda, HSSP hedef mutasyona rekabetçi bir şekilde bağlanır ve primerin hedef mutant diziye bağlanmasını önler, bu da dizi amplifikasyonunu durdurur; NGS (yeni nesil dizileme) tabanlı immünoglobulin yüksek verimli dizileme (igHTS) Derin Dizileme ile Kanser Kişiselleştirilmiş Profilleme (CAAP-seq), kanser hücrelerinde dolaşan DNA'yı ölçmek için kullanılan yeni nesil dizileme tabanlı bir yöntemdir (duyarlılık 1 x 10-4'tür); ve saire. Bunlar arasında, çoğu yöntem PCR'ye dayanır ve yalnızca az sayıda mutasyon bölgesini tespit edebilir ve NGS tabanlı yöntemler birden fazla bölgeyi tespit edebilir, ancak maliyeti yüksektir ve süreç karmaşıktır 14,16,17,18. qPCR'ye dayalı RHOA G17V düşük frekanslı mutasyonların tespiti hakkında raporlar vardır, ancak tespit limiti yalnızca yaklaşık %2'ye ulaşabilir19. Sanger dizilimine dayalı RHOA G17V düşük frekanslı mutasyonun tespiti hakkında bir rapor yoktur. Burada, RHOA G17V düşük frekanslı somatik mutasyonların tespitini optimize etmek için Sanger dizileme ile birleştirilmiş vahşi tip bir blok PCR olan BDA tarafından elde edilen hassasiyet artışını gösteriyoruz ve tespit duyarlılığı %0,5'e ulaşabilir. IDH2 ve JAK1 için ek veriler de sağlanmaktadır.

Bu makale, Sanger dizilemesi ile RHOA G17V düşük frekanslı algılama şemasının ayrıntılı bir protokolünü sağlar ve Sanger dizileme platformuna dayalı daha düşük frekanslı mutasyon tespitinin geliştirilmesi için bir referans sağlar. Bu yöntem, tümörlerde olası ilaca dirençli mutasyonları ve minimal kalıntıları tespit etmek ve izlemek için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Yongzhou Merkez Hastanesi tıbbi etik inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 2024022601). Katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdiler.

1. Astar tasarımı

  1. Konvansiyonel astar tasarımı: Astarları bildirilen astar tasarım kurallarına20'ye göre tasarlayın, astar tasarımı NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) ile yapılır. RHOA G17V'nin mutasyon bölgesi için, geleneksel primerlerin tasarımı için tüm referans dizileri mutasyona uğramış baz dizisidir. Tasarlanan ters amplifikasyon primerlerinin mutasyon bölgesi dizisini içerdiğinden ve primerlerin tavlama sıcaklığının yaklaşık 60 °C olduğundan emin olun.
  2. BDA astar tasarımı
    1. Yaklaşık 20-30 baz çifti (bp) uzunluğunda, 2-4 modifiye baz içeren ve modifiye edilmiş bazlar A ve T'den oluşan vahşi bloke edici astarı tasarlayın. Bloke edici primerin, mutasyon amplifikasyon primeri ile rekabet etmek için kullanılan mutasyon amplifikasyon primeri ile örtüşen 6-14 bp'ye sahip olduğundan emin olun.
    2. Primeri, yaklaşık 60 °C'ye ayarlanmış nihai tasarlanmış mutant amplifikasyon primerleri ve vahşi bloke edici primerler için bir tavlama sıcaklığına ve Gibbs serbest enerjisindeki fark 0.8-5 kcal/mol arasında olacak şekilde tasarlayın. Ayrıntılı hesaplama kuralları için literatür15'e bakın.
      NOT: Tasarlanan astarlar yukarıdaki koşulları karşılamadığında, ayar için bazlar manuel olarak eklenebilir veya çıkarılabilir. Nihai olarak tasarlanan astar listesi Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmektedir.

2. Numune hazırlama ve DNA ekstraksiyonu

NOT: Deneysel doğrulama örneklerinin tümü, insan lenfoma hastalarının periferik kan, kemik iliği veya katı tümör örneklerinden elde edilir. 10 pozitif örnek vardı: 3'ü katı tümör örnekleri, 4'ü kemik iliği örnekleri ve 3'ü periferik kan örnekleriydi. Sağlıklı insanlardan 30 negatif örnek var.

  1. Kemik iliği ve periferik kan örneklerinin çıkarılması
    1. Gereksinimlere göre ilgili tüplere 400 μL kemik iliği veya periferik kan örneği ve reaktifleri ekleyin ve üreticinin ekstraksiyon prosedürüne göre ekstrakte edin.
    2. Yeni numune tüpleri ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Numune tüplerini 1-24 arasında numaralandırın. 1.5 mL'lik tüp kapaklarını, ilgili kan alma tüplerindeki isimlerin sırasına göre numune adı ve ekstraksiyon tarihi ile işaretleyin. Bire bir yazışma kontrolü için mikrosantrifüj tüpünün yan tarafında 1-24'ü işaretleyin.
    3. Numune tüpüne 40 μL proteinaz K çözeltisi ekleyin ve 400 μL tam kan numunesi ekleyin (400 μL'den düşük hacimler için PBS ile 400 μL'ye doldurun).
    4. Numune tüpünü (1-24), pipet ucunu (pipet kapağı dahil) ve toplama tüpünü ilgili konumlara yerleştirin. DNA'yı üreticinin prosedürüne göre çıkarın.
  2. Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü (FFPE) numunelerin ekstraksiyonu
    1. Numuneleri ve reaktifleri gereksinimlere göre ilgili tüplere koyun ve üreticinin ekstraksiyon prosedürüne göre ekstrakte edin.
    2. Proteinaz K kuru tozuna, girdaba 1.1 mL proteinaz K depolama tamponu (PK çözeltisi) ekleyin ve 10 mg / mL konsantrasyonda bir proteinaz K çözeltisi elde etmek için iyice karıştırın. -20 °C'de saklayın.
    3. Proteinaz K çözeltisini çıkarın ve oda sıcaklığında tamamen eritin. Kuru termostatı çalıştırın ve sıcaklığı 55 °C'ye ayarlayın.
    4. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü alın ve üzerine numune adını yazın. 30 mg'dan az doku alın ve mikrosantrifüj tüpüne koyun. Daha sonra tüpe 500 μL Deparafin Tamponu ve 20 μL proteinaz K çözeltisi ekleyin.
    5. En az 10 saniye vorteks karıştırdıktan sonra, mikrosantrifüj tüpünü kuru bir termostata yerleştirin ve 55 °C'de 90 dakika sıcak tutun.
    6. Sıkma kolonunun filtre borusuna oturduğundan emin olun. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, sıvı ve doku dahil olmak üzere numuneyi spin kolonuna aktarın. Tüm sıvıyı filtre tüpüne santrifüjlemek için 5 dakika boyunca 16.500 x g'da santrifüjleyin.
    7. Kit ile birlikte verilen 1 numune tüpünü (kapaksız) alın ve üzerine numune adını yazın. Sıvıyı 400 μL filtre tüpünden numune tüpüne aktarın.
    8. Numune ön işlemi ve hazırlığı tamamlandıktan sonra, ilgili sarf malzemelerini ve reaktifleri ilgili konumlara yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
  3. DNA kalite kontrolü
    1. Ekstrakte edilen DNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını ölçün ve DNA konsantrasyonunun ≥ 25 ng/μL olduğundan emin olun. Her numunenin DNA konsantrasyonunu kaydedin ve sonraki tespit için hemen kullanın veya -20 °C'de dondurun.
      NOT: OD260/OD280 değerleri genellikle DNA örneklerinin saflığını test etmek için kullanılır. Normal OD260 / OD280 değeri yaklaşık 1.7-1.9'dur, bu da DNA saflığının iyi olduğunu gösterir; OD260/OD280 değeri ≤1.7 ise, protein kontaminasyonu olabileceğini gösterir; OD260/OD280 değeri ≥2.0 ise, RNA kontaminasyonu olabileceğini veya DNA'nın bozulduğunu gösterir.

3. PCR amplifikasyonu

  1. Astarların hazırlanması
    1. Astar stok çözeltisinin hazırlanması
      1. Astar kuru tozu çıkarın ve 5400-8400 x g'da 2-3 dakika santrifüjleyin. Astarın nmol değerini kontrol edin ve kapağı yavaşça açın. nM değerinin 10 katı olan karşılık gelen Çift damıtılmış su (ddH2O) hacmine sahip bir pipet kullanarak, astar tüpünün duvarı boyunca yavaşça ekleyin.
      2. Primerleri 0.1 nM / μL veya 100 μM stok çözeltisinde hazırlayın (örneğin, nM değeri 21.1'dir; buna bağlı olarak, eklenecek su 211 μL'dir). Vorteks iyice karıştırın, ardından çözeltinin her bir kuyucuğun dibine ulaştığından emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin. Tüp kapağına astar adını, konfigürasyon verilerini ve konfigürasyon kişisini yazın. İlgili stok çözeltisi depolama konumuna koyun.
    2. Astar çalışma çözeltisinin hazırlanması
      1. Temiz bir mikrosantrifüj tüpünde 5 μL ileri astar, 5 μL ters astar, 50 μL wildtype astar stok çözeltisi ve 40 μL ddH2O pipetleyin. Tekrar tekrar 2x-3x pipetleyin, karıştırmak için girdap yapın ve anında döndürün.
      2. Astarın adını, konfigürasyon tarihini ve onu yapılandıran kişiyi tüp kapağına yazın ve çalışma solüsyonunun ilgili saklama yerine koyun.
  2. PCR amplifikasyon prosedürü
    1. Her reaksiyon için 5 μL PCR amplifikasyon enzimi ana karışımı, 1 μL primer çalışma çözeltisi ve 1 μL DNA şablonu ekleyin (DNA konsantrasyonu yeterli değilse şablon giriş miktarının 400 ng'ye ulaşması gerekir; DNA hacmini artırın ve eklenen ddH2O hacmini azaltın) ve 3 μL ddH2O. Anında karıştırmak ve döndürmek için girdap.
    2. PCR amplifikasyonu için PCR reaksiyon tüpünü önceden ayarlanmış PCR cihazına koyun. PCR cihazının termal döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın ve çalıştırın:
      esnasında 95 °C esnasında 3 dakika; 30 saniye boyunca 95 °C'lik 20 döngü, 15 saniye boyunca 68 °C (döngü başına 0,5 °C azalma), 1 dakika boyunca 72 °C; 30 sn boyunca 95 °C, 15 sn için 58 °C, 1 dakika boyunca 72 °C'de 16 döngü; ve 72 °C'de 10 dakika.
  3. Hedef parçanın amplifiye olup olmadığını kontrol etmek için %2 agarozlu PCR ürünü üzerinde jel elektroforezi gerçekleştirin.
  4. PCR ürünlerinin saflaştırılması
    1. Purifikaz I ve purifikaz II'yi oda sıcaklığına getirin ve anında sıkın. PCR ürün saflaştırma reaksiyonunu şu şekilde hazırlayın: 1 μL saflık I, 0.5 μL saflık II, 3 μL PCR ürünü ve 3.5 μL ddH2O.
    2. PCR amplifikasyonu için PCR reaksiyon tüpünü önceden ayarlanmış PCR cihazına koyun. PCR cihazının termal döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın ve makineyi çalıştırın:
      37 °C'de 30 dakika, 95 °C'de 15 dakika.

4. Saflaştırmadan sonra PCR ürünlerinin dizilimi

  1. Sıralama
    1. Sıralama amplifikasyon enzimi ana karışımını, tamponu ve ddH2O'yu oda sıcaklığına getirin. Reaktif sıvılaştırıldıktan sonra anında döndürün.
    2. Dizileme reaksiyon sistemini şu şekilde hazırlayın: 1.8 μL dizileme tamponu, 0.4 μL dizileme amplifikasyon enzimi ana karışımı, 1 μL dizileme primeri, 0.8 μL saflaştırılmış PCR ürünü ve 6 μL ddH2O.
    3. PCR amplifikasyonu için PCR reaksiyon tüpünü önceden ayarlanmış PCR cihazına koyun. PCR cihazının termal döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın ve çalıştırın: 96 dakika boyunca 3 °C; 25 sn boyunca 96 °C, 15 sn için 56 °C, 4 dakika boyunca 60 °C 28 döngü.
    4. Sıralama reaksiyonu bittikten sonra ürünü PCR cihazından çıkarın. Reaksiyon ürünlerini buzdolabında, ışıktan koruyarak saklayın.
  2. Sıralama ürünlerinin saflaştırılması
    1. Manyetik boncukları iyice girdaplayın. 96 oyuklu plakaya 10 μL manyetik boncuk ve 40 μL %80 alkol ekleyin ve plakayı bir filmle kapatın.
    2. Manyetik boncukları tamamen askıya almak ve karıştırmak için manyetik boncuklar ve alkol içeren 96 oyuklu plakayı 10 saniye boyunca vorteks çalkalayıcıya yerleştirin (altta manyetik boncuk çökeltisi olup olmadığını gözlemleyin ve sıvının sızdırmazlık filmine bulaşmamasına dikkat edin). Yatay bir osilatör üzerine koyun ve 3-5 dakika (maksimum vites) titreşmesi için bir lastik bantla bağlayın.
    3. Salınım yaptıktan sonra PCR plakasını manyetik standın üzerine koyun, sıkıca bastırmaya dikkat edin. Statik adsorpsiyon için standı 3 dakika boyunca 4 °C'de tutun ve manyetik boncukların tümü duvara adsorbe edildikten sonra sızdırmazlık filmini çıkarın ve atık sıvıyı boşaltın.
    4. PCR plakasına 40 μL %80 alkol ekleyin, boncukları durulayın ve atık sıvıyı boşaltın. Plakayı emici kağıda yerleştirin ve hafifçe vurun (PCR plakasının diskten ayrılmasına izin vermeyin). 1x tekrarlayın.
    5. Hızlı bir sıkma için emici kağıdı manyetik plaka ile birlikte baş aşağı 120 x g'da santrifüje koyun.
    6. Alkolü çıkardıktan sonra manyetik boncukları içeren PCR plakasını 60 °C'de 3-5 dakika fırına koyun. Boncukları tamamen kurutun.
      NOT: Fırın yoksa tabağı 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.
    7. Kuruduktan sonra 40 μL saf su ekleyin. Sızdırmazlık filmini plakaya yerleştirin ve 3-5 saniye boyunca bir girdap çalkalayıcı üzerinde sallayın. Plakayı yatay bir çalkalayıcıya koyun, sıkıca bağlayın ve saflaştırılmış sıralama ürününü çözmek için 3-5 dakika çalkalayın.
    8. Çözünmüş dizileme ürününü 180 x g'da döndürün ve ürünü kılcal elektroforez21 kullanarak genomik analiz için kullanın (Destekleyici diskin numune kartına eklenmesi gerektiğini unutmayın).
  3. Sıralama sonuçlarının analizi
    1. Sıralama sonuçlarını yazılımdan alın. Ayrıntılı çalıştırma prosedürleri için yazılım kılavuzuna bakın. NCBI'den referans dizisini kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test numunesinin mutasyon durumunu elde etmek için test numunesinin dizisini referans dizisiyle karşılaştırın. BDA tabanlı WBT-PCR teknolojisi, yukarı ve aşağı akış primerlerinin amplifikasyon aralığındaki bilinen RHOA G17V mutasyonunu ve diğer düşük frekanslı mutasyonları tespit edebilir. Şekil 1'e bakın. IDH2 ve JAK1 olmak üzere iki ek gen de bu yöntem kullanılarak analiz edildi, sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3. Sonuçlar, bu yöntemin düşük frekanslı mutasyonları tespit etmede oldukça hassas olduğunu göstermektedir.

DNA dizileme kromatogramı; RHOA mutasyon tespit karşılaştırmasını gösteren geleneksel PCR ve WBT-PCR.
Şekil 1: RHOA için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen RHOA G17 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip RHOA G17'ye karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki sıralama sonuçlarını göstermektedir. Ortadaki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.50G>T mutasyonunun dizileme sonuçlarını göstermektedir. Alttaki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.49-50delinsTT mutasyonunun sıralama sonuçlarını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

WBT-PCR ve geleneksel PCR kromatogram karşılaştırması, c.515G>A mutasyon tespiti, IDH2 geni.
Şekil 2: IDH2 için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, yukarıdaki şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen IDH2 R172 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip IDH2 R172'ye karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki sıralama sonuçlarını göstermektedir. Üstteki resim, algılama duyarlılığı %0,5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.515G>A mutasyonunun dizileme sonuçlarını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA dizilimi karşılaştırması, WBT-PCR ve JAK1 mutasyon analizi tablosu için geleneksel PCR.
Şekil 3: JAK1 için sıralama sonucu. Yukarıdan aşağıya, yukarıdaki şekil, WBT-PCR ile amplifiye edilen JAK1 S703 bölgesinin baz mutasyonunu ve vahşi tip JAK1 S703'e karşılık gelen geleneksel PCR amplifikasyonundan sonraki dizileme sonuçlarını göstermektedir. Üstteki resim, algılama duyarlılığı% 0.5 olduğunda WBT-PCR primerleri ile amplifikasyondan sonra c.2108G>T mutasyonunun sıralama sonuçlarını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AstarAstar dizisi
RHOA-VF (İngilizce)ATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-Sanal GerçeklikGCTGAAGACTATGAGCAAGCA
RHOA-WTBAGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA
Sıralama astarıATAACCTTTTGGTGCCAGGT

Tablo 1: RHOA'nın nihai tasarlanmış astar listesi.

IDH2 R172 astar
AstarAstar dizisi
IDH2-VFCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VRTACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTBGCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
Sıralama astarıCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
JAK1 gen astarı
AstarAstar dizisi
JAK1-VFACTCTGAGGCCGAGTAGTGT
JAK1-VRCCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTBGGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
Sıralama astarıACTCTGAGGCCGAGTAGTGT

Tablo 2: IDH2 ve JAK1'in nihai tasarlanmış primer listesi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan BDA teknolojisine dayalı WTB-PCR, vahşi tiple rekabet etmek, vahşi türü bastırmak ve mutant ürünü çoğaltmak için geleneksel primerler tasarlarken, mutant tipe tamamlayıcı uyumsuz bir primer sunar. Daha sonra, WTB-PCR ürünleri mutasyon analizi için dizilendi. WTB-PCR / Sanger'in faydası basitliği ve yüksek hassasiyetidir. Bu yazıda oluşturulan tespit şemasına göre, mevcut Sanger bazlı tahlillerin çoğu, BDA yoluyla baskılayıcı primerlerle eklenebilir, böylece tespit hassasiyeti arttırılabilir. Bu makalede tanıtılan RHOA G17V mutasyonu, BDA teknolojisine dayalı WTB-PCR'den sonra Sanger dizilemesi ile dizilendi. DNA'nın giriş miktarı 400 ng'ye ulaştığında, algılama hassasiyeti %0,5'e veya hatta %0,1'e ulaşabilir. Farklı genlerin algılama duyarlılığının, DNA girdisi miktarı, gen dizisi vb. ile doğrulanması gerekir.

WTB-PCR'nin anahtarı, primerlerin tasarımıdır ve bu teknoloji yalnızca bilinen mutasyonları tespit edebilir. Bu makalede, bu teknolojinin Sanger dizilemesinde bir uygulaması açıklanmaktadır. Bu teknoloji aynı zamanda yeni nesil dizileme, kantitatif PCR vb. için de uygulanabilir ve ayrıca multipleks PCR tespitinde de kullanılabilir. Bu WTB-PCR, bu tespit yöntemlerinin alt sınırını azaltabilir ve MRD izlemesine daha iyi uygulanabilir. PCR'ye dayalı yöntemlerin çoğu yalnızca az sayıda mutasyon bölgesini tespit edebilir ve NGS tabanlı yöntemler birden fazla bölgeyi tespit edebilir, ancak maliyeti yüksektir ve süreç karmaşıktır 14,15,16,17,18. WTB-PCR, yüksek hassasiyet, düşük maliyet ve güçlü esneklik özelliklerine sahiptir, bu da onu düşük frekanslı mutasyon tespiti için ideal bir seçim haline getirir, bu da Sanger dizilemesinin algılama hassasiyetini ve MRD tespitindeki uygulamasını büyük ölçüde artırabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Kindstar Global Corporation'ın finansal desteği ve Moleküler Biyoloji Laboratuvarı liderlerinin ve ilgili meslektaşların yardımıyla tamamlanmıştır. Şirkete, liderlere ve ilgili çalışma arkadaşlarına destekleri ve yardımları için teşekkür ederiz. Bu yazı sadece bilimsel araştırma amaçlı olup, herhangi bir ticari faaliyet teşkil etmemektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Otomatik DNA çıkarıcı9001301Qiagen
DNA nükleik asit dedektörüQ32854Thermo fisher
PCR amplifikasyon kitiP4600merck
PCR cihazıC1000 TouchBiorad
proteinaz K çözeltisiD3001-2-Azymo araştırma
proteinaz K depolama tamponuD3001-2-Czymo araştırma
Sıralama amplifikasyon enzim kitiP7670-FINQiagen

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
  2. Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
  3. Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
  4. Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  5. Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
  6. Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
  7. Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).
  8. Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
  9. Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
  10. Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
  11. Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646(2019).
  12. Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  13. Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
  14. Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
  15. John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
  16. Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  17. Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
  18. Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597(2022).
  19. Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714(2014).
  20. Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  21. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

D k Frekansl MutasyonSomatik Mutasyon TespitiMinimal Rezid el Hastal kBloker Yer De i tirme AmplifikasyonuDNA EkstraksiyonuJel ElektroforeziKapiler ElektroforezAnjiyoimmunoblastik Lenfoma

İlgili makaleler