Psödotipli virüsler (PV'ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV'lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Psödotipli virüsler (PV'ler), ilgilenilen bir genin verilmesi için gen terapisinde daha iyi bilinen kullanımlarına ek olarak, konak-virüs etkileşimlerini incelemek ve serum örneklerinin nötralize edici yeteneğini test etmek için kullanılabilen moleküler araçlardır. PV'ler replikasyon kusurludur çünkü viral genom, PV'lere dahil edilmeyen farklı plazmitlere bölünmüştür. Bu güvenli ve çok yönlü sistem, biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarlarında PV'lerin kullanılmasına izin verir. Burada, burada belirtildiği gibi üç plazmide dayalı lentiviral PV'ler üretmek için genel bir metodoloji sunuyoruz: (1) enfeksiyonu izlemek için gereken raportör geni taşıyan omurga plazmidi; (2) PV'leri üretmek için gereken tüm yapısal proteinler için genleri taşıyan ambalaj plazmidi; (3) virüs tropizmini belirleyen ve konakçı hücreye viral girişe aracılık eden zarf yüzeyi glikoprotein ekspresyon plazmidi. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 Spike, replikatif olmayan SARS-CoV-2 psödotipli lentivirüslerin üretimi için kullanılan zarf glikoproteinidir.
Kısaca, paketleme hücreleri (HEK293T) standart yöntemler kullanılarak üç farklı plazmit ile birlikte transfekte edildi. 48 saat sonra, PV'leri içeren süpernatan hasat edildi, filtrelendi ve -80 °C'de depolandı. SARS-CoV-2 PV'lerin enfektivitesi, enfeksiyondan 48 saat sonra bir hedef hücre hattında raportör genin (lusiferaz) ekspresyonu incelenerek test edildi. Bağıl lüminesans birimleri (RLU'lar) için değer ne kadar yüksek olursa, enfeksiyon/transdüksiyon oranı o kadar yüksek olur. Ayrıca, enfeksiyöz PV'ler, RLU yoğunluğundaki azalma olarak ölçülen, psödovirüslerin hedef hücrelere girişinin nötralizasyon sürecini incelemek için seri olarak seyreltilmiş serum örneklerine eklendi: yüksek nötralize edici aktiviteye karşılık gelen daha düşük değerler.
Giriş
Psödotipli virüsler (PV'ler), mikrobiyolojide konak-virüs ve patojen-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılan moleküler araçlardır 1,2,3,4. PV'ler, viral genomu koruyan viral çekirdek olan bir iç kısımdan ve bir dış kısımdan, tropizmi tanımlayan virüsün yüzeyindeki zarf glikoproteinlerinden oluşur5. Bir psödovirüs, yeni viral parçacıklar oluşturmak için tüm genetik bilgiyi içermediği için hedef hücrede replikasyon yetersizdir. Tuhaf özelliklerin bu kombinasyonu, PV'leri vahşi tip bir virüse güvenli bir altern....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, Verona Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve yönergelerini takip etmektedir (onay protokolü numarası 1538). Çalışmaya katılan insan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Anti-SARS-CoV-2 aşıları alma sürecinde olan sağlık çalışanı (HCW) gönüllülerinden tam kan örnekleri toplandı. Bu örnekler, serum15'in daha sonra izolasyonu için antikoagülan içeren plastik tüplerde toplandı.
Aşağıdaki tüm işlemler, steril koşullar altında çalışan Sınıf-2 biyolojik bir başlıkta gerçekleştirilmelidir. Virüs işleme dikkatli yapılmalı ve tüm atık ürünler seyreltilmiş bir ağartma çözeltisinde n....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, anti-COVID-19 aşısı17 alan deneklerin serum/plazmasının nötralizasyon aktivitesini analiz etmek için SARS-CoV-2 PV'lerin üretimini ve bu PV'lerin aşağı akış uygulamasını açıklar. Ayrıca, bu protokol, nötralize edici yanıtın evrimini test etmek için her bir SARS-CoV-2 endişe varyantının (VOC) sözde tiplerini üretmek için uygulanabilir. COVID-19 aşılamasından sonra humoral immün yanıtın incelenmesini kolaylaştıran bu protokole rağmen, farklı serumların/plazmaların farklı virüslere karşı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Vahşi tip bir virüs kullanmak gerçek enfeksiyonu simüle etse de, lentiviral PV'ler, patojenik virüslerle çalışmak için gerekli katı güvenlik gereksinimleri olmadan viral giriş ve enfeksiyonla ilişkili mekanizmaları incelemek için daha güvenli bir seçenektir 4,20,21. PV'ler, çalışmanın amacı olan patojenik bir virüsün yüzey zarfı glikoproteini ile çevrili replikasyon kusurlu bir viral çekirdekten oluşur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Sağlık çalışanları gönüllülerinin katkılarını kabul ediyoruz. Bu proje, Mükemmellik Departmanı 2023/2027, MUR, İtalya tarafından desteklenmiştir. AR ve DZ, PRIN2022 (AB fonları; Yeni NesilEU)
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m filtre | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6 oyuklu plaka | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96 oyuklu plaka | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri | Merck | 10403892 | |
| Siyah Opak 96 kuyulu Mikroplaka | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Fetal Sığır Serumu | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prizma sürüm 7 | graphpad dotmatics | NA | El yazmasında, ticari adı 'veri analiz programı' ile değiştiriyoruz |
| HEK293T hücreleri | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 hücreleri | ATCC | CRL-3216 | HEK293T, bir lentiviral vektör ile ACE2'yi aşırı eksprese etmek için dönüştürülmüştür. |
| L-glutamin | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometre - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | El yazmasında, ticari adı 'luminometre' ile değiştiriyoruz |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific 11058021 | El yazmasında, ticari adı 'azaltılmış serum ortamı' ile değiştiriyoruz | |
| p8.91 ambalaj plazmidi | Di Genova ve ark., 2021 | Prof. Nigel Temperton'dan nazik bir hediye (ref 16.) | |
| pCSFLW muhabiri plazmid | Di Genova ve ark., 2021 | Prof. Nigel Temperton'dan nazik bir hediye (ref 16.) | |
| Penisilin / streptomisin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polietilenim, dallı (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Bu plazmit, HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike eksprese eden plazmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| üretmek için kullanıldı.steadilit artı Raportör Gen Test Sistemi | Perkin Elmer | 6066759 | El yazmasında, ticari adı 'lusiferaz okuma reaktifi' ile değiştirdik |
| . Tripsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Kaynaklar
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
