Etiketsiz amiloid yapısal karakterizasyonu için polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobu

Geçtiğimiz on yıllar boyunca, proteinlerin ve agregalarının^{biyogörüntülemesi} için çok sayıda floresan mikroskobu tekniğinde önemli bir gelişme olmasına rağmen1, numune ^2,3 içindeki yerel sıralamalarını çözmek için sadece birkaçı kullanılmıştır. Amiloid üst yapıları-sferülitlerin içsel yapısal heterojenliğini incelemek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu⁴ kullanıldı. Ayrıca, küresellikler gibi karmaşık ve yoğun paketlenmiş biyoyapılar içindeki yerel düzenin nicel olarak belirlenmesi, polarizasyona duyarlı yöntemler kullanılarak çözülebilir³. Bununla birlikte, floroforları in vivo olarak uyarmak için UV-VIS dalga boylarının kullanılması yüksek doku ışığı saçılımına yol açtığından, yüzeysel doku penetrasyonuna sahip standart floresan teknikleri sınırlıdır⁵. Ek olarak, bu tür görüntüleme genellikle spesifik floresan probların tasarlanmasını ve hedeflenen bir biyomoleküle bağlanmasını gerektirir, böylece görüntüleme yapmak için gereken iş maliyetini ve miktarını arttırır.

Son zamanlarda, bu sorunları ele almak için ekibimiz, biyolojik yapıların^etiketsiz görüntülenmesi için polarizasyona duyarlı iki foton uyarımlı floresan mikroskobunu (ps-2PFM) uyarladı ^6,7. Ps-2PFM, iki fotonlu floresan yoğunluğunun, uyarma ışınının doğrusal polarizasyon yönüne bağımlılığının ölçülmesine ve yayılan floresan^8'in polarizasyonunun analizine izin verir. Bu tekniğin uygulanması, ışık polarizasyon düzlemini kontrol etmek için standart çoklu foton mikroskobu kurulum uyarma yolunun (Şekil 1) bir yarım dalga plakası ile desteklenmesini gerektirir. Daha sonra, iki foton uyarılmış floresan yoğunluğunun uyarma lazer ışınının polarizasyonuna bağımlılığını gösteren kutupsal grafikler, iki çığ fotodiyotu tarafından toplanan sinyallerden oluşturulur, böylece floresan polarizasyonunun karşılıklı olarak dik iki bileşeni toplanır.

Son adım, dikroik aynalar veya yüksek sayısal açıklık objektifi gibi optik elemanların polarizasyon üzerindeki etkisini dikkate alan veri analizi sürecidir. İki foton işleminin doğası gereği, bu yöntem hem azaltılmış açısal foto seçimi hem de gelişmiş eksenel çözünürlük sağlar, çünkü odak düzlemi dışındaki floroforların iki foton uyarımı olasılıksal olarak sınırlıdır. Derin doku görüntüleme için yakın kızılötesi probların (NIR) in vivo görüntülenmesi için benzer yöntemlerin başarıyla uygulanabileceği de kanıtlanmıştır⁹. Ps-2PFM daha önce hücre zarları¹⁰ ve DNA 11,12'deki floroforların yanı sıra altın nanopartiküller¹³ gibi biyolojik sistemlerin standart olmayan floresan belirteçlerini görüntülemek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, tüm bu örneklerde, biyomoleküllerin organizasyonu hakkındaki bilgiler dolaylı olarak elde edildi ve bir florofor ile bir biyomolekül arasında önceden tanımlanmış bir karşılıklı oryantasyon gerektirdi.

Son makalelerimizden birinde, ps-2PFM'nin, amiloid üst yapılarının otofloresansının lokal polarizasyonunu ve küreülitlerdeki amiloid fibrillere bağlı amiloid spesifik bir boya olan Thioflavin T'den floresansın belirlenmesi için başarıyla uygulanabileceğini gösterdik⁶. Ayrıca, bir diğerinde, ps-2PFM'nin mikron altı boyut rejiminde amiloid sferülitler içindeki amiloid fibril oryantasyonunu tespit etmek için kullanılabileceğini kanıtladık ve bu, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ile ilişkilendirilerek doğrulandı⁷. Bu sonucun elde edilmesi, i) bir veya iki fotonla uyarıldığında küresel-amiloidlerin içsel otofloresansı, 450 ila 500 nm aralığında bulunan emisyon maksimumları ile içsel otofloresan ve standart floresan boyalarla karşılaştırılabilir iki foton absorpsiyon kesiti¹⁴, ii) biyolojik membranları ve DNA yapılarını etiketleyen boyaların ps-2PEF'inin nasıl uygulanabileceğini açıklamak için daha önce tanıtılan matematiksel modeller sayesinde mümkün olmuştur. Küreselitler ve bunlara bağlı boyalar tarafından sergilenen floresan ^8,11,15. Bu nedenle, analize geçmeden önce, bu konuyla ilgili ilk makalemizin hem ana metninde hem de destekleyici bilgilerinde açıklanan gerekli teoriye bakmanızı şiddetle tavsiye ederiz⁶. Burada, sığır insülin sferülitlerinin etiketsiz amiloid yapısal karakterizasyonu için ps-2PFM tekniğinin nasıl uygulanacağına ilişkin protokolü sunuyoruz.

1. Mikroskop preparatlarının tamamen büyümüş küreciklerle hazırlanması

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tüm çözeltiler, su arıtma sisteminden elde edilen deiyonize su (25 °C'de 18.2 MΩ·cm) ile hazırlandı.

1. Amiloid sferülitleri, Krebs ve ark.¹⁶ tarafından açıklanan protokole göre inkübe edin. aşağıda açıklandığı gibi bazı modifikasyonlarla.
   1. 1.5 mL'lik bir tüpte 10 mg insülin tozu tartın.
   2. Tozu, deiyonize_H2O/HCl çözeltisinin (pH 1.5) 1 mL'lik bir alikotu ile çözün.
   3. Numuneyi bantla kapatın ve 70 °C'de (0 rpm) 24 saat inkübe etmek için bir termal karıştırıcıya koyun.
      NOT: Amiloidlerin doğal (yani hidratlı) ortamlarında görüntülenmesini sağlamak ve dehidrasyona bağlı numune deformasyonunu önlemek için, mikroskop lamlarının aşağıdaki açıklamaya göre hazırlanması gerekir ( Şekil 2'de gösterilen şema).
2. Mikroskop camını suyla iyice yıkayın.
3. Slaytları metanole batırın ve tozsuz bir mendil üzerinde ortam koşullarında kurumaya bırakın.
4. Otomatik bir pipetle (adım 1.1.2) tüpten 100 μL'lik bir sferülit çözeltisi alın ve mikroskop lamının orta alanında bulunan kuyucuğa ekleyin.
5. Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek çözeltiyi bir lamel ile örtün.
6. Küreciklerin doğal çözeltisini kapatmak için otomatik bir pipet ile lamel kenarları boyunca lamel kenarları boyunca biriktirin.
   NOT: Kızaklı montajcının hem lamel hem de kızak yüzeylerine yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bunu, uçucu çözücünün (ksilen) toksisitesi nedeniyle duman başlığı altında yapın. Şekil 2'deki eke bakın.
7. Montaj parçasının sertleşmesi için mikroskop örneğini ortam koşullarında bırakın.
   NOT: Sertleştirme işlemi sıcaklığa ve neme bağlıdır ancak 12 saat içinde tamamlanmalıdır.
8. İnsülin küreciklerinin çapraz polarizörlü polarize optik mikroskop (POM) kullanarak doğru şekilde oluşup oluşmadığını kontrol edin. Şekil 3'te gösterildiği gibi, Malta haçı adı verilen parlak alanların karakteristik bir desenini arayarak numuneyi tarayın.
   NOT: Amiloid kürecikler, çekirdek-kabuk yapısına sahip heterojen bir morfoloji ile karakterize edilen küresel üst yapılar olarak tanımlanabilir. Ayrıntılı olarak, amorf bir çekirdek ve radyal olarak büyüyen amiloid fibrillerden^{oluşurlar 16}. Sferülit yapılarının anizotropik karakterinden dolayı, polarize ışıkla (örneğin kırılma yoluyla) belirgin bir şekilde etkileşime girebilirler ve çapraz polarizörlerle POM altında kolayca gözlemlenebilen fazlarını değiştirebilirler. Bu yöntem, yalnızca model benzeri bir Malta çapraz deseni ile karakterize edilen tam gelişmiş küreselleri incelemek için kullanıldı. Sonuç olarak, agregalar veya yapısal olarak çarpık küreler daha ileri araştırmalardan hariç tutulmuştur.

2. Sistemin oluşturulması ve hizalanması

NOT: Polarizasyona duyarlı iki fotonlu bir mikroskobun şematik bir gösterimi Şekil 1'de bulunabilir.

1. 690-1,080 nm aralığında çıkış dalga boyu ayarlanabilirliğine sahip bir femtosaniye lazer takın, örneğin, 80 MHz tekrarlama oranına sahip ~100 fs darbeli mod kilitli bir Ti: Safir lazer üzerinde çalışın.
2. XY mikroskobu numune düzleminde gelen ışığın polarizasyonunu kontrol etmek için kurulumun uyarma yoluna bir dönme aşamasına monte edilmiş bir yarım dalga plakası ekleyin.
3. Algılama optiğinden gelen uyarma ışınını kesmek için dikroik aynayı takın.
   NOT: Bir dikroik aynanın optik özellikleri, uyarma ışınını (numuneye) NIR dalga boyu aralığında yansıtmaya izin vermeli ve numunelerden gelen emisyona karşılık gelen dalga boyu aralığı için aynı anda şeffaf olmalıdır.
4. Seçilen bir Z için XY düzlemi içinde raster taramalar için bir piezoelektrik tarama aşaması kurun.
5. Yüksek NA daldırma objektifini monte edin, örneğin apokromatik bir yağa daldırma objektifi 100x/1.4 NA.
   NOT: Tüm kurulum bir epi-floresan modunda çalıştığından, gelen ve yayılan sinyaller aynı objektiften geçmektedir.
6. Emisyon yolunda, iki foton uyarılmış emisyonu iki ortogonal polarize bileşene (I_X ve I_Y) bölen polarize bir ışın ayırıcı ekleyin
7. İki foton sayan çığ fotodiyotunu (APD'ler), sırasıyla ışın ayırıcı kullanılarak aktarılan ve yansıtılan ışığı toplamalarına izin veren bir konfigürasyona kurun (Şekil 1).
8. Sistemin uyarma ve emisyon yoluna doğru dalga boyuna bağlı kesme filtreleri monte edin, örneğinample, 800 nm uzun geçiren bir filtre doğrudan uyarma optik yoluna ve 700 kısa geçiren filtre emisyon yoluna.
   NOT: İkinci harmonik üretimden (SHG) veya lazer ışığından kaynaklanan herhangi bir potansiyel katkının doğru emisyon filtreleri kullanılarak dışlanabilmesi için küresellikten gelen emisyon spektrumlarını analiz edin. Bu sistemin, numuneler içindeki biyomoleküllerin sıralanmasını çözmek için kullanılabilecek polarizasyona duyarlı SHG ölçümlerine de izin vermesi gerektiğini belirtmekte fayda var. Bununla birlikte, SHG sinyalinin veri analizi, daha ayrıntılı olarak Aït-Belkacem ve ^ark.17 tarafından açıklanan floresanstan farklıdır.
9. Her iki fotodiyot kullanılarak benzer sinyal yoğunlukları toplanana kadar tüm sistemi hizalayın (birçok lazerde yerleşik hizalama modunu kullanarak).
10. Yüksek NA objektifi tarafından odaklanan ve bir kamerada görüntülenen uyarma ışınının, Şekil 4A'da gösterildiği gibi eşmerkezli dairesel bir şekle sahip olup olmadığını kontrol edin.
11. Gelen lazerin numune üzerinde neden olduğu hasarı en aza indirmek için tarama süresini ve ilgili gücü ayarlayın. Örnek nokta benzeri yanma Şekil 4B'de sunulmuştur. Mikroskobun gövdesinin girişinde bulunan bir fotodiyot güç sensörüne bağlı bir dijital el tipi güç ölçer kullanarak nominal gücü ölçün.
    NOT: Biyolojik numuneler lazer aydınlatması nedeniyle kolayca yakılabilir. Bu durumda, 100 -900 μW güç aralığının (objektif merceğin odak noktasında) numune stabilitesi ve yoğun emisyon arasında mükemmel bir denge olduğu bulunmuştur.
12. Numune ölçümünden önce, optiklerin izotropik bir referans numunesi (örneğin, amorf polimerde bulunan floresein) ile hizalanma kalitesini test edin. Kalibrasyon kontrolünü gerçekleştirmek için, bir amiloid numunesi yerine izotropik bir referans kullanarak bölüm 3'te açıklanan prosedürü izleyin.
    NOT: Mikroskopi kurulumunun izotropik özelliklere sahip numune için ideal olarak ayarlandığı varsayımıyla, iki APD ile tespit edilen her iki 2P emisyon bileşeni (I_X ve I_Y) aynı yoğunlukta karakterize edilmelidir (Şekil 4C).

3. Sığır insülin sferülitlerinin ölçümü

NOT: Açıklanan tüm ps-2PF ölçümlerini gerçekleştirmek için, piezoelektrik aşamanın ve yarım dalga plakasının konumlarını kontrol eden ve her iki fotodiyottan gelen sinyali toplayan, XY taramalarının (raster taramalar) mikroskop slaytlarında seçilen alanlardan ve ayrıca belirli numune koordinatlarından kutupsal grafiklerin çizilmesine izin veren elle yazılmış yazılım kullanılmıştır. Protokole, yarım dalga plakasını döndürmek için kullanılan hem piezo aşaması hem de dönme aşaması kendi kontrolörleri veya ilgili yazılımlar kullanılarak kontrol edilebildiğinden, kullanıcıların ölçümü onsuz gerçekleştirmesine izin verecek ek notlar da eklenmiştir. Yine de, yarım dalga plakasının dönüş açısını her iki fotodiyot ile toplanan 2PEF yoğunluğu ile birleştiren bir algoritma yazılması şiddetle tavsiye edilir, çünkü bu korelasyon (kutupsal grafikler) yapısal bilgi ile sonuçlanan doğru veri analizi için çok önemlidir.

1. Numuneyi küresellerle piezoelektrik tablaya monte edin (cam sürgüyü bantla hareketsiz hale getirin). İnce bir cam kenarın (lamelli) objektife bakacak şekilde monte edildiğinden emin olun, çünkü yüksek sayısal objektifler nispeten kısa çalışma mesafeleri ile karakterize edilir.
   NOT: Yağa daldırma kullanıldığından, numune montajı ve odaklamadan önce objektife küçük bir damla mineral yağ uygulanmalıdır.
2. Mikroskop düğmelerini kullanarak XY ve Z konumlarını değiştirerek, hedefi çözeltide bulunan küreciklerden birine odaklayın, ancak küre çapları tipik olarak onlarca μm aralığında olduğundan, tüm yapının merkezi alanına odaklanın. Sırasıyla alt ve üst odak belirtileri olarak belirli sferülitin etrafındaki siyah ve beyaz haleleri arayın. "Z" eksenini bu uç noktalar arasında olacak şekilde ayarlayın.
   NOT: Yapısal kusurları olmayan izole bir numune bulmak önemlidir. Son derece küçük kürecikler, hedefin getirdiği malzeme gerilimi nedeniyle sürüklenebilirken, en büyük yapılar muhtemelen toplanır veya yüksek oranda bozulur.
3. Sferüliti gözlemlenen mikroskobik düzlemin görüş alanında ortalayın ve tüm yapının alanını kaplamak için X ve Y yönlerinde (piezostage denetleyicisinde veya yazılımında görüntülenen) kaç piezostage adımına ihtiyaç duyulduğuna bakarak XY taramasının boyutunu belirleyin.
   NOT: Sistemin, XY taramasının başlangıcı sferülitin köşelerinden birine yakın olacak ve sahnenin sıfır konumuna denk gelecek şekilde ayarlanması önerilir (X ve Y = 0)
4. Aşağıdaki tarama parametrelerini ayarlayın:
   1. Uyarma ışınının polarizasyonunu ayarlayın ve mikroskop numune düzleminin "X" ve "Y" eksenlerine karşılık gelen polarizasyonu elde etmek için yarım dalga plakasını döndürün.
      NOT: Bu, floresein gibi izotropik floresan ortamın kutupsal grafikleri ölçülerek yapılabilir. Bu tür malzemeler için, maksimum floresan yoğunluğu, uyarma ışını polarizasyonuna paraleldir; bu nedenle, yarım dalga plakasını döndürmek, Şekil 4C'deki gibi kutupsal grafiklerde X ve Y ekseni olarak da gösterilen gözlem düzleminde X ve Y ekseni ile polarizasyonu ayarlar. Tam kutup grafikleri, yarım dalga plakasının 180 ° dönüşü (uyarma ışığı polarizasyonunun 360 ° dönüşü) için her iki fotodiyotta ölçülen 2PEF yoğunluğu toplanarak ve yoğunluğu uyarma ışığı polarizasyon açısı ile ilişkilendirerek ölçülebilir. Her yarım dalga plaka açısı için emisyon yoğunluğunu ayrı ayrı ölçerek ve daha sonra veri analiz yazılımında bir kutupsal grafiğe monte ederek veya özel veya kendi kendine yazılan yazılımı kullanarak otomatik olarak manuel olarak yapılabilir.
   2. Piezostage parametrelerini ayarlayın: tarama hızı, adım ve aralık tüm sferülitin alanını kapsayacak şekilde.
      NOT: Raster taramada tüm üst yapıyı tam olarak çerçevelemek için tarama aralığı sferülit çapından daha yüksek olmalıdır. Düşük tarama hızı ve adım, kullanıcıların yüksek kaliteli görüntüler elde etmesini sağlar; ancak bu, numunenin yanmasına neden olabilir. Bu nedenle, sferülit boyutuna bağlı bir değiş tokuş gereklidir. Bu parametreler evrensel olarak uygulanamaz. Şekil 5A'da kullanılan örnek parametreler: tarama aralığı 45 x 45 μm, tarama adımı 1 μm ve tarama hızı 2 μm/s.
5. Deklanşörü açın, fotodiyotları açın ve seçilen tarama alanının her bir adımı için 2P emisyon bileşenlerini toplayın ve 2P emisyon bileşenleri - X'e ve ardından Y eksenlerine karşılık gelen polarize uyarma ışını için. İnsülin sferülitlerinin örnek iki foton uyarılmış otofloresan (2PAF) raster taramaları Şekil 5A'da sunulmuştur.
   NOT: Raster taramaların ölçülmesi, piezo sahne koordinatlarının ve toplanan emisyon bileşenleriyle ilişkilendirilmesini gerektirir, bu da seçilen alanın her bir noktasındaki yoğunluğu ölçerek ve ardından bunu bir 2D matrise veya otomatik olarak bir araya getirerek manuel olarak yapılabilir. Raster taramalar, emisyon bileşenlerinin yoğunluğunun bir toplamı olarak veya belirli bir emisyon bileşeni için ayırt edici olarak sunulabilir. Yapıya oldukça bağımlı olduklarından, küreseller içindeki yapısal bozulmalar kolayca görülebilir. Bununla birlikte, mikroskop aşamasının hareketi nedeniyle, bazı numuneler görüş alanından kayabilir. Bu nedenle, görüntülerin eserler için taranması gerekir. Taramadan önce ve sonra sferülitin konumunu kontrol etmek gerekir.
6. Numune üzerindeki belirli noktadan tam polarizasyon analizi yapmak için, uyarma ışınını kapatın.
7. Daha sonra, μm altı çözünürlükle moleküllerin oryantasyonu hakkında bilginin gerekli olduğu sferülit üzerinde seçilen konuma karşılık gelen belirli piezostage koordinatlarını seçin.
8. Piezoelektrik aşamayı, görüş alanını belirtilen (X, Y) ortalayacak şekilde ayarlayın.
9. Uyarma ışınını açın ve yarım dalga plakasının dönüşünü (360° dönüş) açarak tam (180°) polarizasyon analizi ve emisyon gerçekleştirin. 2PF Ix ve Iy bileşenlerini kutupsal grafik şeklinde sunun ( Şekil 5B'de gösterildiği gibi).
   NOT: Bu adım, yeterli miktarda veri toplamak için numunenin farklı konumlarında tekrarlanabilir.

4. Sığır insülin sferülitleri içindeki lokal fibril düzeninin belirlenmesi

NOT: Veri analizine bağlı tüm sayısal hesaplamalar Python programlama dili kullanılarak ve NumPy ve SciPy kütüphanelerinde bulunan fonksiyonlara dayalı olarak yapılmıştır. Verilerin çizilmesi için Matplotlib kitaplığı gerekir. Tüm hesaplamalar, Obstarczyk ve ^ark.6 tarafından hazırlanan makalelerden birinde destekleyici bilgilerde sunulan formüllere dayanmaktadır.

1. Gelen ışık polarizasyonunun seçilen bir yönü ile moleküllerin belirtilen dağılımı için uyarılan iki fotonlu floresan yoğunluğunun simüle edilmesi ( ile gösterilir) α)
   NOT: Sunulan formüller, bir floroforun paralel absorpsiyon ve emisyon dipol momentleri varsayımına dayanmaktadır. Diğer durumların tartışılması için (örneğin, absorpsiyon ve emisyon dipol momentlerinin farklı yönleri, floroforlar arasındaki enerji transferi), Le Floc'h ve arkadaşlarının makalesine bakın⁸.
   1. Bir kuruluma monte edilmiş dikroik aynanın neden olduğu polarizasyon, karıştırma ve depolarizasyon etkileri ile elektrik alanın değişimini açıklayan parametreleri bulun:
      1. γ , dikroik bir aynadan gelen ışığın yansıtıcılığı ile polarize ışık arasındaki genlik faktörünü temsil eder.
      2. δ , polarize ışık arasındaki faz kaymasını (eliptiklik) temsil eder.
         NOT: Bu iki parametrenin doğru bir şekilde tanımlanması, ölçülen kutupsal grafiklerin^11,18 şekli üzerindeki güçlü etkileri nedeniyle başarılı yapısal karakterizasyon için çok önemlidir. Sunulan sistem söz konusu olduğunda, her iki parametre de bir sistemde uygulanan dikroik aynanın elipsometri ölçümleri sırasında belirlenmiştir.
   2. Denklemleri (1-5) kullanarak ps-TPFM ölçümü sırasında ölçülen her açının X ve Y eksenlerinde yayılan gelen elektrik alan vektörlerini hesaplayın.
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      NOT Yoğunluk 360°'nin tamamı boyunca adım 1° ile ölçülürse, 360°'nin tamamı için elektrik alan vektörlerini hesaplayın. Tüm açılar radyan cinsinden olmalıdır. ρ parametresi, simüle edilen elektrik alanının ω optik frekansına bağlıdır (ρ=ω·t) ve ps-TPFM ölçümü sırasında ölçülen her açı için X ve Y ekseninde yayılan gelen elektrik alan vektörlerinin hesaplamaları sırasında 0'dan 2π'ye α entegre olarak kullanılır.
   3. Denklemlere (6-8) göre bir kartezyen sistemin üç ekseni yönünde geçiş dipol momentleri için fonksiyonları tanımlayın:
      (6)
      (7) buyurmuştur.
      (8)
      NOT: φ, XY numune çerçevesindeki amiloid fibril uzun ekseninin oryantasyon açısıdır. θ ve φ açıları, bir floroforun geçiş dipol moment oryantasyonunu tanımlamak için kullanılan polar ve azimut açılarıdır.
   4. Adım 4.1.3'te tanımlanan işlevleri kullanın. J_x (Φ,θ,φ) ve J_Y(Φ,θ,φ) fonksiyonlarını tanımlamak, bunlar yüksek sayısal açıklık objektifi ile sıkı ışık odaklamasının denklemleri kullanarak X ve Y yönünde floresan polarizasyon algılamasına katkısını açıklar (9, 10).
      (9) buyurmuştur.
      (10) buyurmuştur.
      NOT: K₁, K₂, K₃ faktörleri, ps-TPFM ölçümü sırasında kullanılan mikroskop objektifi ile ilgilidir. Bu deneylerde, apokromatik bir yağa daldırma objektifi 100x/1.4 NA kullanıldı ve K₁, K₂, K₃ faktörleri sırasıyla 2.945, 0.069 ve 1.016 idi.
   5. Değişken kalınlıkta ΔΨ olan bir florofor konisinin Ψ yarı açıklığına bağlı olarak moleküler açısal dağılım olan f(Ω) için bir fonksiyon tanımlayın; Denklem (11)'i kullanın. Amiloid fibril ile ilgili her üç açının grafiksel gösterimi Şekil 6'da sunulmuştur.
      (11) buyurmuştur.
      NOT: Üssü yazarken dikkatli olun - 2'nin kuvveti fonksiyonun tamamı üzerinde değil, fonksiyon argümanı üzerinde çalışır!
   6. Tüm f_WWIJKL faktörlerini denklemlerde (12-21) gösterildiği gibi tanımlayın.
      (12)
      (13) buyurmuştur.
      (14) buyurmuştur.
      (15) buyurmuştur.
      (16) buyurmuştur.
      (17) buyurmuştur.
      (18) buyurmuştur.
      (19) buyurmuştur.
      (20) buyurmuştur.
      (21) buyurmuştur.
   7. Denklemleri (22, 23) kullanarak iki foton uyarılmış floresan yoğunluklarını ve ölçülen her açı için (madde 4.1.2'deki gibi) hesaplayın.
      = (22)
      = (23)
   8. Aşağıdaki değişken değerlerini kullanarak simülasyonun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol edin (Şekil 7'deki göstergeye yerleştirilmiştir) ve elde edilen sonuçları Şekil 7A-C ile karşılaştırın.
      NOT: Tüm dereceler radyan cinsinden yazılmalıdır.
2. Simüle edilen yoğunlukları, ps-2PFM ölçümleri sırasında toplanan sığır insülin sferülitlerinin iki foton uyarımlı otofloresan yoğunluğuna sığdırın.
   NOT: ps-2PFM ölçümlerine dayalı olarak sferülit yapısının çözülmesi, iki foton uyarılmış floresansın teorik yoğunluğunu simüle etmek için protokolde yazılan denklemlerin kullanılmasını ve moleküler floroforun sıralanmasına bağlı tüm parametrelerin uymasını gerektirir. XY mikroskop numunesindeki fibrilin dönüşünü tanımlayan bir açı olan Φ ve ΔΨ'nin çeşitli değerleri üzerinde, ölçüm sırasında toplanan normalleştirilmiş iki foton uyarılmış floresan sinyal yoğunluğu ile simüle edilen normalleştirilmiş yoğunluklar arasında mümkün olan en yüksek ^R2 katsayısına ulaşana kadar sabit Ψ için filamentlerdeki moleküler rotasyonlar nedeniyle emisyon dipolünün konik dağılımının sapmaları üzerinde çoklu yinelemeler gerektirir. Protokolün 4.1 adımı.
   1. Ψ yarım açısını belirleyin.
      NOT: Sığır insülin kürecikleri için Ψ = 29°^6'ya eşit olmalıdır.
   2. Uydurma iş akışı:
      1. 0° ile 180° arasında Φ değerini seçin ( Şekil 8A ve 8B'de Φ = sırasıyla 16° ve 127°).
      2. ΔΨ değerini 0° ila 90° arasında seçin (Şekil 8A,B, ΔΨ = 24° ve 1°'de sırasıyla).
      3. Seçilen Φ ve ΔΨ değerlerini kullanarak ölçülen tüm θ açı aralığı için hesaplayın (denklem 22) ve (denklem 23).
      4. Simülasyonlar sırasında hesaplanan yoğunlukları karşılaştırın (her ikisi de maksimum değere normalleştirilmiştir.
      5. Hesapla ) normalleştirilmiş yoğunlukları ile
      6. Hesaplayın ve (her ikisi de maksimum değere normalize edilmiş) ps-2PFM ölçümü sırasında ölçülmüştür.
         NOT: Sunulan deneylerde NumPy Python kütüphanesinden "corrcoef" fonksiyonu kullanılarak Pearson momentler çarpımı korelasyon katsayıları hesaplanmıştır.
   3. Sonunda, Şekil 8'de gösterilene benzer şekilde, simüle edilmiş yoğunluklar ve ölçülen sinyal arasında en yüksek korelasyon katsayılarına ve yakınsamaya yol açan Φ ve ΔΨ değerlerini seçin.

Sunulan protokol, ps-2PFM ile test için amiloid üst yapıların hazırlanması, mikroskobik sistemin oluşturulması ve uygun numunenin ölçümleri yoluyla adım adım rehberlik sağlar. Bununla birlikte, son ölçüm setinden önce, APD'leri izotropik bir referansla düzgün bir şekilde hizalamak hayati önem taşır, bu da her iki dedektörde de benzer şekil ve yoğunlukta simetrik bir sinyalin toplanmasıyla sonuçlanmalıdır (Şekil 4C). X ve Y eksenlerinde dedektörlerde ölçülen yoğunluklar arasındaki minimum farklar bile, daha sonraki ölçümlerde ve özellikle analiz sırasında uygun bir düzeltme faktörü olarak dikkate alınmalıdır. Montajdan sonra, Şekil 2B'deki gibi POM üzerinde karakteristik bir Malta haçı veren tek kürecikler içeren numune ve 2PFM'lik bir raster taraması gerçekleştirildikten sonra, görüntü, kürelerin 6,7 ve farklı organize biyomoleküllerin 11,12 bildirilen 2PFM raster taramalarıyla tutarlı olan Şekil 5A'da gösterilene benzer görünmelidir . Floresan sinyal yoğunluğunun büyük ölçüde uyarma ışınının polarizasyonuna bağlı olduğu gerçeğiyle ilgili olarak, en yüksek parlaklığa sahip eksenin konumunda bazı değişiklikler gözlemlenebilir. Bu nedenle, yarım dalga plakasının hangi konumunun numunenin X (Şekil 5A, üst) ve Y (Şekil 5A, alt) eksenleri boyunca uyarılmasına karşılık geldiğini doğrulamak gerekir. Seçilen farklı noktalardan tam bir polarizasyon analizi yaparken kutupsal grafiklerin nasıl değiştiğini de belirtmekte fayda var. Küreselin dışında, kutupsal grafik bir artefaktlar ve rastgele sinyal gürültüsü artışları koleksiyonuna benziyor (Şekil 5B, I). Böyle bir grafik aynı zamanda sferülitin ölçümler arasındaki kaymasını gösterebilir ve başka bir 2PF raster taraması ile tüm yapının yeni koordinatlarının bulunmasını gerektirebilir. X ve Y eksenleri boyunca insülin sferülitinin yüksek dereceli konumlarından uygun şekilde ölçülen polar grafikler sırasıyla Şekil 5B II ve III'te gösterilmektedir. Seçilen noktadan7 ölçülen floroforların yerel oryantasyonuna ve organizasyonuna bağlı olarak farklı şekil ve geometrilere sahip olabilirler.

Protokolün son adımı, XY düzlemindeki amiloid liflerinin oryantasyonunu Φ, ilişkili florofor geçici dipol momentleri Ψ ve bunların sapmalarını birleştiren matematiksel bir modele dayalı bir algoritma kullanılarak elde edilen verilerin analizine odaklanmıştır(Şekil 6) yoğunluk ve iki foton kaynaklı floresan ile. Protokolde sunulan doğru şekilde uygulanan işlevler, uygun giriş verilerini girdikten sonra (protokol adımı 4.9), Şekil 7'de sunulanlarla aynı kutupsal grafikler üretmelidir. Herhangi bir sapma - farklı veri oryantasyonu, yoğunlukları veya simüle edilmiş şekiller ve -koddaki hataları gösterir. Model çalışırsa, simüle edilmiş verileri ps-2PFM ölçümünden elde edilen gerçek verilere uyduran protokolün son adımına geçilebilir. En yüksek korelasyon katsayılarına sahip seçilen Φ ve ΔΨ değerleri ve simüle edilen yoğunluklar ile ölçülen sinyal arasındaki yakınsama, Şekil 8'de gösterildiği gibi benzer görüntülere yol açmalıdır. Ve 'nin genel oryantasyonuna ve şekline mümkün olan en iyi uyum ve fonksiyonlar olmalı ve Φ ve ΔΨ değerleri, sferülit üzerinde ölçülen noktadaki fibrillerin ve floroforların yerel oryantasyonuna karşılık gelmelidir. DNA11 gibi diğer biyomoleküllerin yerel organizasyonunun belirlenmesi için de benzer modeller ve uydurma yöntemleri kullanılabilir.

Şekil 1: İki fotonlu polarizasyona duyarlı mikroskopi kurulumu. Sığır insülin küresellerinin polarizasyona duyarlı iki foton uyarılmış floresan ölçümleri için kullanılan iki fotonlu mikroskop kurulumunu gösteren şema. Yatay ve dikey olarak polarize (mikroskop numune düzlemine) iki foton uyarılmış emisyon bileşenleri sırasıyla IX ve IY ile gösterilir. Kısaltmalar: SP = örnek düzlem; O = amaç; DM = dikroik ayna; λ/2 = yarım dalga plakası; LPF = uzun geçiren filtre; BE = ışın genişletici; P = Glan polarizör; Ti: Sa = Titan: safir lazer ışık kaynağı; M = Ayna; SPF = kısa geçiren filtre; PBS = polarizasyon ışını ayırıcı; L = optik lens; APD = çığ fotodiyotu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Slayt hazırlığını/fotoğrafını gösteren şema. (A) Mühürlü numune hazırlığını gösteren şema; (B) Numune sızdırmazlığı için müteakip adımların fotoğrafları. I: bir kuyucuk ile mikroskopi lamı üzerindeki sferülit çözeltisinin 100 μL'lik bir alikotu, II: çözeltinin üzerine bırakılan lamel III: birikmiş polimerden (mountant) oluşan sıkı conta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Polarize ışık mikroskobu altında insülin küreciklerinin kalite kontrolü. (A1,B1) Parlak alan modunun yanı sıra (A2,B2) çapraz polarizörler. Karakteristik Malta çapraz deseni, çapraz polarizörlerle çekilen ilgili görüntülerde gözlemlenebilir. (A) Yapısal bozulmalara sahip sferülit agregaları, (B) yüksek kaliteli izole sferülit. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: ps-2PFM sisteminin hizalamasının test edilmesi. (A) (A1) olmadan ve (A2) dikroik ayna ile görüldüğü şekliyle floresein floresansının eşmerkezli bulanık görüntüsü, (B) x ve y yönleri boyunca seçilen noktalarda uzamış polarizasyon analizi nedeniyle ortaya çıkan yanmış deliklere sahip fotohasarlı küresel, (C) izotropik bir numune (floresein çözeltisi) için kayıtlı olan gelen ışık polarizasyon açısına bağlı olarak iki foton uyarılmış emisyon bileşenleri. ve sırasıyla X ve Y emisyon polarizasyon eksenini ölçen çığ fotodiyotları tarafından ölçülen emisyon bileşenlerini belirtir. Ölçek çubukları = 5 μm (A1,A2), 10 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Etiketsiz insülin sferülitinden örnek 2PFM raster taramaları ve kutupsal grafikler. (A) Etiketsiz insülin küreciklerinin 2PF yoğunluk raster taramaları: uyarma ışığının polarizasyonu: (A1) yatay polarizasyon, (A2) dikey polarizasyon ve emisyon beyaz oklarla gösterilir ve ek, çapraz polarizörlü standart bir polarize ışık mikroskobu altında görüntülenen aynı sferüliti gösterir. (B) A1 taramasında gösterilen üç noktadan türetilen kutupsal grafikler (B1, I; B2, II; B3, III). Ixve Iy, sırasıyla X ve Y emisyon polarizasyon eksenini ölçen çığ fotodiyotları tarafından ölçülen emisyon bileşenlerini gösterir. Kısaltma: 2PF = iki fotonlu floresan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Boyanın emisyon dipolünün (yarım açı, Ψ) uzun fibril eksenine göre konik dağılımı. Kesikli çizgi uzun fibril ekseni gösterir. Fibrilin XY mikroskobu numune düzlemindeki dönüşü açı ile tanımlanır. Filamentlerdeki moleküler rotasyonlardan kaynaklanan Ψ sapmaları ΔΨ ile tanımlanır. Bu rakam Obstarczyk ve ark.6'dan alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Polarize iki foton uyarılmış floresansın simüle edilmiş yoğunluğu. (A) Φ = 1°, Ψ = 1°, ΔΨ = 1° için hesaplanan floresan; (b) φ = 1°, ψ = 30°, δψ = 1°; (C) Φ = 1°, Ψ = 30°, ΔΨ = 60°. Kırmızı, mavi ve sarı çizgiler sırasıyla , ve + işaretlerine karşılık gelir. Φ açısı, fibrilin XY mikroskobu numune düzlemindeki dönüşünü, Ψ - emisyon dipolünün konik dağılımını ve filamentlerdeki moleküler rotasyonlar nedeniyle Ψ'nin Δ Ψ- sapmalarını tanımlar. Diğer tüm parametreler her durumda aynıydı: K1 = 2.945, K2 = 0.069, K3 = 1.016, γ = 0.01 ve δ = 0.98845. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Deneysel veri kümelerinin kutupsal grafikleri. (A,B) Sığır insülin sferülitlerinin ps-TPFM ölçümleri sırasında toplanan iki deneysel veri setinin sığdırılmasından sonra örnek kutupsal grafikler. X ve Y emisyon polarizasyon ekseni için ölçülen ve iki foton uyarılmış emisyon bileşenleri sırasıyla kırmızı ve mavi noktalarla sunulur; bu arada, düz çizgiler, X ve Y emisyon polarizasyon ekseni için karşılık gelen simüle edilmiş iki foton uyarılmış floresan emisyon bileşenlerini sunar ve . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.