İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Süspansiyonda Böbrek Organoidlerinin Üretilmesi

Böbrek, fonksiyonel birimine bağlı olarak fizyolojik homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar. Atık ürünleri salgılayan nefronlar, vücut sıvılarının bileşimini düzenleyebilir. Kalıtsal mutasyonların veya diğer yüksek risk faktörlerinin neden olduğu kronik böbrek hastalığı (KBH), sonunda son dönem böbrek hastalığına (SDBH) ^{ilerleyecektir1,2}. ESKD, görünüşe göre nefronların sınırlı rejenerasyon kapasitesinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, renal replasman tedavisi gereklidir. İnsan iPSC'lerinin yönlendirilmiş farklılaşması, böbrek gelişimini incelemek, hastaya özgü hastalıkları modellemek ve nefrotoksik ilaç taraması yapmak için kullanılabilen hastaya özgü 3D böbrek organoidlerinin in vitro olarak üretilmesini sağlar ^3,4.

Embriyonik gelişim sırasında böbrekler, ilkel çizgiden (PS) farklılaşan ara mezodermden (IM) kaynaklanır. Klasik WNT sinyal yolu, FGF (FGF9, FGF20) ve BMP'nin (JNK aracılığıyla Bmp7 sinyali) koordineli katılımı ile IM'nin ek farklılaşmasına neden ^{olabilir5,6,7}. Nefrik progenitör hücrelerin (NPC) iki önemli hücre popülasyonunu üretirler: üreter tomurcuğu (UB) ve metanefrik mezenşim (MM), sırasıyla toplama kanallarını ve nefronu oluşturur ^8,9. Her nefron, proksimal ve distal tübüller gibi glomerüler ve tübüler segmentlerden ve Henle^10,11 döngüsünden oluşur. Yukarıda bahsedilen teoriye göre, şu anda yayınlanmış protokoller, böbrek organoidlerini indüklemek için sinyal kaskadlarını ve büyüme faktörü stimülasyonunu taklit eder ^5,12.

Son birkaç yılda, insan iPSC'lerini böbrek organoidlerine^ayırmak için birçok protokol geliştirilmiştir 5,6,7,12. Takasato ve ^ark.7, FGF9 ile değiştirilmeden önce CHIR (WNT agonisti) tedavisinin süresini optimize etti. Protokollerine göre, 4 gün boyunca CHIR maruziyeti, ardından 3 gün boyunca FGF9, iPSC'lerden IM'yi indüklemenin en etkili yoludur. Transwell filtreleri, prosedürlerinde kültür formatı olarak kullanıldı; Ancak, bu yöntem yeni başlayanlar için zordur. Bu nedenle, Kumar ve ^ark.13 kültür formatını değiştirmeye çalıştı ve kültürü askıya almayı seçti. Yapışık hücreleri, nefron benzeri yapılar içeren embriyoid cisimlere (EB'ler) bir araya gelmelerine yardımcı olmak için düşük yapışkan plakalarda tohumlama için 7. günde ayırdılar. Bununla birlikte, bu yöntemlerin toplu etkisi, özellikle farklı iPSC'lerde belirgindi. Ek olarak, farklı literatürde CHIR konsantrasyonunun 7 μM ile 12 μM arasında değiştiği bildirilmiştir 5,13,14.

Hücre yoğunluğu ve CHIR konsantrasyonunun farklı iPSC'lerde organoid oluşumunu etkileyebileceğini tahmin ettik ve bu, deneylerimizde defalarca doğrulandı. Mevcut protokol, Kumar ve ^ark.13'ün çalışma yöntemini biraz değiştirmiş ve kullanıcılara adım adım bir prosedür sağlamıştır. Yaklaşımın programı ve şeması Şekil 1'de gösterilmektedir.

Bu çalışma için kullanılan iPSC'ler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir. Hücreler, ticari olarak temin edilebilen bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde mTeSR ortamı ile muhafaza edildi (bkz. Malzeme Tablosu). Tablo 1 , çalışmada kullanılan tüm ortam bileşimlerini içermektedir.

1. Farklılaşma ve posterior ilkel çizgiyi (PS) indüklemek için iPSC'lerin kaplanması

1. Membran matris kaplı 6 oyuklu plaka üzerindeki iPSC'leri 2 mL DPBS ile yıkayın. DPBS'yi bir pipet kullanarak aspire edin.
2. iPSC'leri ayırmak için piyasada bulunan hücre ayırma solüsyonundan 1 mL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
3. iPSC'lere 1 mL mTeSR ekleyin ve hücrelerin plastik yüzeyden kalktığından emin olun.
4. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
5. Membran matrisi ile kaplanmış 24 oyuklu veya 6 oyuklu bir plakaya bir dizi hücre yoğunluğu tohumlayın ve 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile takviye edilmiş mTeSR ile kültür edin (bkz. Onları gece boyunca 37 ° C'lik bir CO₂ inkübatörde kültürleyin.
   NOT: PS'yi indüklemek için, optimal CHIR99021 konsantrasyonu ve uygun hücre yoğunlukları farklı iPSC hatlarından farklılık gösterir. Bir dizi yoğunluk (örneğin, santimetre kare başına 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 10³ tek hücre) ve 7 μM-12 μM arasında CHIR99021 bir konsantrasyon aralığı tohumlayın. Her yoğunluğun ve her CHIR'nin farklılaşmasını aynı gün başlatın. 24 oyuklu bir plakada optimum CHIR99021 konsantrasyonunu ve uygun hücre yoğunluklarını bulun ve ardından kültürü 6 oyuklu plakalarda genişletin. Burada 6 oyuklu bir plakaya dayalı bir protokol sunuyoruz.
6. Ertesi gün, mTeSR'yi aspire edin ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.
7. 2 mL evre I ortamı (8-12 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) ekleyin (Tablo 1), Gün 0 olarak bakın.
8. Onları 4 gün boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin, her iki günde bir I. aşama ortamını yenileyin.

2. Nefrojenik ara mezodermin (IM) indüklenmesi

1. 4. Günde, aşama I ortamını çıkarın ve 2 mL DPBS ile yıkayın.
2. Hücrelere 2 mL evre II besiyeri ekleyin (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı) (Tablo 1).
3. Bunları 37 °C'lik bir inkübatörde kültürleyin ve 7. güne kadar her 2 günde bir besiyerini yenileyin.

3. Süspansiyon kültüründe böbrek organoidlerinin üretilmesi

NOT: 0. günden 7. güne kadar olan gözlem süresi boyunca hücrelerin durumu kritiktir. Hücreler başarılı bir genişleme sergiler ve önemli hücre kalıntıları olmadan yığılırsa, bir sonraki aşamaya geçmeye hazır olduğunu gösteren ara mezodermin (IM) başarılı bir şekilde türetildiğini gösterir. Bununla birlikte, hücreler ilk apoptoz belirtileri gösteriyorsa, ardından nekroz veya kırılma gösteriyorsa, uygun olmayan konsantrasyonlarda CHIR99021 veya hücre yoğunluğunun göstergesi olabilir.

1. 7. Günde, evre II ortamını çıkarın ve hücreleri 2 mL DPBS ile yıkayın.
2. Her oyuğa 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreler faz kontrastı altında kırılana kadar 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
3. Hücrelere 1 mL aşama II ortamı pipetleyin, karıştırın ve hücrelerin yüzeyden kalktığından emin olun.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 2 mL aşama III ortamında (200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL Heparin ve 1 μM CHIR99021 içeren kök hücre farklılaşma ortamı% 0.1 Metilselüloz (MC),% 0.1 Polivinilalkol (PVA)) içeren 10 μM Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiştir (bkz. Yavaşça karıştırın.
6. Hücre süspansiyonunu ve tohumu 1:3 oranında 6 oyuklu düşük yapışma plakasına karıştırın. Plakayı 37 °C ve %5_CO2'de bir inkübatörde bir orbital çalkalayıcıya (CO₂ dirençli, 60 rpm'de dönen) koyun.
7. 24 saat sonra, Rho kinaz inhibitörünü (Y-27632) çıkarın ve aşama III ortamı ekleyin (200 ng / mL FGF9, 1 μg / mL Heparin, 1 μM CHIR99021,% 0.1 MC,% 0.1 PVA ile kök hücre farklılaşma ortamı takviyesi). 2 gün boyunca kültür. Aşağıdaki adımları izleyerek süspansiyon kültüründeki ortamı değiştirin:
   1. 1 mL'lik pipetin ucunu aseptik makasla kesin.
   2. Organoidleri plakanın ortasına yerleştirmek için 6 oyuklu plakayı hafifçe sallayın.
   3. Organoidleri hazırlanan pipetlerle 15 mL'lik bir tüpe aspire edin ve 5 dakika bekletin.
   4. Süpernatanı aspire edin ve organoidleri tüpün dibinde bırakın.
   5. Organoidleri yeniden süspanse etmek için taze ortamı ekleyin ve 6 oyuklu düşük yapışma plakasına geri koyun.
8. Düşük yapışma plakasını inkübatörde 60 rpm'de sallamaya devam edin. Aşama III ortamını 12. güne kadar her iki günde bir değiştirin.
9. 12. Günde, ortamı aşama IV ortamına değiştirin (% 0.1 MC ve% 0.1 PVA içeren kök hücre farklılaşma ortamı).
10. Ortamı 25. güne kadar iki günde bir değiştirin. Organoidler, 12-25. günler arasında yavaş yavaş olgun nefron yapılarına dönüşebilir.

4. Böbrek organoidlerinin immünofloresan boyaması

1. Böbrek organoidlerini 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 mL PBS ile yıkayın.
2. 5-10 dakika bekledikten sonra, böbrek organoidlerini taze hazırlanmış% 2 PFA'da 20 ° C'de 4 dakika sabitleyin.
3. PFA'yı çıkarın ve organoidleri %0,3 Triton X-100 (%0,3 PBST) içeren 1 mL PBS ile yıkayın, 8 dakika boyunca bir çalkalayıcı (60 rpm'yi geçmeyen bir dönüş hızıyla) üzerinde eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın.
   NOT: Organoidler, 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de% 0.3 PBST'de saklanabilir.
4. Sabit organoidleri PBST'de (bloke edici tampon) %10 eşek serumu ile (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Birincil antikorları ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) 1:300 oranında bir bloke edici tampon içinde seyreltin.
6. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de ajitasyon ile birincil antikorlarla inkübe edin.
   NOT: Glomerüllerin ve tübüllerin bir organoid üzerinde aynı anda boyanabildiğinden emin olun.
7. Organoidleri 1 mL% 0.3 PBST ile yıkayın, bir çalkalayıcı üzerinde (dönüş hızı 60 rpm'yi geçmeyen bir devir ile) 8 dakika boyunca eşit şekilde çalkalayın, 5 dakika bekletin ve ardından süpernatanı çıkarın. Üç kez tekrarlayın.
8. Organoidleri ikincil antikorlar ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) ve DAPI ile gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin. Ardından 4.7 adımını tekrarlayın.
   NOT: Hem ikincil antikor hem de DAPI, bloke edici çözelti, ikincil antikor (1:400) ve DAPI (1:1000) içinde seyreltilir.
9. Boyamadan sonra, organoidleri metanol ile (her biri 5 dakika boyunca %25, %50, %75 ve %100) dehidre edin, ardından benzil alkol ve benzil benzoat (BABB, 1:2 oranı) ile süzün.
10. Temizlenmiş organoidleri cam tabanlı bir tabak üzerine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları konfokal mikroskopi ile inceleyin.
    NOT: Görüntüleme yaparken, cam kabın altındaki Petri kabını seçin ve süzüntü verirken, kabın altını nemli tutmak için BABB'ı doğrudan Petri kabına koyun.

5. İn vitro dekstran alım testi

1. 25. Günde, organoidleri 100 μg / mL floresan etiketli dekstran ile inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde.
2. 4 saat sonra, yeni bir ortama geçin ve geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanarak canlı hücre kültürü görüntülerini yakalayın.

Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması bildirmediler.